Abstract
目的
探讨SCNlA基因rs3812718基因多态性与全面性癫癎伴热性惊厥附加症（GEFS+）的相关性，以期为GEFS+的诊治提供潜在的分子靶点。
方法
采用MassARRAY阵列基因分析系统的iPLEX技术检测50例GEFS+患者和50例健康对照的SCNlA基因rs3812718位点多态性、基因型频率、等位基因频率。
结果
将SCN1A基因rs3812718位点的CC、CT、TT基因型频率在GEFS+组和对照组进行比较，TT基因型频率的差异有统计学意义；等位基因T的频率在GEFS+组和对照组间的差异有统计学意义（P < 0.05）。在三种遗传模式下（CT/CC、TT/CC、T/C），GEFS+的发病风险分别是对照组的4.05倍（95% CI：1.04~15.69）、30.60倍（95% CI：6.46~144.85）和4.64倍（95% CI：2.54~8.48）。
结论
SCNlA基因rs3812718基因多态性是GEFS+的危险因素，携带T等位基因人群的GEFS+发病风险可能增加。
Keywords: 钠通道α-l亚基基因, rs3812718, 单核苷酸多态性, 全面性癫癎伴热性惊厥附加症, 儿童
Abstract
Objective
To investigate the association between SCN1A rs3812718 polymorphism and generalized epilepsy with febrile seizures plus (GEFS+), and to provide potential molecular targets for the diagnosis and treatment of GEFS+.
Methods
The iPLEX technique in the MassARRAY system was used to determine SCN1A rs3812718 polymorphism, genotype frequency, and allele frequency in 50 patients with GEFS+ and 50 healthy controls.
Results
As for the frequencies of CC, CT, and TT genotypes in SCN1A rs3812718, there was a significant difference in the frequency of TT genotype between the GEFS+ group and the control group (P < 0.05). There was also a significant difference in the frequency of T allele between the two groups (P < 0.05). Compared with those carrying CC genotype or C allele, the individuals with CT genotype, TT genotype or T allele had a higher risk of developing GEFS+ (CT/CC:OR=4.05, 95% CI:1.04-15.69; TT/CC:OR=30.60, 95% CI:6.46-144.85; T/C:OR=4.64, 95% CI:2.54-8.48).
Conclusions
SCN1A rs3812718 polymorphism is a risk factor for GEFS+, and the population carrying T allele may have an increased risk of GEFS+.
Keywords: Voltage gated sodium channel α l-subunit, rs3812718, Single nucleotide polymorphism, Generalized epilepsy with febrile seizures plus, Child
全面性癫癎伴热性惊厥附加症（generalized epilepsy with febrile seizure plus, GEFS+）是Scheffer等[1]于1997年首先报道的一种临床表型多样并具有显著遗传异质性的癫癎综合征。2001年国际抗癫癎联盟正式将GEFS+纳入新的癫癎综合征分类，其临床特征为具有高热惊厥家族史，首次热性惊厥（febrile seizure, FS）后出现无热惊厥，或6岁以后仍有热性惊厥，或兼有其他发作形式的全面性癫癎综合征，并排除了症状性癫癎。GEFS+最常见的表型为FS和热性惊厥附加症（ebrile seizure plus, FS+），少见表型包括FS+伴失神发作、FS+伴肌阵挛发作、FS+伴失张力发作或FS/FS+伴局限性发作、FS+伴颞叶癫癎，最严重和少见的表型为癫癎性脑病。GEFS+部分患儿可出现智力运动发育落后或倒退，伴或不伴共济失调和锥体束征。目前研究表明编码钠通道α1-亚基（voltagegated sodium channel ot l-subunit, SCNlA）的基因突变是导致GEFS+最常见的原因[2]。由于GEFS+有遗传外显率不全、表型异质和遗传异质的特点，其癫癎表型除了与SCNlA基因突变的类型和位置有关外，也与SCNlA基因单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNP）相关，国外有研究表明SCN1A基因rs3812718位点SNP是热性惊厥相关性癫癎的危险因素[3]。但有关SCNlA基因rs3812718位点与GEFS+易感的相关性尚未见报道。本研究采用MassARRAY阵列基因分析系统的iPLEX技术检测SCNlA基因rs3812718位点的基因型频率及等位基因的分布情况，分析SCNlA基因rs3812718位点与GEFS+的关系，探讨GEFS+的遗传易感性，为GEFS+的诊断和治疗提供理论依据。
1. 资料与方法
1.1. 研究对象
50例GEFS+患者来自深圳市第二人民医院和深圳市儿童医院，其中男31例、女19例，年龄1~10岁，病程2个月~3年，所有病例均符合2001年国际抗癫癎联盟（international league against epilepsy, ILAE）有关GEFS+癫癎综合征诊断标准[4]。对照组50例来自深圳市第二人民医院健康体检儿，无癫癎病史或癫癎家族史，个体间无亲缘关系，其中男67例、女33例，年龄3~13岁。
1.2. 基因组DNA提取
采集研究对象外周静脉血2 mL（EDTA抗凝），提取DNA，检测DNA浓度，确保浓度控制在10 ng/μL以上、核酸纯度控制在1.6~2.0之间，每一个反应的上样浓度控制在5~100 ng。
1.3. iPLEX技术检测SCNlA基因rs3812718多态性
使用Assay Designer在线设计软件设计引物（表 1）。PCR反应体系：0.5 μL 10×PCR buffer（with 20 mmol/L Mgcl2），0.4 μL 25 mmol/L Mgcl2，0.1 μL 25 mmol/L dNTP Mix，0.5 μL 1 μmol/L Primer Mix，0.2 μL 5 mol/L PCR Enzyme，1.3 μL灭菌HPLC级水。将2 μL DNA样本与3 μL PCR反应体系混合进行PCR反应。
1.
rs3812718的引物与产物相关信息
| 位点与基因型 | PCR扩增引物与延伸引物 | 分子量(Dalton) |
| rs3812718 | F: 5' -ACGTTGGATGTAGGTACAAAGAGCCTATCC-3' | |
| R: 5' -ACGTTGGATGCGCACTTTCAGAGTCTTGAG-3' | ||
| E: 5' -CCTATCCTTTACTCTAATCACTT-3' | ||
| T | CCTATCCTTTACTCTAATCACTTT | 7 186.6 |
| C | CCTATCCTTTACTCTAATCACTTC | 7 106.7 |
PCR扩增后剩余的dNTP去磷酸化降解。SAP（Shrimp Alkaline Phosphatase）反应体系包括1.5 μL灭菌HPLC级水、0.2 μL SAP buffer和0.3 μL SAP Enzyme。SAP反应程序为：37℃40 min（水解对硝基苯磷酸盐），85℃5 min（酶失活），4℃保温（防止核酸降解）。
延伸反应体系：0.6 μL灭菌HPLC级水、0.2 μL iPLEX Buffer、0.2 μL iPLEX Termination mix、0.9 μL Extend Primer Mix和0.041 μL iPLEX Enzyme。延伸反应程序包括94℃变性30 s；PCR扩增：94℃5 s、52℃5 s、80℃5 s，扩增40个循环（后两个条件5个循环）；延伸72℃3 min；4℃保温。
将延伸后的产物均匀地填充阳离子交换树脂脱盐。纯化并进行质谱点样检测。使用MassARRAY Typer 4.0软件分析结果。
1.4. 统计学分析
运用SPSS 22.0统计学软件进行数据处理。基因型和等位基因频率采用基因计数法，等位基因和基因型分布的比较采用χ2检验。以优势比（OR）及95%可信区间（95%CI）表示相对危险度。P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1. 质谱检测图谱与基因型结果
检测到SCN1A基因rs3812718位点的野生型、杂合型、突变型的质谱峰图，延伸引物峰仅于分子量7 106.7 Da处出现的为野生型（CC型，如图 1A），在分子量7106.7 Da和7186.6 Da处均出现峰的为杂合型（CT型，如图 1B），仅在分子量7 186.6 Da处出现的为突变型（TT型，如图 1C）。
1.
SCN1A基因rs3812718位点的基因型
A：SCN1A基因rs3812718位点CC型；B：SCN1A基因rs3812718位点CT型；C：SCN1A基因rs3812718位点TT型。红色虚线表示该位点延伸引物峰的位置，蓝色字母表示检测到的等位基因，红色字母表示未检测到的等位基因。
2.2. Hardy-Weinberg遗传平衡检验
对GEFS+组与对照组SCN1A基因rs3812718的基因型分布频率进行Hardy-Weinberg遗传平衡检验，差异无统计学意义（P > 0.05）。
以CC型作为参照，SCN1A基因rs3812718位点的CC、CT、TT基因型频率在GEFS+组和对照组的差异有统计学意义（P < 0.05）；以等位基因C作为参照，等位基因C、T频率在观察组和对照组间的差异有统计学意义（P < 0.05）。在三种遗传模式下（CT/CC、TT/CC、T/C），GEFS+的风险分别是对照组的4.05倍（95%CI：1.04~15.69）、30.60倍（95%CI：6.46~144.85）和4.64倍（95%CI：2.54~8.48），提示T等位基因为GEFS+发病的危险因素。见表 2。
2.
两组SCN1A基因rs3812718基因型频率的比较 [例（%）]
| 基因型及等位基因 | 例数 | 基因型 | 等位基因 | ||||
| CCa | CT | TT | Ca | T | |||
| 注：a示作为参照。 | |||||||
| 对照组 | 50 | 17(34) | 28(56) | 5(10) | 62(62) | 38(38) | |
| GEFS+组 | 50 | 3(6) | 20(40) | 27(54) | 26(26) | 74(74) | |
| OR值(95%CI) | 4.05(1.04~15.69) | 30.60(6.46~144.85) | 4.64(2.54~8.48) | ||||
| χ2值 | 4.485 | 24.269 | 26.299 | ||||
| P值 | 0.034 | < 0.001 | < 0.001 | ||||
3. 讨论
癫癎的发生是多种因素引起的，不同个体在相同致病环境作用下并非都发生癫癎，这种差异被称为癫癎易感性。不同个体基因型的差异性可导致癫癎易感性的不同。GEFS+属于离子通道病，研究[5]表明，GEFS+家系里有四种基因被确认与GEFS+发病有关，即SCNlA、SCN2A、SCNlB和GABAA，这四种基因定位于染色体2q24~q33上，分别编码钠通道的α1亚基、α2亚基、β亚基和GABA受体γ2亚基，这些基因的突变可导致相应通道蛋白的结构和功能改变，使启动和传播神经元的动作电位异常而导致癫癎发作。与热性惊厥相关的各种癫癎综合征病例中，包括GEFS+、婴儿重症肌阵挛性癫癎和顽固性儿童强直-阵挛癫癎等疾病均发现SCNlA基因有多个点突变[6-7]，而且SCNIA是与GEFS+相关的最为重要的钠通道基因，其突变数量最多。郭嘉诚等[8]发现FS与SCNlA基因的c.2650GA错义突变有关。意大利学者[9]发现FS患者存在SCNlA基因外显子16的3169G > A变异。
GEFS+具有表型异质性和遗传异质性，有学者[10]对600多例GEFS+和30多个家系的GEFS+进行研究显示，无论有无亲缘关系，相同SCNlA突变患者的临床表型差异大，认为SCNlA基因多态性的表象差异及基因缺失、单核苷酸多态性、基因重复等导致癫癎相关基因的个体差异，使得GEFS+个体在癫癎易感性方面有不同的结局。韩剑虹等[11]关于成人局灶性癫癎的研究表明，SCNlA基因rs3812718基因多态性可能促进局灶性癫癎的发生。rs3812718最初被发现于SMEI患者中，其后证明是一多态性位点，通过将不带电荷的极性R基的苏氨酸转为非极性R基的丙氨酸，从而改变SCNlA蛋白的空间构型，进而改变钠通道的通透性及导电性。Kumari[12]发现，印度北部白种人SCN1Ars3812718多态性与癫癎易感性相关。Tang[13]的研究显示，高加索白种人SCN1A rs3812718多态性是成年局灶性癫癎的危险因素。Le Gal[3]对164例白种人癫癎伴热性惊厥（EFS）的等位基因和基因型频率进行比较，SCN1A rs3812718与EFS具有相关性。本研究发现，GEFS+组的SCNlA基因rs3812718位点TT基因型频率、T等位基因频率均高于对照组，且TT/CC型遗传模式的风险值是对照组的30.6倍。提示SCNlA基因rs3812718位点多态性与GEFS+易感性可能有关联，携带T等位基因人群的GEFS+发病风险可能增加，而TT型的人群GEFS+发病风险更高，与国外报道[3]一致。
综上所述，SCNlA基因rs3812718位点TT基因型在GEFS+患者中检出率高，其多态性可能与GEFS+易感性有关。
Biographies
马启玲, 女, 学士, 主任医师
Chen G-F, Email:szchengf@163.com
References
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