Abstract
目的
探讨PR-957对A1反应性星形胶质细胞形成的影响。
方法
取出生1 d内的雌性大鼠脑皮质培养出原代星形胶质细胞，将细胞分为对照组、LPS组及LPS+PR-957组。LPS组给予5 μmol/L LPS处理48 h，LPS+PR-957组先用PR-957（终浓度200 nmol/L）处理1 h，再用5 μmol/L LPS处理48 h。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测补体3（C3，A1反应性星形胶质细胞标记物）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）；采用实时荧光定量PCR法检测磷脂酰肌醇蛋白聚糖6（glypicans 6，Gpc6）、SPARC样1（SPARC-like 1，Sparcl1）和脂质运载蛋白2（lipocalin 2，lcn2）mRNA的相对表达量。上述各实验均独立重复3次。
结果
对照组几乎不表达C3，LPS组与LPS+PR-957组C3水平高于对照组，但LPS+PR-957组的C3水平低于LPS组（P < 0.05）。TNF-α的表达结果与C3一致。与对照组相比，LPS组和LPS+PR-957组的Gpc6 mRNA及Sparcl1 mRNA表达水平均降低，lcn2 mRNA表达水平均升高（P < 0.001）；与LPS组相比，LPS+PR-957组的Gpc6 mRNA及Sparcl1 mRNA表达水平均升高，lcn2 mRNA表达水平降低（P < 0.001）。
结论
LPS能够诱导星形胶质细胞成为A1反应性星形胶质细胞；PR-957可以抑制LPS诱导的A1反应性星形胶质细胞形成。
Keywords: 脂多糖, PR-957, 补体3, 肿瘤坏死因子α, 星形胶质细胞
Abstract
Objective
To study the effect of PR-957 on the formation of A1 reactive astrocytes.
Methods
The cerebral cortices of 1-day-old female rats were obtained and cultured for primary astrocytes. These cells were divided into 3 groups:control, lipopolysaccharide (LPS), and LPS+PR-957. The LPS group was treated with LPS (at a concentration of 5 μmol/L) for 48 hours; the LPS+PR-957 group was treated with PR-957 (at a final concentration of 200 nmol/L) for 1 hour and then LPS for 48 hours. Enzyme-linked immunosorbent assay was used to determine the expression of complement 3 (C3, a marker for A1 reactive astrocytes) and tumor necrosis factor alpha (TNF-α). Quantitative real-time PCR was used to determine the relative mRNA expression of glypican-6 (GPC6), SPARC-like 1 (SPARCL1), and lipocalin-2 (LCN2). All the above experiments were repeated three times independently.
Results
C3 expression was almost not observed in the control group, but was observed in both the LPS group and the LPS+PR-957 group, with significantly lower expression observed in the LPS+PR-957 group (P < 0.05). The expression of TNF-α was consistent with that of C3. Compared with the control group, the LPS and the PS+PR-957 groups had significantly reduced mRNA expression levels of GPC6 and SPARCL1 but significantly increased mRNA expression level of LCN2 (P < 0.001). Compared with the LPS group, the LPS+PR-957 group had significantly increased mRNA expression levels of GPC6 and SPARCL1 but significantly reduced mRNA expression level of LCN2 (P < 0.001).
Conclusions
LPS can induce the transformation from astrocytes to A1 reactive astrocytes, and PR-957 can inhibit the formation of LPSinduced A1 reactive astrocytes.
Keywords: Lipopolysaccharide, PR-957, Complement 3, Tumor necrosis factor alpha, Astrocyte
星形胶质细胞是中枢神经系统（central nervous system, CNS）中的重要细胞，参与CNS的多种生理功能，例如血脑屏障形成和维持、突触发生、神经传递、代谢调节和支持突触传递[1]。创伤、感染、神经变性和局部缺血等病理性刺激使它们的形态和基因表达发生巨大的变化，被称为反应性星形胶质细胞[2]。反应性星形胶质细胞的功能一直是一个争论的主题，以前的研究表明它们既可以阻碍又可以促进CNS损伤恢复。尚不清楚这些细胞在哪种情况下可能有帮助或有害，并且关于它们的功能仍存在许多问题。2017年Liddelow等[3]提出CNS损伤过程中的反应性星形胶质细胞发挥有益还是有害功能取决于引起反应性星形胶质细胞的刺激；该研究认为根据损伤或疾病的性质至少有两种亚型的反应性星形胶质细胞，一种有害，另一种有益。感染诱导的反应性星形胶质细胞失去了基本的生理功能并伤害神经元及少突胶质细胞，对CNS有害，称为A1反应性星形胶质细胞。缺血诱导的反应性星形胶质细胞分泌许多神经营养因子，对神经元具有保护作用，称为A2反应性星形胶质细胞。了解反应性星形胶质细胞的多维作用有可能有助于开发新的治疗策略，以减轻不同类型CNS损伤的程度。本研究的目的是确认感染因子脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）刺激产生的反应性星形胶质细胞是A1反应性星形胶质细胞，并提出能抑制A1反应性星形胶质细胞形成的物质。
根据单细胞数据，补体3（complement 3, C3）在A1反应性星形胶质细胞中被特异性上调，被认为是A1反应性星形胶质细胞的标记物[4]。正常的星形胶质细胞具有分泌磷脂酰肌醇蛋白聚糖6（glypican 6, Gpc6）及SPARC样1（SPARC-like 1, Sparcl1）促进兴奋性突触形成的生理功能[5-6]，失去部分生理功能的A1反应性星形胶质细胞可能会减少甚至不分泌Gpc6及Sparcl1，因此将Gpc6与Sparcl1纳入本研究进行检测。此外，反应性星形胶质细胞释放的肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor alpha, TNF-α）与脂质运载蛋白2（lipocalin 2, lcn2）能促进神经元凋亡[7-8]，因此也被纳入本研究进行检测。
免疫蛋白酶体在炎症反应中具有关键作用[9]。PR-957是免疫蛋白酶体亚基低分子量多肽7（low molecular mass polypeptide 7, LMP7）的特异性抑制剂，能抑制促炎细胞因子如TNF-α、IL-23和IL-2的表达并缓解小鼠实验性结肠炎与关节炎的病情[10-11]。并且PR-957在动物模型中的药效浓度为2 mg/kg，远远低于其半数致死量的浓度（30 mg/kg），临床转化能力强[11]。在阿尔茨海默病模型鼠脑组织中发现高表达的LMP7[12-13]。LPS刺激下的星形胶质细胞也表达LMP7[14]。因此我们猜测PR-957能抑制LPS诱导的A1反应性星形胶质细胞形成。
在本研究中，首先用LPS刺激星形胶质细胞，确证是否产生A1反应性星形胶质细胞，并在此基础上观察PR957能否抑制A1反应性星形胶质细胞形成。
1. 材料与方法
1.1. 材料
高糖DMEM培养基、胎牛血清（美国Gibco公司），CCK-8试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），LPS（美国Sigma公司），PR-957（美国Selleck公司），大鼠TNF-α ELISA试剂盒（美国Rapidbio公司），大鼠C3 ELISA试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司），RNeasyMini试剂盒（德国QIAGEN公司），Prime ScriptTM逆转录试剂盒、SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒（大连宝生物工程有限公司），兔抗胶质纤维酸性蛋白（GFAP）抗体（英国Abcam公司），异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate isomer，FITC）标记的山羊抗兔抗体（美国Santa Cruz公司）。
1.2. 原代星形胶质细胞培养与分组
本研究采用出生1 d内的雌性大鼠脑皮质培养出原代星形胶质细胞[15]，利用免疫荧光技术鉴定细胞纯度[2]后进行后续实验。动物实验获得浙江大学动物伦理委员会批准（ZJU2015-103-02）。细胞实验分为对照组、LPS处理组（LPS组）、LPS+PR-957共同处理组（LPS+PR-957组）。对照组行常规培养，LPS组给予LPS处理，LPS+PR-957组先用PR-957（终浓度200 nmol/L）处理1 h后再给予LPS干预，PR-957作用浓度及时间的选择参照产品说明书。
1.3. 免疫荧光技术鉴定星形胶质细胞
在12孔板中放入玻片，将5×105/mL的细胞悬液1 mL滴于玻片上培养，待细胞长满玻片时取出细胞爬片。PBS漂洗细胞爬片上残余的血清蛋白（37℃，3 min×3次），-20℃的4%多聚甲醛固定细胞，PBS漂洗3 min×3次。1% Triton作用25~30 min，PBS漂洗5 min×2次。羊血清封闭37℃，20 min。加入兔抗GFAP一抗（1 : 1 000），4℃孵育过夜。第2天4℃ PBS漂洗3 min×5次，加入羊抗兔FITC二抗（1 : 100），37℃孵育1 h，37℃ PBS漂洗5 min×3次。凉干封片（封闭液pH 8.5），荧光倒置显微镜下观察。
1.4. CCK-8法检测细胞存活情况
调整细胞悬液浓度为2×104/mL，96孔板中每孔加入100 μL细胞悬液，使每孔细胞数达2 000（边缘孔用无菌PBS填充）。将培养板放入培养箱中（5%CO2，37℃）培养24 h后，分为对照组和LPS组，向不同浓度LPS组各孔中分别加入1、5、10 μmol/L的LPS 10 μL，对照组加入等量生理盐水，在培养箱中培养24 h。取最佳刺激浓度LPS组和对照组细胞在培养箱中分别培养24、48、72 h。在培养结束前6 h，向各孔中加入10 μL CCK-8溶液。以空白孔（培养基+CCK-8溶液）调零，在酶标仪（美国Bio-Rad公司）上于450 nm波长处检测各孔吸光度（OD）值。细胞存活率计算方法：细胞存活率=干预前细胞OD值/干预后细胞OD值×100%。实验独立重复3次。
1.5. ELISA法检测C3及TNF-α水平
使用ELISA试剂盒检测各组C3及TNF-α水平，实验步骤按厂家提供的说明书操作。在酶标仪（美国Bio-Rad公司）上于450 nm波长处检测各孔OD值，记录结果，将OD值与标准曲线比较得出含量值，实验独立重复3次。
1.6. 实时荧光定量PCR法检测Gpc6、Sparcl1和lcn2 mRNA的表达
按照RNeasyMini试剂盒提供的方法提取各组待测细胞的RNA。按照Prime ScriptTM逆转录试剂盒说明书合成cDNA。特异性扩增引物由上海桑尼生物科技有限公司设计并合成（表 1）。按照SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒说明书进行实时荧光定量PCR（qRT-PCR）。反应体系（20 μL）：SYBR Premix Ex TaqTM 10 μL，上下游引物各0.8 μL，cDNA模板2.0 μL，dH2O 6.4 μL。反应条件：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s，30个循环。根据测得的Ct值，计算Gpc6、Sparcl1和lcn2 mRNA的相对表达量，结果以2-△△Ct表示，△△Ct =（实验组目的基因的平均值-实验组GAPDH平均值）-（对照组目的基因的平均值-对照组GAPDH平均值）。实验独立重复3次。
1.
目的基因和GAPDH的引物序列
| 名称 | 序列 | 片段长度 |
| Gpc6 | 上游引物5'-CCGCTTTCGACCCTACAACC3-3' | 100 bp |
| 下游引物5'-GACACTGTGCTGCATGGTCC3-3' | ||
| Sparcl1 | 上游引物5'-GTTCCTTCACAGATTCTAACC-3' | 106 bp |
| 下游引物5'-TTTACTGCTCCTGTTCAACTG-3' | ||
| lcn2 | 上游引物5'-GATTCGTCAGCTTTGCCAAGT-3' | 115 bp |
| 下游引物5'-CATTGGTCGGTGGGAACAG-3' | ||
| GAPDH | 上游引物5'-TCAAGAAGGTGGTGAAGCAG-3' | 133 bp |
| 下游引物5'-AGGTGGAAGAATGGGAGTTG-3' |
1.7. 统计学分析
釆用SPSS 22.0统计软件对数据进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用两样本t检验；多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1. 星形胶质细胞的鉴定
GFAP是星形胶质细胞的标记物[16]，故用免疫荧光法检测GFAP对原代星形胶质细胞进行鉴定。显微镜下观察细胞生长状态良好，从胞体发出许多长而分支的突起，呈星状。通过GFAP/DAPI的百分比计算可得，星形胶质细胞的纯度达98%，见图 1。
1.
原代星形胶质细胞的免疫荧光鉴定（×100）
GFAP（绿色）是星形胶质细胞的标记物。镜下细胞生长状态良好，呈星状，从胞体发出许多长而分支的突起。通过GFAP/DAPI的百分比计算可得，星形胶质细胞的纯度达98%。
2.2. 不同浓度LPS对星形胶质细胞增殖活性的影响
LPS（5 μmol/L）刺激24 h后星形胶质细胞的存活率高于对照组（P < 0.05），1、10 μmol/L LPS刺激24 h后星形胶质细胞的存活率与对照组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。提示5 μmol/L LPS对星形胶质细胞的增殖活性增加效果最显著，因此选择5 μmol/L LPS进行后续实验。见表 2。
2.
不同浓度LPS刺激24 h后星形胶质细胞存活率比较 （n=3，x±s，%）
| 组别 | 星形胶质细胞存活率 |
| 注：a示与对照组比较，P < 0.05。 | |
| 对照组 | 103±11 |
| LPS 1 μmol/L | 135±13 |
| LPS 5 μmol/L | 160±20a |
| LPS 10 μmol/L | 101±15 |
| F值 | 15.86 |
| P值 | < 0.001 |
2.3. LPS不同干预时间对星形胶质细胞增殖活性的影响
5 μmol/L LPS刺激24、48、72 h，分别与同一时间点对照组比较，星形胶质细胞存活率均增加（P < 0.05），且48 h组星形胶质细胞存活率增加幅度最显著，因此选择LPS刺激星形胶质细胞48 h进行后续实验。见表 3。
3.
LPS干预不同时间星形胶质细胞的存活率与对照组比较 （n=3，x±s，%）
| 组别 | 24 h | 48 h | 72 h |
| 对照组 | 103±17 | 107±18 | 111±13 |
| LPS组 | 161±21 | 181±15 | 163±11 |
| t值 | 6.432 | 10.524 | 8.392 |
| P值 | < 0.001 | < 0.001 | < 0.001 |
2.4. 各组细胞C3的表达情况
C3是A1反应性星形胶质细胞的标志物[17]，通过检测C3来判断A1反应性星形胶质细胞的形成情况。ELISA检测结果显示：各组C3含量比较，差异有统计学意义（F=377.53，P < 0.001）。其中对照组几乎不含C3（13±5 ng/mL）；LPS组C3含量（2 006±125 ng/mL）高于对照组（P < 0.001）；与LPS组相比，LPS+PR-957组C3含量（713±94 ng/mL）减少（P < 0.001）。表明LPS诱导A1反应性星形胶质细胞形成，PR-957能部分抑制LPS诱导的A1反应性星形胶质细胞形成。
2.5. 各组细胞TNF-α的表达情况
ELISA检测结果显示：各组TNF-α含量比较，差异有统计学意义（F=351.96，P < 0.001）。对照组几乎不含TNF-α（18±3 pg/mL）；LPS组TNF-α含量（995±76 pg/mL）高于对照组（P < 0.001）；与LPS组相比，LPS+PR-957组TNF-α含量（232±32 pg/mL）减少（P < 0.001）。提示LPS刺激使A1反应性星形胶质细胞表达TNF-α，PR-957能抑制LPS对A1反应性星形胶质细胞表达TNF-α的促进作用。
2.6. 各组细胞Gpc6 mRNA、Sparcl1 mRNA及lcn2 mRNA的表达
与对照组相比，LPS组和LPS+PR-957组的Gpc6 mRNA及Sparcl1 mRNA表达水平均降低（P < 0.001），lcn2 mRNA表达水平均升高（P < 0.001）；与LPS组相比，LPS+PR-957组的Gpc6 mRNA及Sparcl1 mRNA表达水平均升高（P < 0.001），lcn2 mRNA表达水平降低（P < 0.001）。提示LPS刺激能减少A1反应性星形胶质细胞表达Gpc6与Sparcl1，增加A1反应性星形胶质细胞表达lcn2，PR-957能部分抑制LPS对A1反应性星形胶质细胞的作用。见表 4。
4.
各组细胞Gpc6 mRNA、Sparcl1 mRNA及lcn2 mRNA的表达比较 （n=3，x±s）
| 组别 | Gpc6 mRNA | Sparcl1 mRNA | lcn2 mRNA |
| 注：a示与对照组比较，P < 0.05；b示与LPS组比较，P < 0.05。 | |||
| 对照组 | 300±5 | 192±8 | 1.07±0.13 |
| LPS组 | 79±12a | 27±9a | 54.31±3.27a |
| LPS+PR-957组 | 205±15a, b | 92±10a, b | 9.06±1.08a, b |
| F值 | 272.57 | 247.38 | 624.68 |
| P值 | < 0.001 | < 0.001 | < 0.001 |
3. 讨论
星形胶质细胞是大脑中数量众多的一类细胞，是CNS免疫应答的重要调节因子，会被多种因素激活[18]，例如感染、缺氧。反应性星形胶质细胞的功能目前尚不清楚。Liddelow等[3]提出反应性星形胶质细胞的功能是由刺激因素决定的，认为感染诱导的反应性星形胶质细胞会损伤神经细胞，称为A1反应性星形胶质细胞；缺氧诱导的反应性星形胶质细胞对神经有保护作用，称为A2反应性星形胶质细胞。探索能够抑制A1反应性星形胶质细胞形成的物质能为治疗CNS损伤提供策略。
根据单细胞数据，C3在A1反应性星形胶质细胞中被特异性上调，此外目前没有研究提出其他因子诱导的反应性星形胶质细胞表达C3，因此将C3当作A1反应性星形胶质细胞的标志物[4]。在本项研究中我们还观察到A1反应性星形胶质细胞的其他特征。正常的星形胶质细胞具有分泌Gpc6及Sparcl1促进兴奋性突触形成的生理功能[5-6]。失去部分生理功能的A1反应性星形胶质细胞可能会减少甚至不分泌Gpc6与Sparcl1，因此将Gpc6与Sparcl1当做检测指标。此外，反应性星形胶质细胞释放的促炎因子TNF-α与lcn2促进神经元凋亡[7-8]，因此也被当做检测指标。
炎症环境下，免疫细胞表达免疫蛋白酶体的亚基LMP7参与炎症反应[19]。星形胶质细胞是脑内的免疫细胞，在炎症环境下也表达LMP7[14]。目前已有针对LMP7的靶向抑制剂PR-957，它选择性地诱导LMP7的S1结合口袋的构象变化，选择性的抑制炎症部位的LMP7而不影响其他正常部位。有研究发现，PR-957能够抑制促炎细胞因子的产生[20]；在葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠结肠炎模型中，使用LMP7抑制剂PR-957可以明显减轻结肠炎的病理症状，减少大量细胞因子的产生[10]；在小鼠类风湿关节炎模型中，PR-957能减少细胞浸润、细胞因子及抗体的产生[11]。因此我们认为PR-957可能可以抑制A1反应性星形胶质细胞的形成。
本研究使用的感染因素是革兰阴性杆菌细胞壁的LPS。本研究结果证实正常的星形胶质细胞不表达C3，LPS刺激星形胶质细胞表达C3，与Liddelow等[3]的研究结果一致。并且，与对照组的星形胶质细胞对比发现LPS刺激后的星形胶质细胞低表达Gpc6 mRNA和Sparcl1 mRNA，高表达TNF-α及神经毒性因子lcn2 mRNA，表明LPS诱导产生A1反应性星形胶质细胞。
此外，本研究发现与单用LPS刺激的星形胶质细胞相比，用PR-957预处理过的星形胶质细胞表达的C3减少、Gpc6 mRNA和Sparcl1 mRNA增多、TNF-α与神经毒性因子lcn2 mRNA减少。表明PR-957能减少LPS对星形胶质细胞的影响，即PR-957能抑制A1反应性星形胶质细胞的形成。
综上所述，LPS诱导产生A1反应性星形胶质细胞，PR-957能抑制LPS诱导产生A1反应性星形胶质细胞。
Biography
戴淑馨, 女, 硕士研究生
Funding Statement
国家自然科学基金(81571466)
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