需肌醇酶1介导的内质网应激通路参与高氧所致早产大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡

Abstract

目的

探讨需肌醇酶1（IRE1）介导的内质网应激通路与高氧暴露肺泡Ⅱ型上皮细胞（AEC Ⅱ）凋亡的关系。

方法

原代培养早产大鼠AEC Ⅱ，随机分为空气组和高氧组，建立高氧细胞损伤模型。在24、48及72 h收集细胞，倒置相差显微镜观察细胞形态变化；Annexin V/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡；RT-PCR及Western blot分别检测葡萄糖调节蛋白78（GRP78）、IRE1、X盒结合蛋白1（XBP1）及C/EBP同源蛋白（CHOP）mRNA及蛋白表达；免疫荧光检测CHOP表达。

结果

随着给氧时间延长，高氧组AEC Ⅱ伸展呈不规则形，出现空泡样改变；高氧组AEC Ⅱ凋亡率与同时间点空气组比较明显增加（P < 0.05）；随着氧暴露时间延长，高氧组GRP78、IRE1、XBP1及CHOP mRNA及蛋白表达升高，且较同时间点空气组明显上升（P < 0.05）；高氧组CHOP荧光强度高于同时间点空气组。高氧组CHOP蛋白表达与AEC Ⅱ凋亡率、IRE1及XBP1蛋白表达呈显著正相关（r=0.97、0.85、0.88，均P < 0.05）。

结论

高氧所致AEC Ⅱ凋亡可能是通过激活IRE1-XBP1-CHOP通路来实现。

支气管肺发育不良（bronchopulmonary dysplasia, BPD）是威胁早产儿，特别是小早产儿生存及生活质量的常见呼吸系统疾病。高浓度氧治疗是早产儿BPD主要原因之一^[1]，但具体发病机制尚不十分清楚。肺泡Ⅱ型上皮细胞（type Ⅱ alveolar epithelial cell, AECⅡ）是肺内主要干细胞，研究发现^[2]，AECⅡ高氧损伤及凋亡在BPD形成中起重要作用。AECⅡ内质网丰富，具有发生内质网应激（endoplasmic reticulum stress, ERS）的结构基础。内质网应激相关凋亡是近年研究热点，与多种肺部疾病有关^[3-4]。我们前期利用早产大鼠BPD模型研究已发现^[5]，高氧暴露后早产大鼠肺组织C/EBP同源蛋白（CHOP）表达明显增高，CHOP途径参与BPD中肺细胞凋亡。需肌醇酶1（inositol-requiring kinase 1, IRE1）是ERS感受信号之一，ERS状态下IRE1剪切X盒结合蛋白1（X-box binding protein-1, XBP1）前体mRNA生成编码XBP1s的mRNA，XBP1s可诱导下游ERS特异CHOP凋亡蛋白表达。已有研究指出^[6]，IRE1-XBP1-CHOP途径与非小细胞肺癌细胞凋亡密切相关。而IRE1-XBP1-CHOP途径与AECⅡ凋亡的关系目前研究甚少。本实验拟建立原代培养早产大鼠AECⅡ细胞高氧损伤模型，进一步从细胞层面探讨IRE1-XBP1-CHOP通路是否与AECⅡ凋亡相关。

1. 材料与方法

1.1. 材料

IV胶原酶（Sigma公司，美国）；D/F12培养基（Hyclone公司，美国）；胰蛋白酶（Invitrogen公司，美国）；胎牛血清（Serpro公司，德国）；双抗（Invitrogen公司，美国）；SDS-PAGE配胶试剂盒（长沙艾佳生物技术有限公司）；TRIzol（Invitrogen公司，美国）；Prime-Script RT reagent Kit试剂盒、SYBR Premix Ex Taq^TM试剂盒（TaKaRa公司，日本）；兔抗大鼠β-actin、葡萄糖调节蛋白78（GRP78）、IRE1、XBP1s及CHOP单克隆抗体（CST公司，美国）；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG（CST公司，美国）；山羊抗兔IgG、FITC（北京康为世纪生物技术有限公司）；FITC AnnexinV/PI流式试剂盒（BD公司，美国）；ECL（Millipore公司，美国）；引物由上海生工生物工程公司设计及合成（表 1）；CYS-1数字式测氧仪（上海嘉定学联仪表厂）。

1.

引物序列

1.2. AECⅡ高氧损伤模型建立及分组

雌性清洁级Sprague-Dawley（SD）大鼠，体重200~220 g，雄性清洁级SD大鼠，体重220~250 g，由江苏大学实验动物中心提供。SD雌雄鼠按3：1合笼交配，次日晨取雌鼠阴道分泌物涂片，镜检见精子，当日记为妊娠第1天。孕19~20 d SD大鼠，无菌条件下剖腹取出胎鼠，并取胎鼠肺组织进行AECⅡ原代培养，按前期已报道方法进行^[7]。AECⅡ接种15 h贴壁后，更换培养液并随机分为空气组和高氧组。高氧组按3 L/min通入95% O₂+5% CO₂ 10 min，置于37℃、5% CO₂培养箱中培养，空气组直接置于37℃、5% CO₂培养箱中培养。每隔24 h更换培养液，高氧组重复以上操作。分别于给氧后24、48及72 h收获各组细胞，CYS-1数字式测氧仪检测培养瓶中O₂浓度，低于900 mL/L O₂浓度标本舍弃。

1.3. 倒置相差显微镜观察AECⅡ形态变化

在各时间点吸弃各组培养基，以PBS液洗涤细胞2遍，倒置相差显微镜观察细胞形态变化。

1.4. Annexin V/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡

每组分别在24、48及72 h，各取8瓶细胞，吸弃培养基，以PBS液洗涤细胞2遍，用不含EDTA胰酶消化，每瓶细胞平均分3份收集于EP管中。严格按照FITC Annexin V/PI流式试剂盒说明处理细胞。处理后1 h内用Accuri C6流式机（BD公司，美国）检测各样本细胞凋亡率。

1.5. RT-PCR检测相关因子mRNA表达

每组分别在24、48及72 h，各取8瓶细胞，TRIzol试剂提取AECⅡ总RNA，紫外分光光度计（Thermo公司，美国）测定RNA纯度和含量，严格按照试剂盒说明书反转录合成cDNA，将每个样本平均分成3份在PCR扩增仪（Roche公司，美国）上进行扩增。PCR反应体系：12.5 μL SYBR Premix Ex Taq^TM；PCR上下游引物（10 μM）各0.5 μL；0.5 μL ROX Reference Dye Ⅱ（×50）；2.0 μL DNA模板；9.0 μL ddH₂O；合计25 μL。PCR反应条件：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，40个循环。以β-actin为内参照，采用2^-△CT相对定量法进行分析。

1.6. Western blot检测相关因子蛋白表达

每组分别在24、48及72 h，各收集8瓶细胞，Ripa裂解液（含PMSF）提取各组细胞总蛋白。按每泳道取20 μg总蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，湿式电转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉37℃封闭1 h后，以兔抗大鼠β-actin、GRP78、IRE1、XBP1s及CHOP IgG（1：1 000）4℃孵育过夜。第2天洗膜后，以辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔单克隆IgG（1：5 000）孵育1 h，ECL化学发光显色。每次跑胶重复上样3次，GDS-8000型凝胶成像分析系统扫描并分析。以目的蛋白与β-actin条带积分吸光度的比值表示目的基因的相对表达水平。

1.7. CHOP免疫荧光检测

各时间点各组样本以PBS液洗涤3遍，4%多聚甲醛固定20 min，0.5% Triton通透化30 min，37℃封闭1 h，以兔抗大鼠CHOP IgG（1：200）4℃孵育过夜。第2天以FITC标记山羊抗兔IgG（1：300）37℃避光孵育1 h。DAPI染核2 min后荧光显微镜（Olympus公司，日本）观察拍照。

1.8. 统计学分析

采用SPSS 18.0统计软件对数据进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组样本间比较采用t检验；组内各时间点比较采用单因素方差分析，两两时间点比较采用SNK-q检验；两样本间相关性采用Pearson相关分析。P < 0.05为差异有统计学意义。

2. 结果

2.1. AECⅡ形态变化

空气组AECⅡ在24、48及72 h略呈梭形，细胞贴壁呈岛状生长，细胞饱满。高氧暴露24 h，AECⅡ颜色变暗，细胞内出现细小点状颗粒，部分细胞变小变圆；48 h后，细胞伸展呈不规则形，胞内点状颗粒增多，部分细胞漂浮于培养基中；72 h后，细胞形态更不规则，细胞颜色变暗，部分细胞呈空泡化改变，漂浮于培养基中的死细胞更多。

2.2. AECⅡ凋亡变化

Annexin V/PI双染流式细胞术检测各时间点各组AECⅡ凋亡情况，结果表明，各时间点空气组AECⅡ早期凋亡率均较低，而高氧组AECⅡ早期凋亡率明显增加，与同时间点空气组相比差异均有统计学意义（P < 0.05）。见表 2及图 1。

2.

空气组和高氧组AECII凋亡率比较（x±s，%）

1.

Annexin V/PI双染流式细胞术检测AECⅡ凋亡左上象限代表机械损伤细胞，左下象限代表正常细胞，右下象限代表早期凋亡细胞，右上象限代表晚期凋亡细胞。24、48及72 h，空气组早期凋亡率均较低，同时间点高氧组早期凋亡率均明显增加。

2.3. ERS相关因子mRNA表达变化

实时荧光定量PCR结果表明，各时间点空气组GRP78、IRE1、XBP1及CHOP mRNA表达量均较低；GRP78、IRE1、XBP1及CHOP mRNA表达随高氧暴露时间延长，表达量呈逐渐增高趋势（P < 0.05），且与同时间点空气组比较均增高，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表 3。

3.

两组各时间点ERS相关因子mRNA表达比较（×10^-3，x±s，n=8）

2.4. ERS相关因子蛋白表达变化

Western blot结果表明，随着高氧暴露时间延长，高氧组GRP78、IRE1、XBP1s、CHOP蛋白表达呈逐渐上升趋势（P < 0.05）；与同时间点空气组相比升高明显，差异具有统计学意义（P < 0.05）。见图 2及表 4。

2.

Western blot检测ERS相关因子蛋白表达1：空气组24 h；2：高氧组24 h；3：空气组48 h；4：高氧组48 h；5：空气组72 h；6：高氧组72 h。[GRP78]葡萄糖调节蛋白78；[IRE1]需肌醇酶1；[XBP1]X盒结合蛋白1；[CHOP]C/EBP同源蛋白。

4.

两组各时间点ERS相关因子蛋白表达比较（x±s，n=8）

2.5. CHOP免疫荧光变化

免疫荧光显示CHOP定位于AECⅡ细胞核内。在24、48及72 h，空气组荧光强度较弱，CHOP表达量较少；而在各时间点高氧组，荧光强度增强，CHOP表达量增多。见图 3。

3.

免疫荧光检测CHOP表达（免疫荧光，×400）CHOP呈绿色荧光。24、48及72 h，空气组荧光强度较弱，CHOP表达较少；同时间点高氧组，荧光强度增强，CHOP表达增多。

2.6. 相关性分析

高氧组AECⅡ CHOP蛋白表达与AECⅡ凋亡率、IRE1及XBP1s蛋白表达均呈显著正相关（r=0.97、0.85、0.88，均P < 0.05），见图 4~6。

4.

CHOP蛋白表达与AECII凋亡率相关分析图

6.

CHOP蛋白表达与XBP1蛋白表达相关分析图

5.

CHOP蛋白表达与IRE1蛋白表达相关分析图

3. 讨论

AECⅡ是肺内主要干细胞。Hou等^[8]利用新生大鼠BPD模型及原代培养AECⅡ研究发现，高氧暴露后，BPD组大鼠肺泡间隔中断增多，高氧组AECⅡ凋亡及转分化较对照组明显增加。本实验研究结果显示，高氧暴露后，AECⅡ出现了颜色变暗、细胞伸展，细胞中出现细小颗粒并有空泡化改变，漂浮细胞增多等改变。Annexin V/PI双染流式细胞术结果表明，空气组AECⅡ凋亡率较低，而高氧组AECⅡ凋亡率较同时间点空气组明显增加，说明高氧使AECⅡ发生了形态改变并诱导AECⅡ凋亡增加。

ERS相关凋亡是新近研究发现的非经典凋亡途径，AECⅡ含有大量板层小体和粗面内质网，具有发生ERS的基础。正常情况下，GRP78与跨膜蛋白结合以维持内质网稳态，但任何应激破坏内质网稳态，即发生ERS时，GRP78便与跨膜蛋白解离，因此GRP78被认为是ERS标志性蛋白之一^[9]。本研究结果显示，高氧组GRP78 mRNA及蛋白表达水平随着给氧时间延长逐渐增高，且显著高于同时间点空气组，说明高氧确实启动了AECⅡ过程。

CHOP是ERS特异的早期凋亡相关转录因子，可阻滞细胞分裂诱导细胞凋亡。CHOP凋亡途径已被证实与多种疾病有关，包括糖尿病，神经退行性疾病，癌症等^[10]。有研究表明^[11]，沉默CHOP基因可改善小鼠肾纤维化，减轻肾细胞凋亡及氧化应激损伤。利用高氧暴露小鼠BPD模型及小鼠肺上皮细胞损伤模型研究发现^[12]，沉默CHOP基因可使不成熟肺组织损伤后发生重构，出现肺泡化，肺细胞死亡减少。但CHOP凋亡途径与AECⅡ凋亡的关系目前还不十分清楚。在本研究中，CHOP表达于核内，空气组CHOP荧光强度较弱，高氧组CHOP荧光强度较空气组明显增强。空气组CHOP mRNA及蛋白表达均较低，而随着给氧时间延长，CHOP mRNA及蛋白表达均呈逐渐上升趋势，与同时间点空气组比较，增加明显，且CHOP表达与细胞凋亡率呈显著正相关。以上结果进一步从细胞层面说明，高氧可激活CHOP途径并参与AECⅡ凋亡，但是沉默CHOP基因是否能抑制AECⅡ凋亡仍需进一步研究。

ERS有三条跨膜感受器，均可诱导CHOP表达。IRE1是内质网跨膜蛋白之一，与GRP78解离后发生自身寡聚化和磷酸化，同时激活自身核糖核酸内切酶活性，剪切XBP1前体mRNA生成能编码XBP1s的mRNA，XBP1s具有转录活性，可激活CHOP凋亡途径。IRE1通路对于细胞的生存和凋亡，发挥重要调控作用，并已被证实与多种疾病相关，包括糖尿病、癌症等^[13]。van Schadewijk等^[14]利用毒胡萝卜素诱导肺上皮细胞ERS，研究发现，XBP1在发生ERS的肺上皮细胞中表达明显增高，且和GRP78、CHOP表达呈显著正相关。本实验研究发现，空气组IRE1及XBP1表达均较低，随着给氧时间延长，高氧组IRE1及XBP1 mRNA及蛋白表达逐渐上升，且与同时间点空气组比较差异有统计学意义。IRE1、XBP1s蛋白表达均与CHOP蛋白表达呈显著正相关，说明高氧启动了AECⅡ中IRE1-XBP1-CHOP通路，且很可能与AECⅡ凋亡密切相关。Ghosh等^[15]利用大量细胞和动物ERS模型研究发现，抑制IRE1通路可缓解ERS，拮抗细胞凋亡，保护细胞生理功能。因此推测，在高氧所致AECⅡ凋亡过程中抑制IRE1通路可能对AECⅡ具有保护作用。

综上所述，高氧激活了ERS相关的IRE1-XBP1-CHOP途径，并参与AECⅡ凋亡。应用基因敲除技术或拮抗剂抑制CHOP功能，或调控IRE1-XBP1-CHOP途径，对于高氧所致AECⅡ损伤是否具有保护作用仍有待进一步研究。

Biography

鞠慧敏, 女, 硕士研究生

Funding Statement

国家自然科学基金面上项目（81370746）；镇江市社会发展项目（SH2015071）