Abstract
目的
探讨肺炎支原体（MP）肺炎患儿MP耐药情况及其与DNA载量和基因型的关系。
方法
选取2012年1月至2016年12月诊断为MP肺炎的230例住院患儿为研究对象，采集所有患儿咽拭子标本，采用快速培养基培养药敏法测定9种常用抗菌药物对MP临床分离株的药物敏感性；荧光实时定量PCR检测患儿咽拭子MP-DNA载量；PCR测序检测MP 23S rRNA V区2063位基因型。
结果
230例MP患儿中，86例2063位基因型为A（37.4%），134例为G（58.3%），8例为C（3.5%），2例为T（0.9%）。突变基因型（G+C+T）MP-DNA载量高于野生基因型（A）菌株（P < 0.05）；红霉素、阿奇霉素、克拉霉素、克林霉素耐药组MP-DNA载量高于非耐药组（P < 0.05）。MP对大环内酯类抗生素耐药率较高，60%以上产生大环内酯类耐药的病例均检测出A2063G突变，喹诺酮类药物少见MP耐药（低于2%）。
结论
23S rRNA V区2063位点发生基因突变可能导致MP对大环内酯类药物耐药和DNA载量的变化，可作为MP治疗用药的选择依据。
Keywords: 肺炎支原体, 耐药性, DNA载量, 基因型, 儿童
Abstract
Objective
To investigate the association of drug resistance of Mycoplasma pneumoniae (MP) with DNA load and genotypes in children with MP pneumonia.
Methods
A total of 230 children who were hospitalized and diagnosed with MP pneumonia between January 2012 and December 2016 were enrolled. Throat swabs were collected from the 230 children, and a rapid drug sensitivity assay was used to determine the sensitivity of clinical isolates of MP to nine commonly used antibacterial agents. Quantitative real-time PCR was used to measure MP-DNA load in throat swabs. PCR sequencing was used to determine the genotype of 2063 locus of the MP 23S rRNA V domain.
Results
Of the 230 children, 86 (37.4%) had genotype A in 2063 locus, 134 (58.3%) had genotype G, 8 (3.5%) had genotype C, and 2 (0.9%) had genotype T. Mutant strains (genotype G+C+T) had a significantly higher MP-DNA load than wild-type strains (genotype A) (P < 0.05). The strains resistant to erythromycin, azithromycin, clarithromycin, and clindamycin had a significantly higher MP-DNA load than non-resistant strains (P < 0.05). MP had a high drug resistance rate to macrolide antibiotics. More than 60% of the cases with resistance to macrolides were found to have A2063G mutations. MP was rarely resistant to quinolones (less than 2%).
Conclusions
Mutations in 2063 locus of the MP 23S rRNA V domain may result in the resistance of MP to macrolides and the change in DNA load and can be used as a basis for selecting drugs for MP.
Keywords: Mycoplasma pneumoniae, Drug resistance, DNA load, Genotype, Child
肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae, MP）是儿童呼吸道疾病常见的病原体之一，治疗上主要采用大环内酯类抗生素。近年来，MP对大环内酯类抗生素耐药性日趋严重，且全世界各地耐药率存在差异[1]。目前认为其耐药机制主要与23S rRNA V区基因位点突变（2063位和2064位）相关[2-5]。耐药位点基因型是抗生素治疗MP是否产生耐药性的重要决定因素，而MP定量检测是MP诊断和抗生素治疗疗效评价的重要指标。目前对于MP耐药性与MP-DNA载量和耐药位点基因型的关系的相关研究暂为空白。本研究对MP感染患儿耐药性与MP-DNA载量和23S rRNA V区基因位点基因型的关系进行研究，以加强MP的耐药性及流行基因型的监测，有助于了解MP的流行病学特点，同时为新型抗生素及疫苗的研发提供依据，现报告如下。
1. 资料与方法
1.1. 研究对象
选取2012年1月至2016年12月于厦门市妇幼保健院住院的MP肺炎患儿230例为研究对象，其中男122例，女108例，年龄1岁3个月至8岁3个月，平均年龄4.8±1.9岁。所有患儿的诊断和疗效判断参照MP肺炎临床路径[6]，同时本研究获得医院医学伦理委员会批准。
1.2. 肺炎支原体培养及药敏鉴定
采集所有患儿咽拭子标本，在药敏板阴性孔中加入100 μL快速MP培养基（试剂盒由陕西百盛园生物科技信息有限公司提供），然后将采集的咽拭子标本在培养基中搅匀后加入各药敏板中，置于37℃培养箱24 h。药敏板中含有9种抗生素（红霉素、阿奇霉素、罗红霉素、克拉霉素、乙酰螺旋霉素、克林霉素、左氧氟沙星、加替沙星、司帕沙星），利用抗生素的高低浓度在体外对微生物生长的抑制作用，对微生物作耐药性分析。若双药敏板孔均保持红色则为对该抗生素敏感，双孔一红一黄则为中介，双孔均变黄色则为对该抗生素耐药。
1.3. MP-DNA载量检测
用FQ-PCR法检测MP-DNA载量，试剂盒由中山大学达安基因股份有限公司提供。应用PE5700型基因检测系统进行PCR扩增及数据处理。PCR循环条件为：93℃2 min；93℃45 s，55℃60 s，共10个循环；93℃30 s，55℃45 s，共30个循环；具体按说明书操作。以H肌动蛋白DNA（H actin-DNA）含量作为内参，引物、探针由上海英潍捷基公司合成。引物序列为：F：5'-ACCGAGCGCGGCTACAG-3'，R：5'-CTTAATGTCACGCACGATTTCC-3'，探针序列为：5'-TTCACCACCACGGCCGAGC-3'。PCR循环条件为：94℃4 min；93℃ 30 s，60℃ 30 s，共40个循环。计算阳性样本MP的相对定量值，即MP载量指数（Mycoplasma pneumoniae load index, MPLI）=-lg（MP-DNA拷贝量/H actin-DNA拷贝量）[7]。
1.4. 23S rRNA V区PCR扩增及序列测定
参考Lucier等[8]报道扩增23S rRNA V区的引物序列，由上海英潍捷基公司合成。上游引物序列：5'-ACTATAACGGTCCTAAGGTA-3'，下游引物序列：5'-ACCTATTCTCTACATGATAA-3'。PCR反应条件：95℃预变性5 min；94℃变性15 s，52℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35个循环；72℃终延伸10 min；4℃保存。取5 μL PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。电泳结果良好，有单一产物带，PCR产物直接回收纯化，并测序。测序结果与基因库的参考序列进行比对，确定23S rRNA V区2063位基因型。
1.5. 统计学分析
采用SPSS 17.0统计学软件对数据进行统计学分析，正态分布计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。计数资料采用百分率（%）表示，组间比较采用卡方检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1. MP肺炎患儿的耐药情况
对230例MP肺炎患儿行快速MP培养药敏试验，其中红霉素、罗红霉素耐药率较高，在70%以上；乙酰螺旋霉素和克林霉素耐药率也在50%以上；阿奇霉素和克拉霉素耐药率相对较低（20%~35%）；喹诺酮类抗生素（左氧氟沙星、加替沙星和司帕沙星）少见MP耐药（低于2%）。见表 1。
1.
230例患儿MP培养药敏结果 [例（%）]
| 药物 | 敏感 | 中介 | 耐药 |
| 红霉素 | 34(14.8) | 34(14.8) | 162(70.4) |
| 阿奇霉素 | 130(56.5) | 44(19.1) | 56(24.4) |
| 罗红霉素 | 38(16.5) | 24(10.4) | 168(73.0) |
| 克拉霉素 | 96(41.7) | 54(23.5) | 80(34.8) |
| 乙酰螺旋霉素 | 48(20.9) | 62(26.9) | 120(52.2) |
| 克林霉素 | 54(23.5) | 48(20.9) | 128(55.6) |
| 左氧氟沙星 | 224(97.4) | 2(0.9) | 4(1.7) |
| 加替沙星 | 220(95.7) | 6(2.6) | 4(1.7) |
| 司帕沙星 | 226(98.3) | 4(1.7) | 0(0) |
2.2. MP对不同抗生素耐药性与MP-DNA载量的关系
根据每种药物的药敏试验结果，将药敏结果为耐药的病例纳入耐药组，将药敏结果为敏感或中介的病例纳入非耐药组，比较两组MPLI。耐药组MPLI均低于非耐药组，即耐药组MP-DNA载量高于非耐药组，其中红霉素、阿奇霉素、克拉霉素、克林霉素耐药组与非耐药组MPLI比较差异有统计学意义（P < 0.05），而罗红霉素、乙酰螺旋霉素、左氧氟沙星、加替沙星耐药组与非耐药组MPLI比较差异无统计学意义（P>0.05），见表 2。
2.
不同抗生素耐药组与非耐药组MPLI比较 （x±s）
| 抗生素 | 耐药组 | 非耐药组 | t值 | P值 |
| 红霉素 | 3.58±0.68 (n=162) |
4.24±1.02 (n=68) |
8.271 | 0.004 |
| 阿奇霉素 | 3.13±0.49 (n=56) |
3.98±0.96 (n=174) |
10.283 | 0.001 |
| 罗红霉素 | 3.59±0.81 (n=168) |
4.27±1.21 (n=62) |
0.668 | 0.414 |
| 克拉霉素 | 3.25±0.42 (n=80) |
4.09±0.84 (n=150) |
6.244 | 0.013 |
| 乙酰螺旋霉素 | 3.47±0.60 (n=120) |
4.10±0.59 (n=110) |
2.537 | 0.112 |
| 克林霉素 | 3.48±0.55 (n=128) |
4.14±0.25 (n=102) |
10.353 | 0.001 |
| 左氧氟沙星 | 3.95±1.18 (n=4) |
4.16±0.82 (n=226) |
0.455 | 0.500 |
| 加替沙星 | 3.22±0.36 (n=4) |
3.73±0.43 (n=226) |
0.166 | 0.684 |
2.3. MP对不同抗生素耐药性与23S rRNA V区2063位基因型的关系
比较对9种抗生素耐药的病例MP 23S rRNA V区2063位基因型（野生基因型为A型），可见2063位A→G突变对大环内酯类抗生素耐药影响较大，60%以上产生大环内酯类药物耐药的病例均检测出2063位点G突变。2063位点A、G基因型产生喹诺酮类药物耐药的例数相同。见表 3。
3.
MP 23S rRNA V区2063位基因型与抗生素耐药性的关系 [例（%）]
| 药物 | 耐药总例数 | 23S rRNA V区2063位基因型 | χ2值 | P值 | |||
| A | C | G | T | ||||
| 红霉素 | 162 | 46(28.4) | 6(3.7) | 108(66.7) | 2(1.2) | 19.42 | < 0.01 |
| 阿奇霉素 | 56 | 6(10.7) | 4(7.1) | 46(82.1) | 0(0) | 24.84 | < 0.01 |
| 罗红霉素 | 168 | 52(31.0) | 6(3.6) | 108(64.3) | 2(1.2) | 11.55 | 0.009 |
| 克拉霉素 | 80 | 16(20.0) | 2(2.5) | 62(77.5) | 0(0) | 19.12 | < 0.01 |
| 乙酰螺旋霉素 | 120 | 36(30.0) | 4(3.3) | 78(65.0) | 2(1.7) | 7.47 | 0.058 |
| 克林霉素 | 128 | 36(28.1) | 4(3.1) | 86(67.2) | 2(1.6) | 12.27 | 0.007 |
| 左氧氟沙星 | 4 | 2(50.0) | 0(0) | 2(50.0) | 0(0) | 0.40 | 0.941 |
| 加替沙星 | 4 | 2(50.0) | 0(0) | 2(50.0) | 0(0) | 0.40 | 0.941 |
2.4. MP-DNA载量与23S rRNA V区2063位基因型的关系
检测230例MP肺炎患儿23S rRNA V区2063位基因型，其中86例为A型（37.4%），134例为G型（58.3%），8例为C型（3.5%），2例为T型（0.9%）。根据23S rRNA V区2063位基因型结果把230例MP肺炎患儿分成野生型组（基因型为A）和突变型组（基因型为C、G和T）。比较两组的平均MPLI，突变型组MPLI（3.2±0.6）低于野生型组（4.1±0.6）（t=10.310，P=0.001），即突变型组患儿MP-DNA载量高于野生型组。
2.5. MP-DNA载量与23S rRNA V区2063位突变基因型的关系
23S rRNA V区2063位基因突变为C、G、T的患儿的MPLI分别为3.1±0.5、3.4±0.6、3.2±0.8，差异无统计学意义（F=0.98，P=0.507）。
3. 讨论
研究表明MP是引起社区获得性呼吸道感染的主要病原体之一，好发于学龄儿童和青少年，近年MP感染日益增多，难治性MP肺炎在临床愈加常见，MP耐药是导致其难治的主要原因之一。由于MP缺乏细胞壁，其对如β-内酰胺类等作用于细胞壁合成的抗生素天然耐药，鉴于儿童生长发育及骨骼、牙齿等发育特性，限制了四环素类和喹诺酮类抗生素在儿童中的应用，因此，大环内酯类常作为MP治疗的首选药物。目前数据显示我国儿童及成人患者分离到的MP临床菌株对大环内酯类抗生素具有较高的耐药性，上海、北京等地耐药率在69%~97%，并且逐年上升[9-11]。迄今为止，厦门地区儿童的MP耐药性尚未有报道。本研究采用快速MP培养药敏法测定了9种抗生素对MP临床分离株的药物敏感性。结果显示，左氧氟沙星等喹诺酮类对MP具有良好的体外抗微生物活性作用；MP临床分离株对红霉素、罗红霉素的敏感性低，耐药率分别是70.4%和73.0%；MP对乙酰螺旋霉素和克林霉素的敏感性也明显下降，但耐药率低于红霉素，分别是52.2%和55.6%；MP对阿奇霉素和克拉霉素耐药性低于其他大环内酯类，分别是24.4%和34.8%。
既往研究显示，MP对大环内酯类抗生素的耐药机制主要为核糖体50S亚单位23S rRNA结构域V区和Ⅱ区核苷酸序列改变导致抗生素与核糖体亲和力下降，从而导致耐药[12]。目前有文献报道的影响MP对大环内酯类抗生素耐药性的位点最常见的是V区的2063位点，2064、2067、2617位点也有个别报道；还有研究表明核糖体蛋白L4、L22基因位点突变也会影响大环内酯类抗生素耐药性的产生[13]。此外，药物的主动外排系统也可能导致MP产生耐药。本研究对MP 23S rRNA V区进行扩增、产物测序，重点分析最常见报道的2063位点突变情况。结果显示，162株红霉素耐药MP临床株中，71.6%存在23S rRNA V区2063位点突变，其中108例为A2063G突变，占66.7%；46例为野生型A型，占28.4%；6例为A2063C突变，占3.7%；2例为A2063T突变，占1.2%。红霉素敏感株均不存在23S rRNA V区2063位点突变。其他大环内酯类抗生素耐药MP临床株中23S rRNA V区2063位点基因型分布亦类似。
MP-DNA载量客观反映了MP与宿主免疫清除能力之间的平衡。MP突变位点基因型与MP-DNA载量间的关系目前未见报道。对于临床上耐药MP菌株的基因型的研究，目前常用的分型方法有：基于黏附蛋白P1基因的2个基本重复区域差异，通过PCR-RFLP技术将MP分为P1基因型Ⅰ和Ⅱ两种基因型；采用MLVA技术，通过MP基因组中可变数量串联重复序列拷贝数的差异这一特征来实现分型[14-17]。但是上述两种分型方法均存在与MP耐药相关性不明确等问题[18]。本研究选择了对MP耐药性影响较明确的23S rRNA V区2063位点基因型作为分型依据。分型结果显示，MP 23S rRNA V区2063位点是否发生突变，其MP-DNA载量比较差异有统计学意义。而突变成何种碱基，MP-DNA载量比较差异无统计学意义，三种突变基因型均提高MP对大环内酯类抗生素的耐药性，而对喹诺酮类抗生素耐药性未见影响。感染者间的MP-DNA载量如果存在明显差异是由于MP核糖体23S rRNA V区2063位不同基因型改变，影响抗生素与核糖体亲和力，从而导致耐药，敏感株的增殖受到抑制而耐药株不受抑制，因此MP-DNA载量上升。而喹诺酮类抗生素对MP作用靶点不同，其通过嵌入断裂DNA链中间，形成DNA-拓扑异构酶-喹诺酮类三者复合物，阻止DNA拓扑异构变化，妨碍MP-DNA复制、转录，以达到杀灭病原体的目的[19]。因此23S rRNA位点突变与喹诺酮类抗生素耐药性可能不存在相关性。
综上所述，MP临床分离株对大环内酯类耐药率较高，对喹诺酮类抗生素敏感性较高。23S rRNA V区2063位点基因型发生突变可能影响MP耐药的产生和DNA载量的变化，可作为MP治疗用药的选择依据。由于本研究仅涉及MP耐药中最常见的23S rRNA V区2063位点，对于这些耐药菌株是否存在其他突变位点，或其他机制导致耐药，需要进行分离株间的23S rRNA同源性分析，以及其他基因如核糖体L4、L22等的PCR扩增及测序鉴定以进一步明确。另外，本研究仅对红霉素、阿奇霉素、罗红霉素、克拉霉素等6种大环内酯类及左氧氟沙星等3种喹诺酮类抗生素测定敏感性，而未覆盖如四环素类抗生素及大环内酯、喹诺酮类中的其他抗生素。需要进一步了解MP对更多抗生素，尤其是新型抗生素药物的敏感性情况，进行分子流行病学研究，并开展新型抗生素药物对MP的药效学评价工作。
Biography
张慧芬, 女, 本科, 副主任医师
Funding Statement
厦门市科技局计划项目（3502Z20144048）
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