Abstract
目的
分析血清miR-17-92基因簇对视网膜母细胞瘤（RB）的诊断价值。
方法
采用实时定量PCR法检测20例RB患儿、20名健康对照者的血清miR-17-92基因簇表达水平，分析其在不同分期RB患儿的表达差异及综合治疗前后的变化，并采用ROC曲线判断其对RB的诊断价值。
结果
RB患儿血清中miR-17-92基因簇成员miR-17-3P、miR-17-5P、miR-18a和miR-20a的相对表达量均高于健康对照组，以miR-18a升高更为显著，差异均有统计学意义（P < 0.05）；两组miR-19a、miR-19b-1和miR-92a-1相对表达量的差异无统计学意义（P > 0.05）。miR-17-5P、miR-17-3P、miR-18a和miR-20a表达量在早中期和晚期RB患儿之间的差异均无统计学意义（P > 0.05），但综合治疗后表达量显著降低（P < 0.05）。miR-17-3P、miR-17-5P、miR-18a和miR-20a对RB诊断价值的曲线下面积（AUC）分别为0.770、0.755、0.828和0.665，以miR-18a的AUC最大，并具有较好的灵敏度（90%）和特异度（65%）。
结论
miR-17-92基因簇的miR-17-3P、miR-17-5P、miR-18a和miR-20a在RB患儿血清中高表达，miR-18a有可能作为RB诊断的新指标。
Keywords: 视网膜母细胞瘤, 微小核糖核酸, 诊断, 儿童
Abstract
Objective
To investigate the value of serum miR-17-92 cluster in the diagnosis of retinoblastoma (RB).
Methods
Serum samples were collected from 20 children with RB and 20 healthy controls. Quantitative real-time PCR was used to measure the expression of miR-17-92 cluster. The expression of miR-17-92 cluster was compared between children with different stages of RB and the changes in the expression of miR-17-92 cluster after multimodality therapy were analyzed. The receiver operating characteristic (ROC) curve was used to investigate the value of serum miR-17-92 cluster in the diagnosis of RB.
Results
Compared with the healthy controls, the children with RB had signifcantly higher relative expression of miR-17-3P, miR-17-5P, miR-18a, and miR-20a in serum (P < 0.05), and miR-18a showed the greatest increase. There were no signifcant differences in the relative expression of miR-19a, miR-19b-1, and miR-92a-1 between children with RB and healthy controls (P > 0.05). There were no signifcant differences in the expression of miR-17-5P, miR-17-3P, miR-18a, and miR-20a between the children with early-to-moderate stage of RB and those with advanced stage of RB (P > 0.05), but there were signifcant reductions after multimodality therapy (P < 0.05). In the diagnosis of RB, the areas under the ROC curve (AUCs) for serum miR-17-3P, miR-17-5P, miR-18a, and miR-20a were 0.770, 0.755, 0.828, and 0.665 respectively, and miR-18a had the largest AUC, with a sensitivity of 90% and a specifcity of 65%.
Conclusions
miR-17-3P, miR-17-5P, miR-18a, and miR-20a are highly expressed in the serum of children with RB, and miR-18a may be used as a new marker for the diagnosis of RB.
Keywords: Retinoblastoma, microRNA, Diagnosis, Child
视网膜母细胞瘤（retinoblastoma, RB）是一种起源于视网膜胚胎性核层细胞的恶性肿瘤，是婴幼儿最常见、危害性最大的原发性眼内恶性肿瘤，由于缺乏特异性的检测手段，致使其难以早期诊断[1]。在发展中国家对RB的延迟诊断达6个月以上，导致死亡率增加70%[2]。提高我国RB患儿的早期诊断水平是挽救患儿生命、提高存活率的关键。microRNA（miRNA或miR）是一类广泛存在于生物体的18~24个核苷酸的内源性非编码小RNA，通过与目标mRNA特定区域不同程度的互补结合而引起后者的降解或者翻译抑制，在多种恶性肿瘤中表达，并调控细胞增殖、侵袭转移。miR-17-92基因簇是一种有效的microRNA编码癌基因，定位于人染色体13q31-q32上，可产生miR-17-3p、miR-17-5p、miR-18a、miR-19a、miR-19b-1、miR-20a和miR-92a-1等7个成熟的miRNA[3]。miR 17-92基因簇可能与RB发生发展有关。Lillington等[4]、Kandalam等[5]研究发现，miR 17-92基因簇在原发性RB中过度表达，而上皮细胞粘附分子的抑制剂可导致miR 17-92基因簇表达减少，进而细胞增殖、侵袭能力降低。但国内未见miR-17-92基因与视网膜母细胞瘤发生发展关系的研究报道。本研究通过实时定量PCR（real-time quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction, qRT-PCR）检测miR-17-92基因簇在RB患儿和健康对照者的表达，分析不同分期RB和其综合治疗前后的miR-17-92基因表达水平的差异，初步探讨其对RB的诊断价值，为提高RB诊断率及改善预后提供理论依据。
1. 资料与方法
1.1. 研究对象
选择2013年1月至2017年1月于深圳市眼科医院确诊及深圳市人民医院接受化疗，且临床资料完整的20例RB患儿为研究对象。RB患儿根据眼部表现，尤其是典型眼底改变，再结合眼部CT、双眼彩色超声多普勒、眼底照相和/或眼球摘除后的病理检查确诊。患儿年龄3~57个月，平均20±17个月；男11例（55 %），女9例（45%）；单眼受累14例（70%），双眼6例（30%）。局限于眼球内的肿瘤采用国际RB分期（intraocular international retinoblastoma classify, IIRC）分为A~E期[6]。双眼RB患儿按病情较重侧患眼的分期参与研究。20例患儿中A~C期（早中期）5例、D~E期（晚期）15例（D期9例+E期6例）。对照组选取同期我院健康体检儿童20例，其中男性10例、女性10例，年龄4~56个月、平均23±18个月。病例组和对照组在年龄、男女比例方面的差异无统计学意义。本研究获得医院伦理委员会批准，及研究对象监护人知情同意。
1.2. 治疗方案
RB患儿采用以化疗为主结合激光光凝、冷凝及眼球摘除手术等综合治疗原则[6]。20例患儿均以化疗为基础，结合激光治疗者4例，冷凝处理者2例，手术眼球摘除者11例。化疗采用卡铂、依托泊苷和长春新碱三联方案[7-8]，由儿科医生负责；而激光光凝、冷凝及眼球摘除手术等则由眼科医师负责。对于早期发现的体积较小且较为局限的RB，采用激光光凝或冷凝等治疗，具体方案根据肿瘤的位置和大小制定。部分早期保眼患儿经过化疗后病情仍进展，需行眼球摘除手术。所有病例均定期于眼科医院随诊、评估。
1.3. qRT-PCR检测miR-17-92基因簇表达
采集病例组综合治疗前、化疗后1周内以及健康对照组的空腹静脉血3 mL，1 500 r/min离心10 min，收集血清，保存备检。
取100 μL样品加入300 μL焦碳酸二乙酯水，提取总RNA，-80℃保存备用。采用所提取的RNA与AMV（avian myeloblastosis virus）逆转录酶（Takara公司）、逆转录引物（ABI公司）等制备逆转录体系，合成cDNA。
参照Taqman miRNA（ABI公司）qRT-PCR说明书制备反应体系，于ABI Prism 7300荧光定量PCR仪中行扩增和荧光信号检测，反应条件：95℃预变性15 min；95℃变性15秒，60℃退火60秒，共40个循环。采用2-△△CT法计算各目标miRNA相对表达量，结果用倍数表示[9]。所有样本均重复验证，每个样本独立重复试验3次。
1.4. 统计学分析
采用SPSS 17.0统计软件进行数据处理。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两个独立样本组间比较采用t检验；计数资料以百分率表示，采用χ2检验。采用ROC曲线下面积（area under the curve, AUC）反映血清miRNA诊断的准确性。AUC=0.5表示无诊断价值；0.5 < AUC≤0.7，表示诊断准确性较低；0.7 < AUC≤0.9，表示准确性中等；0.9 < AUC < 1，表示诊断准确性较高；AUC=1表示理想的诊断价值。取ROC曲线中最靠近左上角的一点做为预测诊断临界值，其灵敏度和特异度之和最大。P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1. 两组miR-17-92基因簇的相对表达量
RB患儿血清中miR-17-92基因簇成员miR-17-3P、miR-17-5P、miR-18a和miR-20a的相对表达量均高于对照组，以miR-18a升高更为显著，差异均有统计学意义（P < 0.05）；而两组间miR-19a、miR-19b-1和miR-92a-1相对表达量的差异无统计学意义（P > 0.05）。见表 1。
1.
两组miR-17-92基因簇的相对表达量的比较（x±s）
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2.2. 不同分期RB患儿的miR-17-5P、miR-17-3P、miR-18a和miR-20a表达比较
miR-17-5P、miR-17-3P、miR-18a和miR-20a表达量在早中期（IIRC分期A~C期）和晚期（IIRC分期D~E期）RB患儿之间的差异无统计学意义（P > 0.05），见表 2。
2.
同分期RB患儿的miR-17-5P、miR-17-3P、miR-18a和miR-20a表达比较（x±s）
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2.3. miR-17-5P、miR-17-3P、miR-18a和miR-20a在RB患儿综合治疗前后的表达比较
研究过程中脱落3例，共计17例RB患儿完成综合治疗，与治疗前相比，治疗后miR-17-5P、miR-17-3P、miR-18a和miR-20a相对表达量减少（P < 0.05），见表 3。
3.
miR-17-5P、miR-17-3P、miR-18a和miR-20a在RB患儿治疗前后的表达（x±s）
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2.4. miR-17-3P、miR-17-5P、miR-18a和miR-20a对RB诊断价值的ROC曲线分析
miR-17-3P、miR-17-5P、miR-18a和miR-20a对RB诊断价值的ROC曲线分析显示，miR-18a的AUC最大，对诊断RB具有较好的灵敏度（90%）和特异度（65%），见表 4和图 1。
4.
miR-17-3P、miR-17-5P、miR-18a和miR-20a对RB诊断价值的ROC曲线分析
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1.
miR-17-3P、miR-17-5P、miR-18a和miR-20a对RB诊断价值的ROC曲线分析
3. 讨论
我国每年报告新发视网膜母细胞瘤（RB）病例约1 300例，约85%的RB患儿发病年龄 < 5岁，占儿童致盲原因的5%[10]。RB在美欧国家存活率可高达95%~100%，因早期诊断保存了一部分视力[11]；而欠发达国家包括我国在内的RB患儿诊断时多为高风险的晚期，常伴有复发转移，眼球摘除率较高。神经元特异性稀醇化酶（neuron-specific enolase, NSE）是目前临床广泛采用的RB肿瘤标志物，但神经母细胞瘤等其它恶性肿瘤也可使其增高，存在较高的假阳性率[12]。因此，寻找新的敏感的RB肿瘤标记物具有十分重要的意义。
miR-17-92基因簇在部分肿瘤高表达已被证实[13-16]。Conkrite等[17]发现，在成年小鼠和人类的RB中，miR-17-92基因簇均呈高表达，miR-17-92过表达可抑制细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂上调，促进增殖，驱动视网膜母细胞瘤形成。Nittner等[18]研究表明，miR-17-92失活可抑制小鼠成视网膜细胞瘤形成，并且miR-17/20a和p53的共沉默协同降低了人视网膜细胞瘤细胞的存活。说明miR-17-92基因簇表达与RB关系密切，有可能作为候选肿瘤标记物诊断RB。本研究发现，RB患儿血清miR-17-3P、miR-17-5P、miR-18a和miR-20a相对表达量较对照组升高，与Kandalam等[5]研究基本一致。结果还显示，miR-17-92基因簇表达量升高最多的是miR-18a，与Yang等[19]报道一致，提示miR-18a可能可作为RB的诊断标志物。本研究RB患儿血清miR-17-3P、miR-17-5P、miR-18a和miR-20a在RB早中期和晚期患儿之间的表达差异并无统计学意义，说明miR-17-3P、miR-17-5P、miR-18a和miR-20a可能在RB早期即已参与RB的发生发展，显示出作为RB肿瘤标志物的优势。综合治疗后RB患儿miR-17-3P、miR-17-5P、miR-18a和miR-20a相对表达量明显降低，提示这4种miRNA有可能可作为RB随访监测的指标。miR-17-3P、miR-17-5P、miR-18a和miR-20a的ROC曲线分析显示，miR-18a的AUC最大、并具有较好的灵敏度（90%）和特异度（65%）。提示miR-18a对于RB诊断可能具有较高的价值，扩大样本量、并进行治疗后的随访监测以进一步验证其诊断价值。随着人们对miRNAs在RB发生、发展和转移作用的研究不断深入，miR-17-92基因簇不仅有望作为RB肿瘤标志物，在RB的早期诊断中起到重要作用，还可能作为肿瘤生物治疗的靶点，为RB的预防、临床诊断、预后和靶向治疗提供新的契机。研究显示，SD-208[转化生长因子（TGF）-β RI激酶抑制剂]可以通过调节包括miR-17-92簇在内的一些miRNA表达而发挥抗癌作用，表明SD-208可能是视网膜母细胞瘤治疗的替代药物[20]。Jo等[21]研究显示，细胞信号激活和转录因子3（signal transducer and activator of transcription 3, STAT3）的激活与视网膜母细胞瘤细胞中miR-17-92基因簇上调相关，STAT3抑制剂可能可作为是视网膜母细胞瘤新的治疗方法。
综上所述，miR-17-92基因簇中miR-17-3P、miR-17-5P、miR-18a和miR-20a在RB患儿表达增加，可能参与了RB的发生发展过程，其中以miR-18a相对表达量最大和曲线下面积最大，有可能做为RB诊断的筛查指标。
Biography
陈言钊, 男, 硕士, 主治医师
Funding Statement
深圳市卫生计生系统科研项目（编号：20151007）
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