孕妇B族链球菌定植及其早产儿感染状况的研究

Abstract

目的

探讨孕妇B族溶血性链球菌（GBS）定植及其分娩早产儿的GBS感染状况，评估早产儿GBS定植的危险因素。

方法

采用前瞻性队列研究方法，纳入2017年1月至2018年1月分娩的859例早产孕妇作为研究对象。入院时采集孕妇阴道下段1/3和直肠拭子行GBS培养，其中515例行实时PCR GBS DNA检测。采集所纳入孕妇分娩的早产儿的口咽分泌物、胃液或血液进行GBS培养。取孕妇外周血及其分娩的早产儿脐血测定抗GBS荚膜多糖抗体水平。调查早产儿GBS感染情况和影响定植的围产因素。

结果

859例孕妇阴道、直肠GBS培养阳性率为14.8%（127/859）。515例GBS DNA检测的阳性率为15.1%（78/515）。859例孕妇共分娩活产早产儿976例，其中43例（4.4%）GBS培养阳性；4例发生早发型GBS疾病，其中2例肺炎，2例早发型GBS败血症。127例GBS阳性孕妇分娩的127例早产儿中，34~ <37周早产儿组GBS阳性率明显低于 <34周早产儿组（P=0.013），抗GBS荚膜多糖抗体水平明显高于 <34周早产儿组（P=0.001）。多因素logistic回归分析显示胎膜早破>18 h和绒毛膜羊膜炎是早产儿GBS定植的独立危险因素（分别OR=6.556、6.160，均P < 0.05）。

结论

早产儿GBS阳性率及抗GBS荚膜多糖抗体水平与胎龄相关。胎膜早破>18 h和绒毛膜羊膜炎可增加早产儿GBS定植的风险。

B族链球菌（group B streptococcus, GBS）也称无乳链球菌，经常定植于妊娠女性的下消化道和泌尿生殖道，可引起新生儿早发型GBS疾病和晚发型GBS疾病，其中早发型GBS疾病可造成新生儿严重的肺炎、败血症、脑膜炎等，具有患病率、病死率、致残率高的特点^[1-2]。早产儿GBS败血症占新生儿早发型GBS败血症病例的25%和晚发型GBS败血症病例的50%，病死率约20%，其中胎龄 < 33周早产儿的病死率高达30%^[3]。国内刘婉文^[4]报道早产儿GBS定植率为14.93%，尚未有感染率的文献报道。本研究前瞻性分析厦门市妇幼保健院孕妇阴道、直肠GBS定植率及其分娩早产儿GBS定植和感染情况，以及早产儿GBS定植的围产期高危因素。

1. 资料与方法

1.1. 研究对象

研究对象为2017年1月至2018年1月在我院建档并分娩的15 573例孕妇。纳入标准：签署GBS研究知情同意书；孕37周前分娩；入院前1周内未使用抗生素。排除标准：产前诊断已明确胎儿畸形需要引产者；习惯性流产者。本研究最终共纳入859例孕妇，年龄18~41岁，平均年龄28.5±3.5岁；孕周28~36周，平均孕周34.2±1.5周。本研究经我院伦理委员会批准（批号：2015-007）。

1.2. 研究方法

（1）取材：孕妇入院时用2个拭子采集阴道下段1/3处和直肠的分泌物。一个拭子用于GBS培养，另一个用于荧光定量聚合酶链反应（PCR）技术进行GBS DNA检测。早产儿生后1 h内（使用抗生素前）采集口咽分泌物（机械通气患儿采集气管内分泌物）、胃液或血液（胃液和血培养适于临床出现感染征象并转入新生儿病房治疗的早产儿）送细菌培养。

（2）GBS培养：将拭子插入GBS TranSwab装置（购自中国台湾启新生物科技有限公司）塑胶试管内，置于35℃、二氧化碳培养箱培养24~48 h。根据试管内颜色判断结果，无颜色变化为GBS阴性，呈胡萝卜色为GBS阳性。早产儿口咽分泌物、气管内分泌物、胃液接种于哥伦比亚血平板（购自郑州贝瑞特生物技术有限责任公司），置于35℃、5%二氧化碳培养箱孵育48 h；血液置于血培养瓶进行培养，选取典型菌落用革兰染色和触酶试验初筛，对革兰阳性球菌和触酶阴性的可疑菌落采用PHOENIX 100全自动微生物鉴定仪（购自美国BD公司）进一步鉴定。

（3）GBS DNA检测：采用实时荧光定量PCR技术检测GBS DNA，试剂盒购自北京博尔诚有限公司，实时荧光定量核酸扩增仪（C1000型）为美国Bio-Rad公司产品。检测体系及判读方法参照试剂盒说明书。

（4）抗GBS荚膜多糖抗体测定：所有孕妇分娩前取外周血2 mL，其分娩早产儿生后取脐血2 mL，离心取血清保存于-20℃冰箱中备用。选择GBS定植阳性孕妇的血样本及其早产儿脐血，采用酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）方法检测抗GBS荚膜多糖抗体水平，试剂盒购自厦门恒泰行医疗科技有限公司，检测方法参照试剂盒说明书。

（5）产时抗生素预防（intrapartum antibiotic prophylaxis, IAP）：早产孕妇IAP依据围产期GBS预防指南^[2]：GBS定植状态不明的早产孕妇，入院时取阴道和直肠GBS样本后行青霉素治疗，临产早产孕妇予IAP治疗直到分娩，未临产早产孕妇可停止青霉素治疗，等待GBS检测结果。若GBS阳性或分娩发动前未获得结果，临产时开始IAP治疗；若GBS阴性，临产时无需预防。5周内GBS阴性早产孕妇临产时无需预防，若尚未临产但孕妇达35~37孕周或GBS阴性结果超过5周，应再次行GBS筛查。已知GBS定植阳性的早产孕妇在保胎期间应接受青霉素治疗48 h，临产时IAP治疗直到分娩。充分IAP定义为静脉注射青霉素或氨苄青霉素或头孢唑啉后4 h以上才分娩。未充分IAP的定义：青霉素或氨苄青霉素或头孢唑啉治疗时间短于4 h，或使用其他抗生素（如克林霉素、万古霉素）治疗^[5]。无IAP的定义：未使用任何抗生素。

（6）早产儿GBS定植和感染的诊断标准：GBS定植指从患儿身上分离出GBS但无感染症状^[6]。侵袭性GBS感染指在正常无菌部位（如血液、脑脊液、关节腔、胸膜腔、心包等部位）出现GBS的感染，伴有临床表现如脑膜炎、败血症或细菌性肺炎^[7]。

（7）分析内容：以GBS培养为金标准，计算GBS DNA检测的灵敏性和特异性。探讨早产孕妇GBS的定植率及其所生早产儿GBS的定植和感染情况，追踪GBS感染早产儿的临床结局。分析抗GBS荚膜多糖抗体与胎龄的关系，以及早产儿GBS定植的围产期高危因素。

1.3. 统计学分析

采用SPSS 19.0统计软件进行数据处理。正态分布的计量资料用均数±标准差（x ± s）表示，组间比较采用两独立样本t检验。计数资料采用例数及百分率（%）表示，组间比较采用χ²检验。采用多因素logistic回归模型分析围产因素对GBS定植孕妇所分娩早产儿GBS定植的影响。P < 0.05为差异有统计学意义。

2. 结果

2.1. 早产孕妇GBS定植情况

2017年1月至2018年1月期间，我院总分娩量为15 573例，早产发生率为5.72%（890/15 573）。本研究纳入的859例早产孕妇中，279例（32.5%）未发生胎膜早破，307例（35.7%）为未足月胎膜早破早产，273例（31.8%）治疗性早产。859例孕妇中，127例（14.8%）阴道和直肠GBS培养阳性。

859例孕妇中，515例同时进行GBS DNA检测，GBS DNA阳性78例，阳性率为15.1%。以GBS培养为金标准，GBS DNA检测的灵敏性、特异性、阳性预测值和阴性预测值见表 1。

1.

GBS培养和GBS DNA检测的灵敏性、特异性、阳性预测值和阴性预测值

GBS DNA结果	GBS培养阳性	GBS培养阴性	合计
注：灵敏性= 93.5%（72/77），特异性= 98.6%（432/438），阳性预测值= 92.3%（72/78）和阴性预测值= 98.9%（432/437）。
GBS DNA阳性	72	6	78
GBS DNA阴性	5	432	437
合计	77	438	515

2.2. 早产儿GBS定植和感染情况

859例孕妇共分娩活产早产儿976例，其中男574例，女402例，平均胎龄34.2±2.1周，平均出生体重2 247±532 g。976例早产儿中，43例（4.4%）GBS培养阳性；4例发生早发型GBS疾病（2例肺炎，2例早发型GBS败血症，其中1例败血症患儿并发GBS脑膜炎）。早产儿GBS定植和感染情况见图 1。

1.

早产儿GBS定植和感染情况

^#包括113例双胎（其中2例双胎死产），4例三胎，742例单胎，共娩出976例活产早产儿。

127例GBS培养阳性孕妇分娩的131例早产儿中，因双胎4例各取1胎分析，故纳入127例早产儿数据进行分析。根据胎龄，127例早产儿分为2组，即 < 34周组（41例）和34~ < 37周组（86例）。34~ < 37周组GBS阳性率明显低于 < 34周组，差异具有统计学意义（P=0.013），见表 2。

2.

不同胎龄早产儿GBS定植情况的比较   [例（%）]

胎龄分组	例数	GBS定植
		阳性	阴性
注：[GBS] B族链球菌。
< 34周	41	19(46)	22(54)
34 ~ < 37周	86	21(24)	65(76)
χ2值		6.184
P值		0.013

2.3. 抗GBS荚膜多糖抗体水平与胎龄的关系

不同胎龄早产儿的母亲抗GBS荚膜多糖抗体水平差异无统计学意义（P > 0.05）。与胎龄34~ < 37周比较，胎龄 < 34周早产儿抗GBS荚膜多糖抗体水平较低（P < 0.01）。见表 3。4例早期GBS疾病早产儿胎龄均小于34周，平均抗GBS荚膜多糖抗体水平为0.29 mg/L。

3.

胎龄与早产儿及其母亲抗GBS荚膜多糖抗体水平的关系（x ± s，mg/L）

胎龄分组	例数	早产儿抗GBS荚膜多糖抗体	母亲抗GBS荚膜多糖抗体
注：[GBS] B族链球菌。
< 34周	41	0.35±0.13	2.19±0.84
34 ~ < 37周	86	1.61±0.27	2.43±1.25
t值		34.805	1.148
P值		0.001	0.253

2.4. 早产儿GBS定植与围产因素的关系

为分析围产因素对GBS定植孕妇分娩早产儿GBS定植的影响，将127例GBS培养阳性孕妇分娩的127例早产儿分为GBS阳性组（40例）和GBS阴性组（87例），结果发现GBS阳性组中胎膜早破 > 18 h、生殖道炎症、绒毛膜羊膜炎的比例高于GBS阴性组（P < 0.01），见表 4。

4.

早产儿GBS定植阳性组和阴性组围产因素的比较   [例（%）]

组别	例数	流产史	剖宫产	胎膜早破 > 18 h	胎儿窘迫	生殖道炎症#	绒毛膜羊膜炎	充分产时抗生素预防
注：#不包括绒毛膜羊膜炎。[GBS] B族链球菌。
GBS定植阳性组	40	19(48)	21(52)	20(50)	5(12)	11(28)	9(22)	25(62)
GBS定植阴性组	87	35(40)	54(62)	10(11)	8(9)	8(9)	3(3)	44(51)
χ2值		0.593	1.038	22.519	0.326	7.216	11.624	0.910
P值		0.441	0.308	0.001	0.568	0.007	0.001	0.340

将单因素分析中差异有统计学意义的的3个变量引入多因素logistic回归方程，结果显示，早产儿GBS定植的独立危险因素为胎膜早破 > 18 h（OR=6.556，P=0.001）和绒毛膜羊膜炎（OR=6.160，P=0.018），见表 5。

5.

围产因素对早产儿GBS定植影响的多因素logistic回归分析结果

变量	B	SE	Wald χ2	P	OR	95%CI
						下线	上线
胎膜早破 > 18 h	1.880	0.486	14.992	0.001	6.556	2.531	16.983
绒毛膜羊膜炎	1.818	0.771	5.560	0.018	6.160	1.359	27.919
生殖道炎症	1.022	0.591	2.992	0.084	2.778	0.873	8.843
常量	-1.650	0.289	32.535	0.001	0.192

3. 讨论

孕妇GBS感染可导致胎膜早破、绒毛膜羊膜炎、早产等不良妊娠结局^[2]。GBS也是引起新生儿早期败血症和脑膜炎最常见的原因。目前，国内尚未对孕期GBS感染制定相应的指南，且缺乏新生儿GBS疾病发病率的流行病学调查。我院于2014~2015年对17 019例孕妇开展阴道GBS定植及新生儿感染的研究^[1]，结果显示阴道GBS定植率为14.43%，阴道GBS定植孕妇新生儿早发GBS疾病的发生率为1.05%，不足之处在于未区分足月儿及早产儿，且取材只用单一阴道拭子。

本研究中早产孕妇GBS定植率为14.8%（127/859），明显低于发达国家孕妇GBS定植率（20%~30%）^[8]，但与国内文献报道孕晚期阴道GBS定植率（14.43%）^[1]基本一致。GBS培养时最好使用选择性真菌肉汤培养基，能明显提高检出率，但细菌培养难度高，灵敏度有限，假阴性率高，漏诊率高，且耗时长（36~72 h）^[9]。PCR技术快速，最短30 min可得到阳性结果，150 min可得出阴性结果^[9-10]。2010年美国疾病控制与预防中心对围产期GBS疾病预防指南进行了修订，推荐使用PCR技术进行分娩时筛查^[2]。本研究发现，采用PCR方法诊断GBS的灵敏性为93.5%，特异性为98.6%，阳性预测值为92.3%，阴性预测值为98.9%，与文献报道^[10]一致，提示实时荧光定量PCR对于GBS具有非常好的诊断效能。因此，PCR技术适用于早产孕妇的GBS筛查，为合理地预防性应用抗生素提供依据。

2010年美国疾病控制与预防中心关于GBS预防诊疗指南^[2]指出，约30%孕妇定植GBS，其中40%~70%发生新生儿定植，1%~3%带菌的婴儿会早期出现侵入性感染。王丽娟等^[6]研究认为，一种细菌的定植率代表了发生该细菌感染的风险性。本研究取早产儿口咽分泌物、气管内分泌物及胃液检测GBS，能很好地反映GBS定植状态，结果提示早产儿GBS定植率为4.4%（43/976），早发GBS疾病发生率为4.1‰（4/976），高于Van Dyke等^[11]报道的早产儿早发型GBS感染率（0.73‰）。IAP策略实施后，欧美等发达国家新生儿早发GBS疾病的发病率从活产儿的2‰ ~3‰降至0.34‰（美国）、0.5‰（加拿大）或0.29‰（澳大利亚）^[12]。本研究中只有46.3%（398/859）的早产孕妇在分娩前接受充分的IAP治疗，这可能是本研究中早产儿早发GBS疾病发生率较高的主要原因。

早产儿单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子对GBS免疫应答缺陷^[13]；早产儿尤其是胎龄 < 34周早产儿缺乏来自母体抗GBS荚膜多糖抗体，降低了白细胞的调理吞噬活性^[14]。以上因素可导致早产儿对GBS感染易感性增高。国外病例对照研究发现，母亲抗GBS荚膜多糖抗体血清浓度≥1 mg/L，在分娩时可避免大多数新生儿发生早发GBS的Ⅰa型、Ⅲ型和Ⅴ型感染^[15]。本研究显示，GBS阳性孕妇分娩的127例早产儿中，34~ < 37周早产儿组GBS阳性率明显低于 < 34周早产儿组；GBS定植早产孕妇平均抗GBS荚膜多糖抗体≥1 mg/L，且与孕周无关；但胎龄 < 34周早产儿抗GBS荚膜多糖抗体水平明显低于≥34周早产儿，与既往文献[16]报道一致。我国小儿血清中抗GBS荚膜多糖抗体最小保护水平尚未明确，一般认为，0.5~2 mg/L是有效的^[17]。4例早发型GBS感染早产儿胎龄均 < 34周，平均抗体为0.29 mg/L，提示胎龄 < 34周的早产儿未能从母体获得足量的抗体，易遭受GBS病菌的入侵。因此，应重视早产儿尤其胎龄 < 34周早产儿GBS筛查，并及时予抗生素治疗，减少早产儿早发型GBS疾病的发生。

本研究显示，早产儿GBS定植与围产因素具有一定的相关性。在GBS定植阳性的早产孕妇中，早产儿GBS定植阳性组中胎膜早破 > 18 h、绒毛膜羊膜炎、生殖道炎症的比例高于GBS定植阴性组，提示具有以上3个围产因素之一的GBS定植孕母所分娩早产儿的GBS定植率高。进一步多因素logistic回归分析显示，胎膜早破 > 18 h和绒毛膜羊膜炎是早产儿GBS定植的独立危险因素。Chen等^[18]研究得出胎膜早破≥12 h是新生儿GBS定植的危险因素，本研究结果与之基本一致。Surve等^[19]发现，GBS的膜小囊通过产生细胞外基质，降解蛋白酶和孔隙形成毒素，使绒毛-蜕膜的大量胶原蛋白降解，失去防御能力，并使毒素更具侵袭性，从而导致绒毛膜羊膜炎及胎膜早破，进一步引起早产或死产。胎膜早破后胎儿可能吞咽或吸入GBS感染的羊水，导致新生儿细菌定植率的升高，从而增加了新生儿感染的风险。对GBS定植早产孕妇并发胎膜早破 > 18 h和绒毛膜羊膜炎者应高度重视，应用PCR技术检测孕母GBS定植状态并予IAP，对其分娩早产儿筛查GBS定植和感染状态，监测感染征象并及时给予抗生素治疗，以降低早发GBS疾病的发生率。林新祝等^[1]研究发现，GBS阳性孕妇给予充分IAP，其分娩的新生儿发生早发型GBS疾病的比例（0.94%）明显低于未充分IAP者（10.34%）。本研究中，早产儿GBS定植阳性组和阴性组母亲充分IAP的比例差异无统计学意义。另外，因早产儿GBS感染病例只4例，且只有1例母亲未予充分IAP治疗，无法行统计学分析，有待大样本进一步分析IAP是否对早产儿GBS感染产生影响。

综上所述，实时荧光定量PCR对于GBS具有非常好的诊断效能，早产儿GBS定植和感染发生率较高，胎膜早破 > 18 h和绒毛膜羊膜炎是早产儿GBS定植的独立危险因素。应高度重视围产期高危因素，采用PCR技术筛查早产孕妇GBS定植状态并产前使用IAP，同时重视GBS定植孕妇分娩的早产儿GBS的筛查，并及时给予抗生素治疗，是预防早产儿早发GBS疾病的重要措施。本研究不足之处为单中心研究，期待多中心、大样本、前瞻性研究来进一步分析早产孕妇GBS定植对其分娩早产儿的影响。

Biography

黄静, 女, 硕士, 副主任医师

Funding Statement

中加合作临床研究项目；2017年厦门市科技计划重大专项立项（3502Z20171006）