Abstract
目的
研究PINK1基因对缺氧缺血性脑损伤新生小鼠细胞凋亡及细胞自噬的影响。
方法
将野生型和PINK1基因敲除型新生小鼠各72只分为野生型假手术组(SWT)、野生型模型组(MWT)、基因敲除假手术组(SKO)及基因敲除模型组(MKO)。模型组小鼠行右侧颈总动脉结扎后置于低氧舱中(含8%氧气和92%氮气)2.5 h, 假手术组不予结扎和低氧处理。缺氧缺血处理后24 h, 采用TTC染色法检测各组新生小鼠脑梗死程度; 采用免疫组化法检测各组脑组织中活化型半胱天冬酶-3(CC3)的表达; 采用TUNEL法检测细胞凋亡; 采用免疫荧光法及Western blot法检测细胞自噬相关蛋白LC3的表达。
结果
MKO组小鼠脑组织梗死程度较MWT组小鼠明显减轻(P＜0.05);脑组织凋亡阳性细胞数明显减少, 凋亡指数降低(P＜0.05);凋亡蛋白CC3表达显著减少(P＜0.05)。MKO组小鼠自噬相关蛋白LC3表达较MWT组减少, 进一步检测证实自噬指标LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ比值较MWT组降低(P＜0.05)。
结论
敲除PINK1基因对新生鼠缺血缺氧脑损伤具有神经保护作用。
Keywords: PINK1基因, 基因敲除, 缺氧缺血, 脑损伤, 细胞凋亡, 细胞自噬, 新生小鼠
Abstract
Objective
To study the effect of PINK1 (phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten induced putative kinase 1) gene on cell apoptosis and cell autophagy in neonatal mice with hypoxic-ischemic brain damage (HIBD).
Methods
Seventy-two wild-type C57BL/6 mice and 72 PINK1 gene knockout neonatal C57BL/6 mice were randomly divided into four groups: sham-operated wild-type (SWT), HIBD model wild-type (MWT), shamoperated knockout (SKO) and HIBD model knockout (MKO). HIBD model was prepared by low oxygen exposure for 2.5 hours after right carotid artery ligation. After 24 hours of hypoxia-ischemia treatment, TTC (2, 3, 5-triphenyl four azole nitrogen chloride) staining was used to measure brain infarct volume. The immunohistochemical staining was used to measure the expression of cell apoptosis protein cleaved-caspase-3 (CC3) in brain tissues. The TUNEL method was used to measure cell apoptosis. The immunofluorescence staining and Western blot were used to measure the expression of cell autophagy protein LC3.
Results
Compared with the MWT group, the infarct volume of brain tissues was markedly reduced in the MKO group (P < 0.05), the number of apoptotic cells and the cell apoptosis index were markedly decreased in the MKO group (P < 0.05), the expression of apoptosis protein CC3 was significantly reduced in the MKO group (P < 0.05), the expression of cell autophagy protein LC3 was significantly decreased in the MKO group, and the autophagy indicator LC3II/LC3I was also markedly reduced in the MKO group (P < 0.05).
Conclusions
PINK1 gene knockout can protect neonatal mice from HIBD.
Keywords: PINK1 gene, Gene knockout, Hypoxic-ischemia, Brain damage, Cell apoptosis, Cell autophagy, Neonatal mice
新生儿缺氧缺血性脑病（hypoxic-ischemic encephalopathy, HIE）是小儿严重的神经系统疾病，病情严重的患儿病死率高，存活者常留有脑瘫、智力低下等神经系统的后遗症。其发病机制尚不完全明确，临床治疗亦缺乏特异性的治疗方案[1]。研究认为细胞坏死、凋亡及自噬是神经元细胞死亡的主要方式。凋亡及自噬为延迟发生，给临床治疗带来了时间窗。明确自噬及凋亡在HIE的作用及机制，是寻找治疗靶点的关键。多项研究提示多种死亡机制参与了脑缺血后神经元损伤[2-3]。自噬及凋亡发生的具体机制尚不明确，但是抑制自噬及抗凋亡可逆转神经元损伤，提示抑制自噬及抗凋亡可能成为治疗HIE的新思路[1]。
PINK1（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten induced putative kinase 1）是一种蛋白激酶，存在于线粒体外膜，在一些高能耗的组织器官，如心、脑、肌肉中高表达[4]。研究发现PINK1能够调控线粒体自噬[5-7]。越来越多的研究显示线粒体自噬参与了细胞程序性死亡[8-10]。PINK1可以通过磷酸化丝氨酸蛋白酶Omi/HtrA2来促进细胞凋亡[11]；在慢性阻塞性肺病的小鼠模型中，敲除PINK1基因能够明显抑制细胞自噬发生[12]。因此我们推测PINK1可能参与了HIE过程中的细胞自噬及凋亡的过程。本研究通过建立新生小鼠缺血缺氧性脑损伤（hypoxic-ischemic brain damage, HIBD）模型，模拟HIE发病过程，通过敲除小鼠PINK1基因，检测小鼠缺血缺氧脑组织中细胞凋亡及自噬情况，研究PINK1基因的敲除对新生小鼠脑损伤中凋亡及自噬的作用，为HIE的发病机制及寻找新的治疗靶点提供基础实验依据。
1. 材料与方法
1.1. 主要试剂
8%氧气和92%氮气混合气（四川大学华西第二医院中央供气站）；2, 3, 5-氯化三苯基四氮唑（TTC，Sigma，美国）；二氨基联苯胺（DAB）显色试剂盒（北京天根生化科技公司）；ECL底物化学发光试剂（Pierce公司，美国）；BCA蛋白定量检测试剂盒（北京百泰克生物技术有限公司）；原位细胞凋亡检测试剂盒（AP，Roche）；聚偏氟乙烯（PVDF）膜（O.Roche公司，瑞士）；兔抗鼠β-actin抗体、辣根过氧化物酶标记的抗兔IgG抗体（Santa Cruz公司，美国）；胎牛血清（Gibco公司，美国）；兔抗鼠活化型半胱天冬酶-3（CC3）抗体（CST公司，美国）；兔抗鼠LC3抗体（Novus公司，美国）；荧光标记山羊抗兔IgG抗体（GeneCopoeia公司，美国）；4, 6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染液（上海碧云天生物技术有限公司）；引物的设计与合成由苏州金唯智生物科技公司完成。
1.2. 实验动物及分组
10日龄野生型（PINK1+/+）新生C57BL/6小鼠和PINK1基因敲除型（PINK1-/-）新生C57BL/6小鼠各72只，雌雄不限，由四川大学华西第二医院姜长安实验室提供。野生型和基因敲除型新生小鼠均分为假手术组及模型组，即野生型假手术组（wild-type sham-operated group, SWT）、野生型模型组（wild-type model group, MWT）、基因敲除假手术组（knock-out sham-operated group, SKO）以及基因敲除模型组（knock-out model group, MKO），每组36只。
1.3. 模型建立
通过改良Rice-Vannucci法[13]建立新生小鼠HIBD模型。将C57BL/6小鼠进行术前称重及编号，乙醚麻醉，于手术台上固定；常规消毒铺巾，颈部正中偏右作长约6 mm切口；分离并用5-0丝线双重结扎右侧颈总动脉；缝合皮肤切口，术后恢复1 h，然后放入缺氧舱中给予含8%氧气和92%氮气混合气2.5 h（氧流量2 L/min），即为HIBD模型。而后置于常氧母鼠笼中饲养。假手术组仅作颈部皮肤切口分离右侧颈总动脉，不予结扎，缝合切口，不做缺氧处理。操作过程保持恒温。
1.4. 聚合酶链式反应法检测PINK1基因表达
用高压灭菌1.5 mL离心管，加入适量50 mM NaOH，酒精消毒鼠尾及器械后，剪尾尖1~2 mm置于其中，100℃水浴40 min，观察组织基本溶解时涡漩数秒，加入1 mol/L tris-HCl（pH：8.3），涡漩数秒后14 000转/min离心5 min，取上清即得基因组DNA。取1 μL DNA分别加入引物、2×Master Mix等组成26 μL反应体系。Pink1引物序列：Common：5'-GAGCCTGAAGTGCAAACTCC-3'；WT：5'-GCTCTGGCTTCTGAGGAAGA-3'；KO：5'-CTAAAGCGCATGCTCCAGAC-3'。反应条件：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性15 s，64 ℃退火15 min，72 ℃延伸75 s，3个循环；95 ℃变性15 s，61℃退火15 min，72℃延伸75 s，3个循环；95℃变性15 s，58℃退火15 min，72℃延伸75 s，3个循环；95℃变性15 s，55℃退火15 min，72℃延伸75 s，33个循环；最后72℃延伸75 s。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，在凝胶成像仪长波紫外光下观察条带结果。野生型小鼠扩增片段为350 bp。
1.5. TTC染色法观察脑组织梗死程度
缺氧缺血后24 h，每组取9只小鼠麻醉后，直接取脑，将脑组织放置于脑切片模具中，-20℃冻10~15 min。从视交叉开始沿冠状位向后切片，切片厚度为2 mm。切片后置于2%浓度的TTC中，37℃温箱孵育30 min，期间保证脑片均匀接触染液，多聚甲醛固定后观察结果。染色结果红色为正常组织，白色为梗死组织。每个脑组织标本选取4张脑片评估梗死程度，梗死体积通过梗死面积积分公式计算得到[14]。
1.6. TUNEL法检测脑组织凋亡情况
缺氧缺血后24 h，每组取9只小鼠脑组织，固定后放入包埋模框，填入琼脂糖，待琼脂糖完全凝固，修理琼脂糖模块，将组织块固定到托盘上，于震荡切片机上切片，厚度为40 μm，挑片，置于6孔板中，PBS洗5 min×3，于含0.1% TRITON X-100的0.1%柠檬酸钠溶液中冰上作用5 min，PBS洗5 min×3，按比例滴加TUNEL反应液，37 ℃作用1 h，PBS洗5 min×3，加入DAPI孵育5 min，PBS洗5 min×3，滴加抗荧光淬灭剂，封片，在激光共聚焦显微镜（Olympus公司，日本）下观察结果，每个标本观察3张脑组织切片，每张脑组织切片随机选取3~4个视野，计数凋亡细胞，计算凋亡指数=（凋亡细胞/总细胞数）×100%。
1.7. 免疫组化法检测促凋亡蛋白CC3表达水平及分布
缺氧缺血后24 h，每组分别取9只小鼠脑组织，常规固定、脱水、包埋制做石蜡切片。将切片脱蜡，梯度酒精水化，微波抗原修复，PBS充分淋洗后，3% H2O2封闭内源性过氧化氢酶室温避光10 min，PBS充分淋洗后，山羊血清封闭20 min，加兔抗小鼠CC3抗体（1 : 150）4℃过夜。PBS充分淋洗后，滴加生物素化的抗兔IgG抗体孵育20 min，PBS充分淋洗后，滴加HRP-链酶卵白素，37℃孵育20 min，PBS充分淋洗后，DAB显色，适时终止显色，苏木素复染，适时终止显色，脱水后中性树脂封片，于光学显微镜下（Olympus公司，日本）观察、拍照。镜下阳性细胞显色为棕黄色。每个标本观察3张脑组织切片，每张脑组织切片随机选取3~4个视野，采用Image Pro Plus 6.0图像分析软件对其进行定量分析。
1.8. 免疫荧光法检测自噬相关蛋白LC3表达水平及分布
缺氧缺血后24 h，每组取9只小鼠脑组织，固定后放入包埋模框，填入琼脂糖，待琼脂糖完全凝固，修理琼脂糖模块，将组织块固定到托盘上，于震荡切片机上切片，厚度为40 μm，挑片，置于6孔板中，PBS洗5 min×3，于含0.3% TRITON X-100的PBS溶液中作用30 min，PBS洗5 min×3，封闭液封闭1 h，置于4℃冰箱，滴加一抗孵育过夜；滴加荧光素标记的二抗，湿盒避光室温孵育1 h；PBS洗5 min×3，加入DAPI孵育5 min，PBS洗5 min×3，滴加抗荧光淬灭剂，封片，在激光共聚焦显微镜下观察结果、拍照。
1.9. Western blot法检测自噬相关蛋白LC3表达水平
LC3是自噬过程中的关键调控蛋白，当细胞自噬被激活时，在Atg4调控下由LC3- Ⅰ型蛋白向LC3- Ⅱ型蛋白（膜结合形式）转变，对自噬体的形成起关键调控作用，LC3- Ⅱ与LC3- Ⅰ的比值常用作检测细胞自噬启动程度的指标[15-16]。因此本研究采用Western blot法进一步检测比对两组脑组织中LC3 Ⅱ /LC3 Ⅰ的比值。缺氧缺血后24 h，每组取9只小鼠右侧脑组织，加入蛋白裂解液提取总蛋白，BCA蛋白定量检测试剂盒测定蛋白浓度，调整蛋白浓度至同一浓度，以60 μg/孔上样，在12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶中110 V电泳90 min后，以0.3 A转膜70 min将蛋白转印至PVDF膜上。5%脱脂牛奶室温下封闭1 h后加入一抗，置于摇床室温孵育1 h后4℃过夜。β-actin抗体作为内参。TBST洗膜3次，每次7 min，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1 h，洗膜3次，每次7 min。在膜上加ECL发光剂，将膜放入凝胶成像仪成像。采用Quantity one 4.6.2（美国）软件行定量分析。
1.10. 统计学分析
采用SPSS 19.0统计软件对数据进行统计学处理，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1. 野生型和基因敲除型新生小鼠PINK1基因表达情况
PCR结果表明，野生型（PINK1+/+）小鼠出现一条350 bp的条带，基因敲除型（PINK1-/-）小鼠未出现350 bp的条带，见图 1。
1.
野生型和基因敲除型新生小鼠PINK1基因的表达
野生型（PINK1+/+）小鼠PINK1基因扩增片段长度为350 bp（箭头所示），PINK1基因敲除（PINK1-/-）小鼠未扩增出350 bp片段。
2.2. PINK1基因敲除对HIBD新生小鼠脑组织梗死程度的影响
脑组织TTC染色结果表明：与假手术组相比，新生小鼠缺氧缺血后24 h脑组织梗死明显。MKO组脑梗死体积占脑总体积百分数（16%±3%）低于MWT组（31%±4%）（t=9.0，P < 0.05），提示PINK1基因敲除可致新生小鼠缺氧缺血后24 h脑组织梗死程度减轻。见图 2。
2.
野生型和基因敲除型新生小鼠脑梗死程度比较
上图为TTC染色结果，箭头所示为梗死区域。下图为统计图（n=9），a示与MWT组相比，P＜0.05。
2.3. PINK1基因敲除对HIBD新生小鼠脑组织细胞凋亡的影响
TUNEL结果表明：SWT组（0.76%±0.12%）与SKO组（0.89%±0.36%）几乎不存在细胞凋亡；与各假手术组相比，两模型组凋亡阳性细胞数均明显增加（P < 0.05），且MKO组（13.2%±2.5%）凋亡指数低于MWT组（51.9%±3.4%）（P < 0.05），提示PINK1基因敲除可致新生小鼠缺氧缺血后24 h脑组织细胞凋亡减少。见图 3~4。
3.
各组新生小鼠脑组织细胞凋亡指数比较（n=9）
a示与各型假手术组比较，P＜0.05；b示与MWT组比较，P＜0.05。
4.
TUNEL染色法检测各组新生小鼠脑组织细胞凋亡情况（DAPI，×400）
SWT组和SKO组几乎不存在凋亡细胞，MWT组和MKO组凋亡细胞均明显增加，且MKO组凋亡细胞数明显少于MWT组，阳性凋亡细胞呈绿色荧光。
2.4. PINK1基因敲除对HIBD新生小鼠脑组织凋亡蛋白CC3表达的影响
免疫组化结果表明：SWT组（0.011±0.002）与SKO组（0.009±0.004）几乎不表达凋亡蛋白；与假手术组相比，MKO组（0.0878±0.033）和MWT组（0.151±0.048）CC3蛋白表达明显增加（P < 0.05），且MWT组CC3蛋白表达水平明显高于MKO组（P < 0.05）。提示PINK1基因敲除新生小鼠在缺氧缺血后24 h脑组织凋亡蛋白CC3表达明显减弱。见图 5~6。
5.
免疫组化检测各组新生小鼠脑组织凋亡蛋白CC3表达
（DAB显色，×400），SWT组和SKO组均几乎不表达CC3蛋白；MWT组和MKO组CC3蛋白表达均明显增加，CC3蛋白阳性表达呈棕色（箭头所示）。
6.
各组新生小鼠脑组织凋亡蛋白CC3表达比较（n=9）
a示与SWT组和SKO组比较，P＜0.05；b示与MWT组比较，P＜0.05。
2.5. PINK1基因敲除对HIBD新生小鼠脑组织自噬相关蛋白LC3表达的影响
免疫荧光结果表明：SWT组与SKO组自噬相关蛋白LC3荧光点数很少；与假手术组相比，两组模型组LC3荧光点数明显增多；与MWT组相比，MKO组LC3荧光点数减少，分布弥散，密集程度降低（图 7）。Western blot结果表明，与SWT组（0.206±0.049）和SKO组（0.186±0.061）相比，MWT（0.590±0.117）和MKO组（0.382±0.089）LC3 Ⅱ /LC3 Ⅰ的比值均升高（P < 0.05）；且MKO组低于MWT组（P < 0.05）。提示PINK1基因敲除新生小鼠在缺氧缺血后24 h脑组织自噬指标LC3 Ⅱ /LC3 Ⅰ比值明显下降（图 8）。
7.
各组脑组织自噬相关蛋白LC3表达（免疫荧光，×400）
SWT组和SKO组LC3荧光点数很少；MWT组和MKO组LC3荧光点数明显增多；MKO组LC3荧光点数及聚集程度较MWT组减少。
8.
Western blot检测各组脑组织自噬相关蛋白LC3表达
上图为电泳条带图，下图为统计图（n=9），a示与SWT组和SKO组比较，P＜0.05；b示与MWT组比较，P＜0.05。
3. 讨论
细胞凋亡是缺氧缺血时脑损伤的重要机制之一，减少caspase-3表达或增加Bcl-2表达等抗凋亡手段均能对缺氧缺血性脑损伤起到保护作用[1]。PINK1是最早在遗传性帕金森病的筛查中发现的突变基因位点[17]。目前研究认为PINK1能够通过调节线粒体自噬调节细胞凋亡[9-11]。本研究发现，野生型和基因敲除型假手术组小鼠之间凋亡指标无差异，说明PINK1基因敲除后不会诱发正常脑组织的细胞发生凋亡。与假手术组小鼠相比，缺氧缺血小鼠脑组织发生大量细胞凋亡，是缺氧缺血脑损伤细胞死亡的重要途径。敲除PINK1可以明显降低脑组织细胞凋亡的发生。我们推测敲除PINK1基因后，线粒体膜蛋白发生改变，线粒体损伤介导的细胞凋亡途径被抑制，从而抑制了细胞凋亡的发生。
无论是局灶性缺血还是全脑缺血动物模型中[2-3]，缺氧缺血均能激活脑组织细胞自噬。Puyal等[2]发现在新生大鼠短暂性大脑中动脉闭塞模型中，缺血核心区自噬体指标LC3 Ⅱ水平在再灌注后2 h开始升高，并持续至24 h，电子显微镜下观察可见大量自噬体的形成。不同的研究结果表明，在缺氧缺血性脑损伤中，自噬激活的程度和持续时间不同，对脑组织的作用存在差异。在正常情况下及轻度缺氧缺血时，存在一定水平的自噬维持细胞稳态；而在严重缺氧缺血状态下，自噬被过度激活促进细胞死亡[6-7]。本研究发现，野生型和基因敲除型假手术组小鼠之间自噬指标无差异，说明PINK1基因敲除后不会激活正常脑组织的细胞自噬。与假手术组小鼠比较，缺氧缺血小鼠脑组织自噬明显被激活，而过度的自噬导致脑组织损伤加重。与野生模型组相比，PINK1基因敲除模型组脑组织LC3荧光点数分布弥散，点状聚集减少，密集程度降低；LC3蛋白表达减弱，同时LC3 Ⅰ向LC3 Ⅱ的转化也减少，说明敲除PINK1可明显抑制细胞自噬水平。我们推测敲除PINK1后，由于线粒体外膜缺乏PINK1蛋白，细胞自噬的识别反应受到干扰，抑制了细胞自噬的发生。本研究发现了PINK1在HIBD模型中对细胞自噬及细胞凋亡的影响，但具体的分子机制尚需进一步阐明。本研究初步揭示抑制PINK1对新生10日龄小鼠缺血缺氧脑损伤可能具有神经保护作用，为HIE治疗提供了新思路。
Biography
黄阳, 女, 硕士研究生
Funding Statement
国家自然科学基金(81330016), 四川省科技计划项目(2014SZ0149)
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