热休克蛋白70对新生大鼠缺氧性肺动脉高压的保护作用

Abstract

目的

探讨热休克蛋白70（HSP70）在新生大鼠缺氧性肺动脉高压（HPH）中的保护作用。

方法

将128只新生大鼠随机分为空白对照组、HPH模型组、空病毒对照组和HSP70组（ n=32）。建立HPH模型前分别向空白对照组和HPH模型组大鼠通过尾静脉注射5 μL无菌盐水，向空病毒对照组大鼠通过尾静脉注射5 μL Ad-GFP（1 010 PFU/mL），向HSP70组大鼠通过尾静脉注射5 μL Ad-HSP70（1 010 PFU/mL），转染后除空白对照组外，其余3组建立HPH模型。分别于建模后3、7、10、14 d，采用多导生理记录仪记录各组平均肺动脉压力（mPAP），光学及电子显微镜观察肺血管组织结构及重塑指标，Western blot法检测各组新生大鼠肺组织中HSP70、缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）、缩血管因子内皮素-1（ET-1）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）蛋白表达水平。

结果

HPH模型组与空病毒对照组在3、7、10、14 d时的mPAP水平高于空白对照组（ P <0.05）。缺氧7、10 d时，空白对照组及HSP70组MA%、MT%低于HPH模型组和空病毒对照组（ P <0.01）；缺氧14 d时，HPH模型组、空病毒对照组和HSP70组MA%、MT%比较差异无统计学意义（ P > 0.05），但高于空白对照组（ P <0.01）。缺氧3、7、10 d时，HSP70组HSP70的蛋白表达水平高于HPH模型组、空病毒对照组和空白对照组（ P <0.01）；HSP70组HIF-1α、ET-1和iNOS表达水平低于HPH模型组和空病毒对照组（ P <0.05），而与空白对照组比较差异无统计学意义（ P > 0.05）。

结论

转染HSP70可以提高HPH新生大鼠肺组织HSP70表达，下调HIF-1α、ET-1、iNOS表达，减轻肺血管重塑，降低肺动脉压力，可能成为治疗新生儿HPH的一种新策略。

新生儿缺氧性肺动脉高压（hypoxia induced pulmonary hypertension，HPH）是新生儿常见的急危重症，早期肺血管痉挛，及时治疗可逆，晚期肺血管重塑，发展为新生儿持续肺动脉高压^[1]（persistent pulmonary hypertension of the newborn，PPHN），病死率高。研究发现缺氧导致肺血管舒缩因子失衡，尤其是缩血管因子内皮素-1（endothelin-1，ET-1）和舒血管因子诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxidesynthase，iNOS）的表达在新生儿HPH发病中占重要地位^[2-3]，本课题组前期研究表明缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1 alpha，HIF-1α）^[4-5]是这两个因子的关键上游转录调节因子。目前有关HPH的临床治疗，重点是针对原发病及对各系统并发症的对症治疗为主，但临床治疗观察效果欠佳，如果能够阻断上游转录基因HIF-1α的表达，抑制下游靶基因ET-1、iNOS活性，从而保护缺氧引起的肺损伤，防止HPH的发生发展，可能会成为治疗新生儿HPH的新靶点。而热休克蛋白70（heat shock protein，HSP70）能够在长期缺氧状态下促进HIF-1α的降解^[6]，故本研究通过腺病毒介导HSP70转染提高肺组织HSP70表达，探讨HSP70能否在HPH新生大鼠肺组织发挥保护作用。

1. 材料与方法

1.1. 实验动物及仪器试剂

7~10日龄健康、清洁级Wistar新生大鼠128只，体重27±3 g，由新疆医科大学第一附属医院医学研究中心动物实验研究部提供，实验动物许可证号：SCXK（新2011-0004）。CY-100B氧浓度测定仪由杭州利华科技有限公司提供；HX-200小动物呼吸机由成都泰盟科技有限公司提供；BX41TF光学显微镜由日本奥林巴斯公司提供；283BR11735电泳仪、电转仪由美国BIO-RAD公司提供。MST-8001VG染色试剂盒由福州迈新生物技术开发有限公司提供；WB7105 Western blot二抗试剂盒由美国Invitrogen公司提供；HSP-70单克隆抗体，HIF-1α、ET-1、iNOS多克隆抗体由美国Thermo公司提供；Ad-HSP70及Ad-GFP由上海汉恒生物公司提供。

1.2. 分组及HPH模型建立

128只新生大鼠随机分为空白对照组、HPH模型组、空病毒对照组和HSP70组，各组再分为缺氧3、7、10和14 d 4个亚组，每个亚组8只新生大鼠。空白对照组和HPH模型组大鼠通过尾静脉注射5 μL无菌生理盐水，空病毒对照组大鼠通过尾静脉注射5 μL Ad-GFP（1 010 PFU/mL），HSP70组大鼠通过尾静脉注射5 μL Ad-HSP70

（1 010 PFU/mL）。除空白对照组外，将上述其他3组新生大鼠与母鼠一起置于常压低氧舱内建立HPH模型^[7]，将8%氮氧混合气体输入低氧舱内，用氧浓度监测仪持续8 h监测氧浓度，使其维持在8%~10%，昼/夜比为12 h/12 h。空白对照组除未缺氧外，其他处理同HPH模型组。

1.3. 平均肺动脉压力测定

在缺氧第3、7、10、14天测定各组新生大鼠平均肺动脉压（mPAP），常规用氯胺酮

（75 mg/kg)、阿托品（0.375 mg/kg）和地西泮

（7.5 mg/kg）混合液腹腔内注射麻醉后，将新生大鼠仰卧位固定，备皮，常规消毒手术区皮肤，在胸骨柄上方约5 mm处，沿气管正前方作一约2 mm的纵行切口，充分暴露气管，行气管插管，连接小动物呼吸机（设置参数：呼吸频率120次/min、潮气量4 mL/min），保证胸廓对称起伏、与呼吸机同步，监测新生大鼠尾部血氧饱和度，使其维持在85%~95%，从胸骨右缘行U型切口打开胸腔，充分暴露肺动脉根部，用4.5号静脉穿刺针逆血流方向刺入肺动脉根部，迅速连接压力传感器，在多导生理记录仪上记录mPAP。

1.4. 腺病毒定位在HPH新生大鼠肺组织的判定

新生大鼠测定肺动脉压力后即处死取其右中肺组织，将其投入生理盐水中洗净血液，在4%多聚甲醛液中固定2 h，再用0.1 mmol/L的PBS液清洗3次，每次5 min，然后将标本置于15%的蔗糖中过夜，最后置于固定液中放入-20℃冰箱备用。将预先备好的标本做冰冻切片，避光，于20 min内置于免疫荧光显微镜下观察，腺病毒载体携带有增强型绿色荧光信号标记蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP），在荧光显微镜下会发出绿色荧光信号，同时采集图片。

1.5. 观察肺血管组织结构及重塑指标

新生大鼠测定肺动脉压力后，立即处死，迅速切取右上肺组织，用4%多聚甲醛固定1周。常规石蜡包埋、切片，厚度4 μm，用1 : 1蛋白甘油贴片液贴片，放入45℃烤片盒内烘干。每只新生大鼠随机选取肺组织切片3张，进行Van Gieson（VG）染色，选取染色中与呼吸性细支气管及肺泡管相伴行的、横断面积较圆、直径约5~10 µm的肺小动脉，在光学显微镜下，每张切片随机选取5个视野，观察肺小动脉变化。用病理图像分析软件测定肺小动脉中层壁厚（MT）、肺小动脉外径（ED）、肺小动脉中层横截面积（MA）和总横截面积（TAA），根据公式MT%= MT/ED、MA%= MA/TAA计算，将MT%、MA%作为肺血管重塑指标。

1.6. Western blot测定HSP70、HIF-1α、ET-1、iNOS蛋白质表达

按观察时间点测定肺动脉压后处死各组新生大鼠，快速切取右侧肺组织100 mg左右，液氮中低温冷冻，再保存于-80℃冰箱中备用。按蛋白提取试剂盒提取肺组织总蛋白，以LaminA/C作为细胞核蛋白内参，β-actin作为细胞浆蛋白内参。采用二奎林甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法进行蛋白质浓度测定、定量及变性，SDS-聚丙烯酰胺凝胶30 mA恒流电泳，100 V恒压PVDF膜进行湿式电转1~2 h，室温封闭1 h，将待测蛋白质按HSP70：1:1 000，β-actin：1 : 400，LaminA/C：1 : 1 000，HIF-1α：1 : 500，iNOS：1 : 200，ET-1：1 : 500稀释比例加入一抗孵育液中，4℃环境下放置在摇床上过夜，二抗室温孵育1 h，碱性磷酸酶法显色。凝胶成像分析仪进行图像采集，通过Quantity One分析软件对目的条带灰度值进行数据分析，结果以目的条带/内参条带灰度值比值来表示。

1.7. 统计学分析

采用SPSS 20.0统计软件对数据进行统计学分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验；不符合正态分布的计量资料采用中位数（四分位间距）[P₅₀(P₂₅,P₇₅)]表示；多组间比较采用Kruskal-Wallis H检验，组间两两比较采用Nemenyi检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2. 结果

2.1. HSP70基因转染液转染肺组织

取HSP70组及空白对照组肺组织冰冻切片于免疫荧光显微镜下观察，发现缺氧3、7、

10 d HSP70组肺组织均可见免疫荧光；缺氧14 d HSP70组及空白对照组未见明显免疫荧光，表明腺病毒介导的HSP70成功定位到HPH新生大鼠肺组织，且随着缺氧时间延长在肺组织内逐渐衰减。见图 1。

1.

免疫荧光观察腺病毒介导HSP70定位肺组织（GFP，×200） HSP70组肺组织在缺氧3 d时可见明显绿色免疫荧光，随着缺氧时间延长在肺组织内逐渐衰减，缺氧14 d时HSP70组及空白对照组均未见明显免疫荧光。

2.2. 各组新生大鼠mPAP的变化

在缺氧3、7、10、14 d时，HPH模型组及空病毒对照组的mPAP水平与同日龄空白对照组比较显著增高（P<0.05）；在缺氧3、7、10 d时，HSP70组的mPAP水平与同日龄空白对照组比较差异无统计学意义（P>0.05），与同日龄HPH模型组及空病毒对照组比较显著降低（P<0.05）；缺氧14 d 时，HSP70组的mPAP水平与同日龄HPH模型组及空病毒对照组比较差异无统计学意义（P>0.05），但显著高于空白对照组（P<0.05）。见表 1。

1.

各组新生大鼠mPAP比较 [P₅₀(P₂₅,P₇₅)，mm Hg]

2.3. 各组肺血管形态及重塑指标的改变

VG染色后观察空白对照组新生大鼠肺小动脉管腔大，管壁薄，血管壁结构层次清晰；HPH模型组、空病毒对照组新生大鼠缺氧3 d时动脉管壁均明显增厚，缺氧7 d时呼吸性细支气管水平肺小动脉平滑肌层增厚，管壁增厚，官腔缩小，缺氧10 d及14 d时肺小动脉中层平滑肌增生，管壁增厚，官腔更加狭小；HSP70组在缺氧3、7、10 d时肺小动脉中层平滑肌未见明显增生，管壁增厚不明显，官腔狭小不显著，缺氧14 d时肺小动脉中层平滑肌增生，管壁增厚，官腔狭小。见图 2。

2.

各组新生大鼠肺血管形态学改变（VG染色，×200） 空白对照组新生大鼠肺小动脉管腔大，管壁薄。HPH模型组和空病毒对照组随着缺氧时间延长，肺小动脉管腔逐渐缩小，管壁增厚。HSP70组在缺氧3、7、10 d时肺小动脉管壁增厚、管腔狭小不明显，缺氧14 d时肺小动脉管壁增厚，管腔狭小。

缺氧3 d时，各组MA%、MT%比较差异无统计学意义（P>0.05）；缺氧7 d及10 d时，空白对照组及HSP70组MA%、MT%低于HPH模型组和空病毒对照组（P<0.01）；缺氧14 d时，HPH模型组、空病毒对照组和HSP70组MA%、MT%比较差异无统计学意义（P>0.05），但高于空白对照组（P<0.01）。提示HSP70可以延缓肺血管重塑。见表 2。

2.

各组新生大鼠MA%及MT%比较 （ x±s）

2.4. 各组肺组织中HSP70、HIF-1α、ET-1、iNOS蛋白表达变化

在缺氧3、7、10 d时，各组HSP70蛋白表达水平比较差异有统计学意义（P<0.05），其中HSP70组HSP70的蛋白表达水平高于HPH模型组、空病毒对照组和空白对照组（P<0.01）。在缺氧3、7、10 d时，各组HIF-1α蛋白表达水平比较差异有统计学意义（P<0.05），其中HPH模型组、空病毒对照组HIF-1α的蛋白表达水平高于空白对照组和HSP70组（P<0.05），而HSP70组和空白对照组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。在缺氧3、7、10 d时，各组ET-1和iNOS的蛋白表达水平比较差异有统计学意义（P<0.05），其中HSP70组ET-1和iNOS的蛋白表达水平低于HPH模型组和空病毒对照组（P<0.05），而与空白对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表 3~4。

3.

各组新生大鼠肺组织HSP70、HIF-1α蛋白表达水平比较 （ x±s）

4.

各组新生大鼠肺组织ET-1、iNOS 蛋白表达水平比较 （ x±s）

3. 讨论

晚期肺血管重塑^[8] 是HPH患儿出现持续胎儿循环，救治困难，病死率高的主要因素，目前研究证实HIF-1α是一种氧依赖转录激活因子^[9]，通过促进下游靶基因表达，引起肺血管壁痉挛、重塑，导致肺动脉压力增高。如果在缺氧早期针对HIF-1α进行干预降低表达，可能是一个治疗新生儿HPH新的有效途径。已有研究证明采用基因工程技术诱导HSP70高效表达对心、脑、肺、肾脏、肝脏等器官的损伤有保护作用^[10-13]。

本研究HSP70组在缺氧3、7、10 d时显示肺组织有绿色免疫荧光信号，证实腺病毒介导的HSP70成功靶向定位到新生大鼠肺组织中，而14 d时未见绿色免疫荧光信号蛋白显示。缺氧引起肺小动脉内皮损伤，导致血管舒缩因子平衡失调，肺血管痉挛、平滑肌增生、重塑，最终导致肺动脉高压发生。本研究结果显示HPH模型组及空病毒对照组肺动脉高压形成，缺氧7 d时肺血管重塑发生，缺氧14 d时肺血管重塑加剧，HSP70组缺氧3、7、10 d没有出现肺动脉高压，14 d时肺动脉压力又增高，显示较轻肺血管重塑，说明HSP70高效表达能够减轻或延缓肺血管重塑，降低肺动脉压力，而随着HSP70的表达减少，对减轻肺血管重塑的作用就减弱，说明HSP70高效表达能够发挥保护肺血管，减轻肺血管损伤的作用。

本研究显示HPH模型组HSP70表达在缺氧3、7、10 d时均有增加，一方面在缺氧应激情况下，机体内源性保护机制开始启动，引起内源性HSP70表达增多，另一方面HSP70组HSP70 蛋白表达水平高于HPH模型组、空病毒对照组，说明通过腺病毒介导HSP70可以诱导外源性HSP70在新生大鼠肺组织高效表达。病理学检测显示HPH模型组、空病毒对照组新生大鼠有肺血管损伤性改变，HSP70组新生大鼠肺血管损伤较轻，说明外源性HSP70高效表达后可以减轻HPH肺损伤，对HPH新生大鼠肺组织具有保护作用。本研究也显示内源性HSP70表达少，对HPH保护作用弱，不能减轻肺血管的损伤性改变，而应激刺激超过一定的强度，或持续时间过长，使维持细胞正常生长的蛋白质合成受阻，同时变性蛋白质产生过多超过了HSP70保护能力。

HPH模型组和空病毒对照组在缺氧3、7、10 d时，HIF-1α蛋白质表达均增高，但HSP70组表达降低，说明腺病毒介导的HSP70诱导的HSP70高效表达后，抑制HIF-1α的表达，14 d时HSP70在体内代谢表达减弱，对HIF-1α的抑制作用也减弱。说明在缺氧状况下HSP70对HIF-1α具有泛素化降解作用，与Gogate等 ^[14] 报导一致。缺氧时HIF-1α可以通过诱导其下游靶基因ET-1、iNOS的表达，来发挥其在缺血缺氧性疾病中的损害作用 ^[15]。Western blot检测结果显示HPH模型组和空病毒对照组在缺氧3、7、10 d时ET-1、iNOS蛋白表达均增高，缺氧促进其表达，而在HSP70组表达降低，进一步说明HSP70高效表达后，抑制HIF-1α的表达，同时也下调其下游靶基因ET-1、iNOS的表达。

缺氧刺激可以诱导HPH新生大鼠肺组织内源性的HSP70表达，但没有发挥对缺氧肺组织的保护作用，腺病毒介导的 HSP70 可以诱导HPH新生大鼠肺组织中 HSP70 高效表达，通过促进HIF-1α降解，下调其下游靶基因ET-1、iNOS表达发挥降低肺动脉压力，减轻或缓解肺血管重塑的作用，推测HSP70在HPH中可以发挥对肺损伤的保护作用。

Biography

王乐,女,博士,副主任医师

Funding Statement

国家自然科学基金（81360104）