Abstract
目的
观察肺瘤平膏和化疗药环磷酰胺对肺癌小鼠的作用,并从酸性微环境和细胞凋亡角度探索其内在作用机制.
方法
建立Lewis肺癌小鼠模型,分别给予环磷酰胺,肺瘤平膏,环磷酰胺+肺瘤平膏相应处理,以生理盐水组作为对照,观察各组小鼠的肿瘤体积,肿瘤增殖率,食物消耗量.给药15 d后处死小鼠,取肿瘤组织,用乳酸试剂盒检测肿瘤组织的乳酸相对浓度,免疫组织化学法检测葡萄糖转运蛋白4(glucose transporter 4,GLUT4),己糖激酶1(hexokinase 1,HK1),葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78,GRP78),碳酸酐酶-Ⅸ(carbonic anhydrase-Ⅸ,CA-Ⅸ)的蛋白表达,流式细胞术检测肿瘤细胞凋亡率和调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)比例,Wes-tern blot法检测缺氧诱导因子1-α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α),Bcl-2,Bax,Caspase-3,白细胞介素2(interleukin-2,IL-2)的蛋白表达.
结果
肺瘤平膏+环磷酰胺组小鼠的肿瘤生长受到抑制最为明显,肿瘤增殖率最低,与生理盐水组相比差异有统计学意义(P<0.05),食物的消耗量也最多,但差异并不具有统计学意义(P>0.05).进一步的分子生物学检测发现,肺瘤平膏+环磷酰胺组肿瘤组织的乳酸水平在各组中最低,并伴有GLUT4,HK1,GRP78,CA-Ⅸ等蛋白表达和Treg细胞比例的下降,与生理盐水组相比差异具有统计学意义(P<0.05).此外,与生理盐水组相比,肺瘤平膏+环磷酰胺组肿瘤细胞凋亡显著增加,而HIF-1α,Bcl-2,Bax,Caspase-3,IL-2等蛋白的表达与生理盐水组相比存在明显差异.
结论
化疗药环磷酰胺与肺瘤平膏在抑制肺癌生长,提高荷瘤小鼠一般状况上具有协同作用,这些作用部分是因为二者联用改善组织缺氧,抑制HIF-1α表达,进而调控下游GLUT4,HK1,GRP78,CA-Ⅸ等蛋白的表达,降低肿瘤组织局部的乳酸水平,改善肿瘤组织酸性微环境,从而诱导肿瘤细胞凋亡,抑制T细胞向Treg细胞分化.
Keywords: 肺肿瘤, 肺瘤平膏, 化疗, 肿瘤微环境, 细胞凋亡
Abstract
Objective
To observe the effects of Fei-Liu-Ping ointment and chemotherapy on mice with lung cancer, and to explore the inherent mechanism of action from the point of acidic microenvironment and apoptosis.
Methods
First of all, the Lewis lung cancer transplanted mouse model was established. Therefore, they were treated by Fei-Liu-Ping ointment, cyclophosphamide, Fei-Liu-Ping ointment + cyclophosphamide and the saline as control. All the groups' tumor size, tumor growth rate and food consumption were recorded. The mice were sacrificed and the tumors were took out after 15 days' interventions. Then lactate relative concentrations were detected with lactate kits and the protein expressions of glucose transporter 4 (GLUT4), hexokinase 1 (HK1), glucose-regulated protein 78 (GRP78), carbo-nic anhydrase-Ⅸ (CA-Ⅸ) were detected through immunohistochemical staining. Flow cytometry was adopted to detect the percentage of apoptotic tumor cells and regulatory T cells (Treg), and the expression of hypoxia-inducible factor-1α (HIF-1α), Bcl-2, Bax, Caspase-3, interleukin-2 (IL-2) were tested through western blot.
Results
The strongest inhibition effect and the lowest tumor growth rate was found in Fei-Liu-Ping ointment + cyclophosphamide group. There were significant differences between Fei-Liu-Ping ointment + cyclophosphamide group and saline group(P<0.05). And the highest food consumption was found in Fei-Liu-Ping ointment + cyclophosphamide group while there were no significant differences between Fei-Liu-Ping ointment + cyclophosphamide group and saline group (P>0.05). Further molecular biological detections found that the lowest lactate level and regulatory T cells ratio were found in Fei-Liu-Ping ointment + cyclophosphamide group and these expressions of GLUT4, HK1, GRP78, CA-Ⅸ were suppressed. There were significant differences between Fei-Liu-Ping ointment+cyclophosphamide group and saline group (P<0.05). In addition, the Fei-Liu-Ping ointment + cyclophosphamide group's cell apoptosis increased significantly compared with saline group and there were significant differences on expressions of HIF-1α, Bcl-2, Bax, Caspase-3, IL-2 for this group compared with saline group.
Conclusion
Chemotherapy and Fei-Liu-Ping ointment had the synergistic effect on inhibiting tumor growth and improving the general conditions of tumor-bearing mice. The effect was partly owed to the improvement on tissue hypoxia, the inhibition of HIF-1α expression and the regulations on its downstream proteins, such as GLUT4, HK1, GRP78, and CA-Ⅸ. And then all these alterations led to the modulation tumor acidic microenvironment, the induced tumor cells apoptosis and suppression of T cells to regulatory T cells differentiation.
Keywords: Lung neoplasms, Fei-Liu-Ping ointment, Chemotherapy, Tumor microenvironment, Apoptosis
酸性微环境是肿瘤的核心特征之一,酸性微环境不但能促进肿瘤的增殖和转移,还与化疗药物耐药和免疫逃逸有关[1,2,3].我们的前期研究发现,肺瘤平膏联合化疗药环磷酰胺可以调控肺癌缺氧诱导因子1-α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)的表达,而HIF-1α是酸性环境的重要调控因子,因此,本研究拟进一步观察肺瘤平膏联合化疗药环磷酰胺对肺癌荷瘤小鼠肿瘤增殖,酸性环境,细胞凋亡等方面的作用,以进一步阐释肺瘤平膏的抗肿瘤作用机制.
1. 材料与方法
1.1. 实验动物和细胞株
无特定病原体(specific pathogen free,SPF)级雄性BALB/c裸鼠共40只,购自北京华阜康生物科技有限公司,许可证号:SCXK(京)2014-0004,4周龄, 体质量16~18 g.Lewis肺癌瘤株购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心.
1.2. 药物
肺瘤平膏购自中国中医科学院广安门医院(批准文号:Z20063236),主要成分有黄芪,西洋参,沙参,麦冬,白花蛇舌草,败酱草,拳参,桃仁,三七.环磷酰胺购自郑州大学附属肿瘤医院(批准文号:国药准字H20093393,浙江海正药业股份有限公司).
1.3. 主要试剂和仪器
乳酸试剂盒(A019-2)购自中国南京建成生物工程研究所.缺氧诱导因子1-α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)单克隆抗体(MA1-46457),Caspase-3单克隆抗体(700182),Bcl-2单克隆抗体(MA5-11757),Bax(MA5-14003)单克隆抗体, 葡萄糖转运蛋白4(glucose transporter 4,GLUT4)单克隆抗体(MA5-17176),己糖激酶1(hexokinase 1,HK1)单克隆抗体(MA5-14789),葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein78,GRP78)多克隆抗体(PA5-11418),碳酸酐酶Ⅸ(carbonic anhydrase-Ⅸ,CA-Ⅸ)多克隆抗体(PA5-77885),白细胞介素2(interleukin-2,IL-2)单克隆抗体(PA5-94995),FITC CD4单克隆抗体(11-0041-82),PE CD25单克隆抗体(12-0251-82)购自美国Thermo Fisher公司.β-actin单克隆抗体(TA-09)购自中国中杉金桥公司.细胞凋亡检测试剂盒购自美国Biovision公司.
主要仪器:流式细胞仪(美国BD公司),光学倒置显微镜(日本尼康公司),小型电泳系统(美国BIO-RAD公司),凝胶成像系统(美国BIO-RAD公司),Powerpac Basic电泳仪(美国BIO-RAD公司),温控摇床(美国New Brunswich公司),酶标仪(美国BioTek公司),恒温箱(中国Blue pard公司).
1.4. 动物造模和分组
Lewis肺癌细胞制成单细胞悬液,每只小鼠右腋皮下注射0.2 mL瘤细胞悬液(约2×106个细胞)建立Lewis肺癌荷瘤小鼠模型,采用随机数字表法分为4组:生理盐水组(S组),环磷酰胺组(H组),肺瘤平膏组(F组),环磷酰胺+肺瘤平膏组(H+F组),每组10只动物.游标卡尺测量瘤体直径大于0.5 cm时开始给予干预措施.
1.5. 药物干预
S组:生理盐水灌胃,每日0.2 mL,每日1次.F组:肺瘤平膏灌胃,采用200 mL生理盐水+肺瘤平膏84 g配制灌胃溶液,每日0.2 mL,每日1次.H组:腹腔注射环磷酰胺,每次25 mg/kg,分别于第3,7,11天各给药1次.H+F组:在肺瘤平膏灌胃基础上联合环磷酰胺腹腔注射.
记录各组小鼠的体质量,肿瘤体积大小,食物消耗量,绘制肿瘤生长曲线,计算肿瘤增殖率.各组均在第15天结束给药,处死小鼠.
1.6. 乳酸试剂盒测定组织上清液乳酸水平
取肿瘤组织50 mg,加入磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline,PBS)500 μL匀浆后,离心取上清液,按照乳酸试剂盒说明书检测小鼠肿瘤组织的乳酸相对水平.
1.7. 免疫组织化学法检测GLUT4,HK1,GRP78,CA-Ⅸ 蛋白表达
制备肿瘤组织的石蜡切片,经常规脱蜡,抗原修复,消除内源性过氧化物酶活性,添加相应的一抗,按照试剂盒说明,DAB显色,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封片,均以棕黄色的强弱程度为观察指标.采用专业图像分析软件Image-Pro Plus对阳性细胞的光密度值进行分析.
1.8. 流式细胞术检测肿瘤细胞凋亡率
取肿瘤组织用眼科剪剪碎后研磨,加入胰蛋白酶于37 ℃消化2 h,用PBS溶液冲洗,每管加500 μL结合缓冲液,吹打混匀制备成单细胞悬液,浓度约为1×106/L.加入Annexin V和PI染色,避光孵育5 min后上机检测.
1.9. Western blot法测定组织蛋白HIF-1α,Bcl-2,Bax,Caspase-3和IL-2的表达
使用RIPA裂解液提取肿瘤组织的总蛋白,BCA法测定蛋白浓度,聚丙烯酰胺凝胶电泳,恒流300 mA,冰浴转膜2 h,封闭30 min后用相应的一抗及二抗进行抗原抗体反应,ECL发光法显色,曝光系统内曝光3 min,观察蛋白条带的表达,用BIO-RAD系统所提供的分析软件进行灰度分析.
1.10. 流式细胞术检测肿瘤组织淋巴细胞中Treg细胞比例
采用参考文献[4]方法,颈椎脱臼法处死荷瘤小鼠,取出肿瘤组织剪碎加入1 mL配制好的消化酶溶液(含有0.002%的Ⅰ型胶原酶, 0.1%的Ⅳ型胶原酶,0.01%的Ⅴ型透明质酸酶,均为质量分数),于 37 ℃水浴箱中消化2 h,每半小时用吸管吹打帮助消化,待消化完全后用贴有200目孔径尼龙膜的小漏斗过滤,密度梯度离心,收集75%和100% Fical液交界界面上的细胞,即为淋巴细胞,用PBS将细胞调整至1×109/L,每管加入细胞浓度为1×106/mL的淋巴细胞悬液,第1管细胞加入 0.125 μg的CD4 FITC抗体和0.06 μg 的CD25 PE抗体,第2管细胞加入 0.125 μg 的CD4 FITC抗体,第3管细胞加入0.06 μg的CD25 PE抗体,最后1管细胞不加任何抗体.加入预冷的流式细胞染色缓冲液500 μL洗涤细胞,离心沉淀细胞,弃上清液.再加500 μL的流式细胞仪染色缓冲液重悬细胞,上机检测.
1.11. 统计方法
数据应用SAS 9.2统计软件进行处理.数据用均数±标准差表示,假设检验均采用单因素方差分析,两两比较采用LSD法;P<0.05为差异有统计学意义,所有检验均为双侧检验.
2. 结果
2.1. 各组小鼠的肿瘤体积,肿瘤增殖率和食物消耗量
从第11天开始,各组小鼠的肿瘤体积开始出现差异,处死小鼠当天各组肿瘤体积按从小到大排序依次为H+F组,H组,S组和F组,其中H+F组与S组相比差异有统计学意义(P<0.05,图1A).H+F组小鼠的肿瘤增殖率最低,与S组相比差异有统计学意义(P<0.05,图1B).H+F组小鼠食物消耗量最高,但与S组相比差异并无统计学意义(P>0.05,图1C).
1.
给药后不同时间各组小鼠肿瘤体积(A),肿瘤增殖率(B)和食物消耗量(C)
Mice's tumor size (A), tumor growth rate (B), food consumption (C) at different times after administration
S, saline; F, Fei-Liu-Ping ointment; H, cyclophosphamide; H+F, cyclophosphamide + Fei-Liu-Ping ointment.
2.2. 各组小鼠肿瘤组织的乳酸水平
与S组相比,F组小鼠肿瘤组织的乳酸水平轻度升高(P>0.05),H组和H+F组乳酸水平下降,其中H+F组下降更为明显,与S组相比差异有统计学意义(P<0.05,图2).
2.
各组小鼠肿瘤组织乳酸相对浓度
Lactate relative concentration in mice's tumor tissue
* P<0.05, vs. S group.
2.3. 各组小鼠GLUT4,HK1,GRP78,CA-Ⅸ的蛋白表达
与S组相比,H+F组肿瘤组织中GLUT4,HK,GRP78,CA-Ⅸ阳性细胞的光密度值均显著下降(P<0.05), H组仅CA-Ⅸ和HK1阳性细胞光密度值显著下降(P<0.05), 而F组GLUT4,HK,GRP78,CA-Ⅸ阳性细胞光密度值均未见明显变化.此外,与H组相比,H+F组CA-Ⅸ阳性细胞光密度值也明显下降,差异具有统计学意义(P<0.05,图3).
3.
各组小鼠肿瘤组织CA-Ⅸ,GLUT4,GRP78和HK1蛋白表达(免疫组织化学染色 ×40)
CA-Ⅸ, GLUT4, GRP78 and HK1 protein expression in mice's tumor tissue (immunohistochemical staining ×40)
S, saline; F, Fei-Liu-Ping ointment; H, cyclophosphamide; H+F, cyclophosphamide + Fei-Liu-Ping ointment. *P<0.05, vs. S group; #P<0.05, vs. H group.
2.4. 各组小鼠肿瘤细胞的凋亡
图4和表1提示,S组小鼠肿瘤细胞的早期凋亡率为1.72%,晚期凋亡率为1.52%,总凋亡率为3.24%.用肺瘤平膏处理后,F组肿瘤细胞的早期凋亡率为1.79%,晚期凋亡率为1.45%,总凋亡率仍为3.24%,与S组相比无明显差异.环磷酰胺处理后,H组肿瘤细胞凋亡率增加到5.02%,但与S组相比,差异无统计学意义(P>0.05).而肺瘤平膏和环磷酰胺联合处理后,H+F组肿瘤细胞凋亡率明显升高,达到13.32%,与S组相比,差异有统计学意义(P<0.05).
4.
各组小鼠肿瘤细胞凋亡比例
Apoptosis percent of tumor cells
1.
肿瘤细胞凋亡比例
Apoptosis percent of tumour cells /%
| Group | Early apoptosis | Late apoptosis | Total apoptosis |
| *P<0.05, vs. S group. | |||
| S | 1.72±0.17 | 1.52±0.22 | 3.24±0.18 |
| F | 1.79±0.11 | 1.45±0.19 | 3.24±0.16 |
| H | 2.78±0.34 | 2.24±0.20 | 5.02±0.29 |
| H+F | 5.42±0.82 | 7.9±1.04 | 13.32±0.95* |
2.5. 各组小鼠HIF-1α,Bcl-2,Bax,Caspase-3,IL-2蛋白的表达
图5A显示了HIF-1α,Bcl-2,Bax,Caspase-3,IL-2的蛋白表达情况(Western blot法).与S组相比,F组和H组小鼠HIF-1α表达均略有升高(P>0.05), H+F组HIF-1α表达显著下降(P<0.05,图5B).F组小鼠Bcl-2表达与S组相比无明显差异,H组Bcl-2表达明显降低(P<0.05),H+F组Bcl-2表达降低更明显,与S组和H组相比差异均有统计学意义(P<0.05,图5C).各组小鼠Caspase-3和Bax表达具有相同的趋势,F组与S组相比无明显差异,H组较S组虽有升高,但差异无统计学意义(P>0.05),H+F组Caspase-3和Bax表达明显高于S组和H组(P<0.05,图5D,E).与S组相比,F组小鼠IL-2表达无明显差异(P>0.05),H组和H+F组IL-2表达明显下降(P<0.05),其中,H+F组IL-2表达最少(图5F).
5.
小鼠肿瘤组织HIF-1α,Bcl-2,Caspase-3,Bax,IL-2的蛋白表达
HIF-1α, Bcl-2, Caspase-3, Bax and IL-2 protein expression in mice's tumor tissue
A, results of Western blot; B-F, gray value. *P<0.05, vs. S group; #P<0.05, vs. H group.
2.6. 各组小鼠Treg细胞比例
与S组相比,F组小鼠肿瘤组织中Treg细胞比例无明显变化,H组略有降低(P>0.05),H+F组明显下降,差异有统计学意义(P<0.05,图6).
6.
各组小鼠肿瘤组织Treg细胞比例
Percent of Treg cells in mice's tumor*P<0.05, vs. S group.
3. 讨论
肺瘤平膏是中成药益肺清化颗粒的膏方剂型,组方严扣"虚","毒","瘀"之病机:以黄芪,西洋参益肺补气,沙参,麦冬养阴利肺,针对肺癌之"虚";白花蛇舌草,败酱草,拳参,桃仁,三七清热散瘀,消痈解毒,针对肺癌之"毒"和"瘀",诸药合用共奏益气养阴,清热解毒活血之功效.本研究发现,F组小鼠的肿瘤体积在各组中最大,肿瘤增殖率最高,食物的消耗量最低,提示单用肺瘤平膏对荷瘤小鼠的肿瘤生长并没有明显的抑制作用,小鼠的一般状况也最差.化疗药环磷酰胺可抑制肿瘤的生长,降低肿瘤的增殖率,但食物消耗量较低,仅超过F组,提示一般状况较差.肺瘤平膏与化疗药环磷酰胺联用后,小鼠肿瘤生长受到明显抑制,且食物消耗量最多,提示二者联用具有最强的抗肿瘤效果和最好的身体状况.
为了探索二者发挥作用的内在机制,本研究进一步测定了肿瘤组织的乳酸水平和GLUT4,HK1,GRP78,CA-Ⅸ等糖酵解途径中关键酶的表达.目前常用的测定组织酸碱度的方法主要有pH试纸法,乳酸试剂盒法和电极法,本研究选取操作性较好且结果更可靠的乳酸试剂盒法,结果发现,肺瘤平膏与化疗药环磷酰胺联用后,荷瘤小鼠肿瘤局部的乳酸水平显著降低,同时HIF-1α的表达显著下降,其下游的GLUT4,HK1,GRP78,CA-Ⅸ表达也明显下降.缺氧和酸中毒都是肿瘤微环境的基本特征,二者相互影响,相互促进.
乳酸和碳酸是肿瘤细胞外酸性环境氢离子的主要来源,前者主要来源于肿瘤的糖酵解,后者是由肿瘤过表达的CA-Ⅸ催化CO2和H2O的反应形成[5].对于糖酵解,肿瘤细胞会在HIF-1α等相关癌基因的影响下,首先上调GLUT4的表达,以增强对葡萄糖的摄取能力,然后再通过提高糖酵解限速酶(最关键的是HK1)的表达来提高糖代谢的速率,以配合糖摄取能力的提高[6].哺乳动物的细胞对无氧糖酵解的这种自主性适应,被称为巴斯德效应,实验证明巴斯德效应的代谢转换必须有HIF-1α的存在[7],否则细胞在缺氧时就不能产生ATP而减少生存率,GLUT4和HK1的表达也都受到HIF-1α的调控[8,9].缺氧环境除导致糖酵解增强外,CA家族是诱导酸性微环境产生的另一个重要途径.CA家族广泛存在于动物体内,但在正常组织细胞中CA-Ⅸ通常不表达,而在许多肿瘤组织中,由于缺氧,HIF-1α可诱导肿瘤细胞高表达CA-Ⅸ,催化CO2和H2O反应生成碳酸,以诱导酸性微环境的产生,且与放疗和化疗不敏感密切相关[10].同时,在肿瘤细胞生存过程中,缺氧和低pH值存在强烈的协同作用,缺氧诱导CA-Ⅸ的表达提高,而CA-Ⅸ表达和活性上的差异将影响到肿瘤细胞对酸性环境的忍耐能力[11].GRP78在促进细胞的存活以及微环境应激的抵抗方面有着类似的作用,缺氧等应激导致的GRP78高表达保证了肿瘤细胞的存活和对微环境的适应能力[12].因此,肿瘤酸性微环境的形成与缺氧密切有关,肺瘤平膏和环磷酰胺联合可下调HIF-1α的表达,进而抑制GLUT4,HK,GRP78,CA-Ⅸ这些影响组织糖酵解和细胞内酸碱度调节的蛋白表达,从而减少了乳酸的产生,改善了肿瘤的酸性环境.上文已经提到,肺瘤平膏兼具益气扶正和清热解毒之效,张翔云等[13]则发现益气扶正的四君子汤和清热解毒的黄连解毒汤单用均可明显升高乳腺癌小鼠肿瘤组织的pH值,从而抑制乳腺癌的酸性环境.
肿瘤酸性微环境能够促进肿瘤细胞的增殖,侵袭,抑制其凋亡,还与肿瘤耐药和免疫逃逸密切相关.肿瘤细胞会持续排出乳酸等酸性代谢产物,使肿瘤细胞内偏碱性,细胞内酸碱度的变化可影响肿瘤细胞的细胞周期,使细胞处于不受控制的增殖状态[14,15].有研究发现,在pH 6.5 的酸性条件下培养淋巴瘤细胞,T细胞TDAG8基因被激活,进而上调抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL的表达来对抗葡萄糖或谷氨酰胺缺乏所引起的细胞凋亡[16].而肺瘤平膏联合环磷酰胺化疗可通过减少乳酸的释放,减轻组织酸中毒,进而抑制Bcl-2的表达,上调Bax和Caspase-3蛋白的表达,从而诱导肿瘤细胞凋亡,降低肿瘤的增殖率.
此外,本研究还发现,肺瘤平膏联合环磷酰胺化疗可降低肿瘤局部Treg细胞的比例,同时伴有IL-2表达的下调.如上文所述,酸中毒是肿瘤微环境的核心特征,高浓度的乳酸可通过刺激IL-2的分泌进而促进T细胞向Treg细胞的分化[17],最终抑制免疫,促进肿瘤的免疫逃逸.肺瘤平膏联合环磷酰胺化疗可通过抑制IL-2的表达,进而抑制T细胞向Treg细胞分化.
综上,本研究认为,肺瘤平膏和环磷酰胺化疗在控制肿瘤上具有协同作用,二者可通过改善肺癌的酸性微环境进而抑制肿瘤细胞的增殖,诱导肿瘤细胞的凋亡,并减少免疫抑制细胞Treg的产生,以及改善荷瘤小鼠的一般状况,从而发挥扶正,抗肿瘤作用.但二者具体通过何种途径改善荷瘤小鼠的一般状况尚不清楚,有待后续的进一步研究.
Funding Statement
国家自然科学基金（81473638）; 河南省科技厅科技攻关项目（172102310104）
Supported by the National Natural Science Foundation of China and Science(81473638); Technology Project of Henan Province(172102310104)
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