Abstract
目的
探讨血清miR-21-3p及其联合血肌酐（Scr）、胱抑素C（Cys-C）及肾损伤分子-1（KIM-1）对脓毒症患儿并发急性肾损伤（AKI）的预测价值。
方法
2016年1月至2019年3月诊断为脓毒症的患儿142例，根据是否并发AKI分为AKI组（n=49）和非AKI组（n=93）。检测两组血清miR-21-3p、Scr、Cys-C及KIM-1水平，绘制受试者工作特征（ROC）曲线分析血清miR-21-3p、Scr、Cys-C及KIM-1水平预测AKI的价值，Pearson相关分析血清miR-21-3p表达水平与Scr、Cys-C及KIM-1表达水平的相关性。
结果
AKI组血清miR-21-3p、Scr、Cys-C及KIM-1水平明显高于非AKI组（P < 0.05）。ROC曲线分析结果显示血清miR-21-3p、Scr、Cys-C及KIM-1水平四项联合预测脓毒症患儿并发AKI的曲线下面积（0.962，95% CI：0.906~0.998）均分别大于上述各单项指标预测的曲线下面积（P < 0.05），且敏感度（97.0%）和特异度（91.4%）最高。相关分析显示，AKI组血清miR-21-3p表达水平与Scr、Cys-C及KIM-1表达水平均呈正相关（r=0.704、0.812、0.863，P < 0.01）。
结论
血清miR-21-3p表达水平在脓毒症并发AKI患儿中明显升高，联合Scr、Cys-C及KIM-1指标对预测脓毒症并发AKI具有较高的价值。
Keywords: 脓毒症, 急性肾损伤, miR-21-3p, 儿童
Abstract
Objective
To study the value of serum miR-21-3p combined with serum creatinine (Scr), cystatin C (Cys-C), and kidney injury molecule-1 (KIM-1) in predicting acute kidney injury (AKI) in children with sepsis.
Methods
A total of 142 children who were diagnosed with sepsis from January 2016 to March 2019 were enrolled. According to the presence or absence of AKI, they were divided into AKI group with 49 children and non-AKI group with 93 children. The serum levels of miR-21-3p, Scr, Cys-C, and KIM-1 were measured for the two groups. The receiver operating characteristic (ROC) curve was plotted to analyze the value of serum miR-21-3p, Scr, Cys-C, and KIM-1 in predicting AKI. A Pearson correlation analysis was used to evaluate the correlation of serum miR-21-3p with Scr, Cys-C, and KIM-1.
Results
The AKI group had significantly higher serum levels of miR-21-3p, Scr, Cys-C, and KIM-1 than the nonAKI group (P < 0.05). The ROC curve analysis showed that the combination of serum miR-21-3p, Scr, Cys-C, and KIM-1 had an area under the ROC curve (AUC) of 0.962 (95%CI:0.906-0.998), which was significantly larger than the AUC of each index alone (P < 0.05), with a sensitivity of 97.0% and a specificity of 91.4%. The correlation analysis showed that the serum level of miR-21-3p was positively correlated with Scr, Cys-C, and KIM-1 in the AKI group (r=0.704, 0.812, and 0.863 respectively, P < 0.01).
Conclusions
There is a significant increase in the serum level of miR-21-3p in children with sepsis and AKI, and its combination with Scr, Cys-C, and KIM-1 has a high value in predicting AKI.
Keywords: Sepsis, Acute kidney injury, miR-21-3p, Child
急性肾损伤（acute kidney injury, AKI）是脓毒症患儿发展过程中最常见、最严重的并发症之一，可导致患儿住院时间延长，住院费用和病死率增加，已成为儿童急危重症的难题[1]。早期发现AKI，并进行及时、有效的临床干预，对改善脓毒症患儿的预后至关重要。目前，国内仍使用血肌酐（serum creatinine, Scr）、胱抑素C（cystatin C, Cys-C）及肾损伤分子-1（kidney injury molecule-1, KIM-1）评价早期肾损伤，但其敏感性不高，无法满足临床的需求。微小核糖核酸（microRNA, miRNA）作为一类新型的基因调控分子，广泛参与细胞增生、凋亡、免疫炎性反应等多种机体生物学过程的调控，在肾脏疾病的发生、发展及预后中发挥着重要的作用[2-3]。近期的研究发现，miR-21-3p是AKI发病的重要调控因子，通过多种机制参与AKI的发生发展，为理解AKI的发病机制提供了新的角度[4]。目前大多数研究是基于miR-21-3p在AKI发病中的作用机制，关于miR-21-3p预测脓毒症患儿并发AKI的价值尚未明确。本研究通过观察脓毒症患儿血清miR-21-3p、Scr、Cys-C及KIM-1水平，分析其预测AKI的价值，旨在为脓毒症患儿并发AKI的诊疗提供参考依据。
1. 资料与方法
1.1. 研究对象
选取2016年1月至2019年3月海南省第三人民医院收治的脓毒症患儿142例为研究对象，其中男89例，女53例，年龄7个月至12岁，平均年龄5.8±1.5岁。纳入标准：（1）符合脓毒症的诊断标准[5]；（2）在本院接受治疗且能配合本次研究者。排除标准：（1）长期应用激素、免疫抑制剂者；（2）既往有慢性肾脏病史，接受过肾脏手术，近期接受造影剂检查及使用过肾毒性药物者；（3）有恶性肿瘤、血液系统疾病、慢性肝病及自身免疫性疾病者。本研究经我院伦理委员会批准（HSYJ-20160113），并与患儿家属签署知情同意书。
1.2. 分组及资料收集
参考文献[6]的AKI诊断标准，根据是否并发AKI将脓毒症患儿分为AKI组（n=49）和非AKI组（n=93）。记录所有患儿入院时的年龄、性别、体重指数、基础疾病、感染部位、心率、呼吸、体温、尿量、急性生理学与慢性健康状况评分系统Ⅱ（Acute Physiology and Chronic Health Evaluation Ⅱ, APACHEⅡ）及序贯器官衰竭评分（Sequential Organ Failure Assessment, SOFA）等基本情况。
1.3. miR-21-3p检测
所有患儿均于入院次日采集空腹静脉血5 mL置于未加抗凝剂的离心管中，离心分离血清， -80℃冰箱中保存待测。按照RNA快速提取试剂盒说明书提取样本总RNA，逆转录为cDNA。以U6为内参照，引物的设计与合成由北京天根生物技术有限公司完成。miR-21-3p上游引物：5'-ACTCCTACGACTTAGACATG-3'，下游引物：5'-GACTGTATGCTGTCGTAG-3'，片段长度542 bp；U6上游引物：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'，片段长度386 bp。在ABI 7500型荧光定量PCR仪（美国ABI公司）上进行实时荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）。反应体系为20 μL：TaqMan MicroRNA Assay 1.0 μL，cDNA 1.3 μL，上下游引物各2.0 μL，TaqMan 2×Universal PCR Master Mix 10.0 μL，ddH2O 3.7 μL，混合后离心放入定量PCR仪。扩增条件为：95℃预变性10 min；95℃变性15 s，60℃退火60 s，45个循环。采用2-△△Ct法计算miR-21-3p的相对表达水平。
1.4. 观察指标
所有患儿均于入院次日采集空腹静脉血5 mL置于未加抗凝剂的离心管中，置37℃水浴箱中水浴30 min后，以3 500 r/min离心10 min，分离血清保存于-80℃冰箱中待检。采用微粒子酶免疫分析法检测Scr及Cys-C水平，采用酶联免疫法检测KIM-1水平，试剂盒由德国西门子公司提供。
1.5. 统计学分析
采用SPSS 20.0统计软件对数据进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用两样本t检验。计数资料用率（%）表示，两组间的比较采用χ2检验。绘制受试者工作特征（receiver operating characteristic, ROC）曲线分析血清miR-21-3p、Scr、Cys-C及KIM-1水平预测AKI的价值，曲线下面积（area under cure, AUC）比较采用Z检验。相关性分析采用Pearson相关分析。P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1. 两组临床一般资料
两组的性别、年龄、体重指数、感染部位分布、心率、呼吸及体温比较，差异均无统计学意义（P > 0.05）。非AKI组的尿量多于AKI组，APACHEⅡ评分及SOFA评分低于AKI组（P < 0.05）。见表 1。
1.
两组临床一般资料比较
| 一般资料 | 非AKI组(n=93) | AKI组(n=49) | χ2/t值 | P值 |
| 注：[APACHE Ⅱ]急性生理学与慢性健康状况评分系统Ⅱ；[SOFA]序贯器官衰竭评分。 | ||||
| 男/女(例) | 57/36 | 32/17 | 0.221 | 0.638 |
| 年龄(x±s, 岁) | 5.9±1.6 | 5.6±1.4 | 0.893 | 0.410 |
| 体重指数(x±s, kg/m2) | 17.6±2.3 | 17.2±2.2 | 0.827 | 0.492 |
| 感染部位[n(%)] | ||||
| 肺部感染 | 38(41) | 23(47) | 0.351 | 0.540 |
| 腹腔感染 | 24(26) | 14(29) | ||
| 皮肤软组织感染 | 9(10) | 3(6) | ||
| 泌尿系统感染 | 3(3) | 1(2) | ||
| 颅内感染 | 5(5) | 3(6) | ||
| 血源性感染 | 14(15) | 5(10) | ||
| 心率(x±s, 次/mim) | 115±6 | 118±7 | 0.671 | 0.563 |
| 呼吸(x±s, 次/mim) | 25±3 | 27±4 | 0.982 | 0.337 |
| 体温(x±s, ℃) | 37.4±1.0 | 37.6±1.2 | 0.704 | 0.542 |
| 尿量[x±s, mL/(kg · h)] | 1.87±0.35 | 1.40±0.22 | 4.108 | 0.043 |
| APACHEⅡ评分(x±s) | 14±4 | 17±5 | 4.813 | 0.020 |
| SOFA评分(x±s) | 4.2±2.4 | 5.6±2.7 | 4.294 | 0.037 |
2.2. 两组血清miR-21-3p、Scr、Cys-C及KIM-1水平变化
AKI组血清miR-21-3p、Scr、Cys-C及KIM-1水平明显高于非AKI组，差异均有统计学意义（P < 0.05），见表 2。
2.
两组血清miR-21-3p、Scr、Cys-C及KIM-1水平比较 （x±s）
| 组别 | n | miR-21-3p | Scr (µmol/L) | Cys-C (mg/L) | KIM-1 (µg/L) |
| 注：[Scr]血肌酐；[Cys-C]胱抑素C；[KIM-1]肾损伤分子-1。 | |||||
| 非AKI组 | 93 | 0.86±0.24 | 93±11 | 0.61±0.17 | 4.8±0.6 |
| AKI组 | 49 | 2.37±0.92 | 459±83 | 1.90±0.64 | 23.2±6.4 |
| t值 | 16.204 | 8.472 | 10.418 | 12.603 | |
| P值 | < 0.001 | < 0.001 | < 0.001 | < 0.001 | |
2.3. 血清miR-21-3p、Scr、Cys-C及KIM-1水平预测AKI的价值
血清miR-21-3p、Scr、Cys-C及KIM-1水平预测脓毒症患儿并发AKI的最佳截断值分别为1.75、330.70 μmol/L、1.28 mg/L、17.20 μg/L，其中血清miR-21-3p表达水平预测脓毒症患儿并发AKI的敏感度（87.5%）和特异度（81.6%）最高。四项指标联合预测脓毒症患儿并发AKI的AUC均分别高于单项miR-21-3p、Scr、Cys-C及KIM-1预测脓毒症患儿并发AKI的AUC（Z=4.794、7.405、6.502、6.273，P < 0.05），其敏感度和特异度分别为97.0%和91.4%。见表 3和图 1。
3.
血清miR-21-3p、Scr、Cys-C及KIM-1水平预测AKI的价值
| 指标 | 最佳截断值 | AUC(95%CI) | 敏感度(%) | 特异度(%) | 阳性预测值(%) | 阴性预测值(%) |
| 注：[Scr]血肌酐；[Cys-C]胱抑素C；[KIM-1]肾损伤分子-1。 | ||||||
| miR-21-3p | 1.75 | 0.863(0.804~0.920) | 87.5 | 81.6 | 83.5 | 86.0 |
| Scr | 330.70 μmol/L | 0.738(0.680~0.802) | 72.4 | 71.8 | 74.5 | 70.0 |
| Cys-C | 1.28 mg/L | 0.802(0.745~0.857) | 81.2 | 74.0 | 71.6 | 85.3 |
| KIM-1 | 17.20 μg/L | 0.820(0.765~0.886) | 83.0 | 75.4 | 78.5 | 80.6 |
| 四项联合 | - | 0.962(0.906~0.998) | 97.0 | 91.4 | 94.2 | 95.3 |
1.
血清miR-21-3p、Scr、Cys-C及KIM-1水平预测AKI的ROC曲线
2.4. 血清miR-21-3p表达水平与Scr、Cys-C及KIM-1表达水平的相关性分析
Pearson相关分析显示，AKI组血清miR-21-3p表达水平与血清Scr、Cys-C、KIM-1均呈正相关（分别r=0.704、0.812、0.863，P < 0.01），见图 2。
2.
血清miR-21-3p水平与Scr、Cys-C及KIM-1水平的相关分析图
3. 讨论
儿童AKI是由脓毒症引发的一种常见急危重症，其病情进展迅速，病死率较高，已成为儿童重症监护室发生死亡的主要原因之一。目前，由于缺乏对AKI早期预测的敏感特异指标，在临床实践中往往错过了对AKI的早期诊断及干预的最佳时机。因此，探索预测脓毒症患儿AKI的生物标志物来协助诊断显得尤为重要。miRNA是一类长度为18~25个核苷酸组成的内源性单链非编码RNA分子，通过影响细胞缺血缺氧、细胞的分化、增殖、代谢和凋亡等多种病理过程或信号通路，产生细胞损伤作用，从而参与AKI的调控[7]。有研究表明，miRNA通过多种机制参与不同病因所导致的AKI发病，是AKI发病的重要调控因子，且是AKI早期诊断和预后预测的生物标志物[8]。Pu等[9]动物实验研究发现，miR-21-3p在大鼠AKI中明显上调，且其升高先于血尿素氮和肌酐，可能成为早期诊断AKI的一个新的潜在生物标记物。Gaede等[10]研究显示，在心脏手术后AKI患者中血清miR-21水平显著升高，miR-21水平对AKI的发生具有较好的预测价值，有助于术前风险评估和围手术期的诊断和治疗。
本研究显示，AKI组血清miR-21-3p、Scr、Cys-C及KIM-1水平明显高于非AKI组，提示血清miR-21-3p表达水平可能参与AKI的发生发展。Zhang等[11]研究表明，miRNA在脓毒症继发AKI的患者中显著升高，能反映疾病的严重程度，其水平越高脓毒症患者病死率越高，可能成为AKI新的诊断标志物及治疗靶点。Xie等[12]研究认为，KIM-1能迅速反映近曲小管的损伤，对肾脏功能损害具有较高的特异度和敏感度，可用于AKI的早期预测。魏薇等[13]研究显示，miR-21水平升高是脓毒症合并AKI患者发生死亡的独立危险因素，在评估脓毒症合并AKI患者死亡中具有良好的预测价值，为AKI的发病及其早期诊断治疗提供依据。王军宇等[14]研究发现，Cys-C及KIM-1水平升高是发生AKI的独立危险因素，且与AKI的严重程度有关，可作为预测急诊危重症患者7 d内AKI发生的敏感指标。本研究进一步应用ROC曲线分析显示，血清miR-21-3p、Scr、Cys-C及KIM-1水平预测脓毒症患儿并发AKI的最佳截断值分别为1.75、330.70 μmol/L、1.28 mg/L、17.20 μg/L，与各单项指标相比，四项指标联合预测脓毒症患儿并发AKI的AUC最大，敏感度和特异度最高。相关分析也显示，AKI组血清miR-21-3p表达水平与Scr、Cys-C及KIM-1表达水平均呈正相关，进一步说明miR-21-3p与Scr、Cys-C及KIM-1联合检测有助于提高AKI早期诊断的准确性。钟开义等[15]研究发现，血清miR-21表达水平在AKI患者中明显升高，且与患者的病情严重程度相关，有望作为AKI诊断及预后评估的新型生物标志物。另有研究表明，miR-21在肾缺血再灌注损伤中发挥重要作用，可作为AKI早期诊断及病情进展的生物标志物，并可用于预测心脏术后AKI的预后情况[16]。
综上所述，血清miR-21-3p表达水平在脓毒症并发AKI患儿中明显升高，有望作为AKI早期预测的新型生物标志物，联合Scr、Cys-C及KIM-1对预测AKI具有较高的价值，同时也为研究AKI的发病机制及治疗靶点提供了新的角度。但本研究仍存在很多局限性，如病例来源较单一，临床试验较少、检测的miRNA数量少等，未来仍需更多系统的基础性研究来进一步验证miR-21-3p在AKI中的临床应用价值。
Biography
吴仕燕, 女, 本科, 主治医师。Email:1485516393@qq.com
Funding Statement
海南省医学科研基金（17A300618）
References
- 1.Anigilaje EA, Adebayo AI, Ocheni SA. Acute kidney injury in children:a study of etiology, clinical profile, and shortterm outcomes at the University of Abuja Teaching Hospital, Gwagwalada, Abuja, Nigeria. Saudi J Kidney Dis Transpl. 2019;30(2):421–439. doi: 10.4103/1319-2442.256849. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 2.Baker MA, Davis SJ, Liu P, et al. Tissue-specific microRNA expression patterns in four types of kidney disease. J Am Soc Nephrol. 2017;28(10):2985–2992. doi: 10.1681/ASN.2016121280. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 3.Ma J, Wang Y, Xu HT, et al. MicroRNA:a novel biomarker and therapeutic target to combat autophagy in diabetic nephropathy. http://d.old.wanfangdata.com.cn/Periodical/shandykdxxb201312012t. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2019;23(14):6257–6263. doi: 10.26355/eurrev_201907_18446. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 4.Lin Z, Liu Z, Wang X, et al. MiR-21-3p plays a crucial role in metabolism alteration of renal tubular epithelial cells during sepsis associated acute kidney injury via AKT/CDK2-FOXO1 pathway. Biomed Res Int. 2019;16:2821731. doi: 10.1155/2019/2821731. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 5.中华医学会儿科学分会急救学组, 中华医学会急诊医学分会儿科学组, 中国医师协会儿童重症医师分会 儿童脓毒性休克(感染性休克)诊治专家共识(2015版) 中华儿科杂志. 2015;53(8):576–580. doi: 10.3760/cma.j.issn.0578-1310.2015.08.007. [DOI] [Google Scholar]
- 6.Khwaja A. KDIGO clinical practice guidelines for acute kidney injury. http://med.wanfangdata.com.cn/Paper/Detail/PeriodicalPaper_PM22890468. Nephron Clin Pract. 2012;120(4):c179–c184. doi: 10.1159/000339789. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 7.Jones TF, Bekele S, O'Dwyer MJ, et al. MicroRNAs in acute kidney injury. Nephron. 2018;140(2):124–128. doi: 10.1159/000490204. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 8.Malhotra R, Siew ED. Biomarkers for the early detection and prognosis of acute kidney injury. Clin J Am Soc Nephrol. 2017;12(1):149–173. doi: 10.2215/CJN.01300216. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 9.Pu XY, Shen JY, Deng ZP, et al. Plasma-specific microRNA response induced by acute exposure to aristolochic acid Ⅰ in rats. Arch Toxicol. 2017;91(3):1473–1483. doi: 10.1007/s00204-016-1791-y. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 10.Gaede L, Liebetrau C, Blumenstein J, et al. Plasma microRNA-21 for the early prediction of acute kidney injury in patients undergoing major cardiac surgery. Nephrol Dial Transplant. 2016;31(5):760–766. doi: 10.1093/ndt/gfw007. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 11.Zhang J, Wang CJ, Tang XM, et al. Urinary miR-26b as a potential biomarker for patients with sepsis-associated acute kidney injury:a Chinese population-based study. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2018;22(14):4604–4610. doi: 10.26355/eurrev_201807_15518. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 12.Xie Y, Wang Q, Wang C, et al. Association between the levels of urine kidney injury molecule-1 and the progression of acute kidney injury in the elderly. PLoS One. 2017;12(2):e0171076. doi: 10.1371/journal.pone.0171076. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 13.魏 薇, 翟 哲, 毕 宏远, et al. miR-21和miR-107-5p对脓毒症所致急性肾损伤患者28天生存率影响. 国际遗传学杂志. 2018;41(4):266–272. doi: 10.3760/cma.j.issn.1673-4386.2018.04.006. [DOI] [Google Scholar]
- 14.王 军宇, 张 达, 梅 雪. 尿肾损伤分子-1及血清半胱氨酸蛋白酶抑制剂C对急诊危重症患者急性肾损伤的预测价值. 中国急救医学. 2018;38(2):118–122. doi: 10.3969/j.issn.1002-1949.2018.02.006. [DOI] [Google Scholar]
- 15.钟 开义, 黎 宝仁, 张 祖文, et al. 血清miR-21及miR-155对急性肾损伤的诊断及预后评估价值. 中国免疫学杂志. 2018;34(12):1861–1865. doi: 10.3969/j.issn.1000-484X.2018.12.021. [DOI] [Google Scholar]
- 16.Arvin P, Samimagham HR, Montazerghaem H, et al. Early detection of cardiac surgery-associated acute kidney injury by microRNA-21. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29198131. Bratisl Lek Listy. 2017;118(10):626–631. doi: 10.4149/BLL_2017_120. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]