Abstract
目的
比较人牙髓细胞(human dental pulp cells,hDPCs)在胶原静电纺纳米纤维膜(collagen nanofibrous matrix,Col_NFM)与直接沉积胶原膜(collagen flat film,Col_FF)上的黏附、增殖和分化情况,探究胶原纳米纤维支架对hDPCs生物学行为的影响。
方法
采用扫描电镜(scanning electron microscopy, SEM)观察两种胶原膜的表面形貌,并比较其表面接触角和溶胀性能。将hDPCs分别接种于两种胶原膜表面共培养,SEM和激光共聚焦显微镜(laser scanning microscope,LSM)观察hDPCs在支架表面的生长形态,并用CCK-8法测定hDPCs的增殖情况。在诱导14 d后,比较成牙本质分化相关基因的表达变化,茜素红染色观察矿化结节的形成情况。
结果
SEM图可见Col_NFM组纤维直径为(884±159) nm,纤维之间存在大量三维连通的孔隙结构,而Col_FF组表面平坦,未见孔隙结构。Col_NFM组瞬间表面接触角为85.03°±4.45°,溶胀度为3,Col_FF组瞬间表面接触角为98.98°±5.81°,溶胀度为1,Col_NFM组的亲水性和溶胀性能更佳。SEM和LSM结果显示,Col_NFM组hDPCs表现为不规则多角形,呈三维生长,Col_FF组细胞在二维平面上呈纺锤形生长。CCK-8结果显示,hDPCs在Col_NFM支架上增殖活性更高。在诱导14 d后,Col_NFM组成牙本质分化相关基因表达水平较Col_FF组显著升高(P<0.05),茜素红染色也更深。
结论
Col_NFM具有纳米尺度的微观结构,并具备良好的亲水性和溶胀性能,相较于Col_FF,hDPCs在Col_NFM表面表现出更好的黏附、增殖和分化性能。
Keywords: 胶原, 静电纺丝, 牙髓再生, 纳米纤维, 支架
Abstract
Objective
To compare cell adhesion, proliferation and odontoblastic differentiation of human dental pulp cells (hDPCs) on electrospun collagen nanofibrous matrix (Col_NFM) with that on collagen flat film (Col-FF), to investigate the biological effect of collagen nanofibrous matrix on hDPCs.
Methods
The surface morphology of the two different collagen scaffold was analyzed by scanning electron microscopy (SEM), and the contact angle and the swelling ratio were also measured. Then hDPCs were implanted on the two different collagen scaffolds, the cell morphology was observed using SEM and laser scanning microscope (LSM), and cell proliferation was evaluated by the CCK-8 assay. After hDPCs cultured on the two different collagen scaffold with odontoblastic medium for 14 days, the expression of odontoblastic differentiation related genes was detected by real-time PCR, and alizarin red staining was used to test the formation of mineralized nodules.
Results
From the SEM figures, the fibers’ diameter of Col_NFM was (884±159) nm, and there were abundant three dimensional connected pore structures between the fibers of Col_NFM, while the surface of Col_FF was completely flat without pore structure. The contact angle at 0 s of Col_NFM was 85.03°±4.45°, and that of Col_FF was 98.98°±5.81°. The swelling ratio of Col_NFM was approximately 3 folds compared with dry weight sample, while that of Col_FF was just 1 fold. Thus Col_NFM indicated better hydrophilicity and swelling property. SEM and LSM showed that hDPCs on Col_NFM presented an irregular and highly branched phenotype, and could penetrate into the nanofibrous scaffold. In contrast, the cells were spread only on the surface of Col_FF with a spindle-shaped morphology. CCK-8 assays showed that hDPCs on Col_NFM showed higher proliferation rate than on Col_FF. After hDPCs were cultured on the two different collagen scaffolds with odontoblastic medium for 14 days, more expressions of odontoblastic differentiation related genes, such as dentin sialophosphoprotein (DSPP) and dentin matrix proten-1 (DMP1) were determined in Col_NFM group (P<0.05), and more mineralization depositions were also observed in Col_NFM group according to the results of alizarin red staining.
Conclusion
Col_NFM with nanoscale microstructure achieves better hydrophilic and swelling properties than Col_FF, and hDPCs cultured with Col_NFM present higher activity on cell adhesion, proliferation and odontoblastic differentiation.
Keywords: Collagen, Electrospinning, Pulp regeneration, Nanofibers, Scaffold
近年来,随着组织工程与再生医学研究的不断深入,牙髓再生已成为牙髓病治疗领域新的突破口及研究热点。种子细胞、支架和生物活性分子是牙髓再生的三要素[1,2],其中,支架作为种子细胞的载体,为细胞的定植、黏附、增殖、迁移和分化等生物学行为提供机械支撑,并作为细胞赖以生长的微环境调控细胞功能,在牙髓再生中起着重要的作用。目前,根据天然细胞外基质的组成和结构进行仿生支架的设计是支架材料的研究趋势。
胶原是天然牙髓细胞外基质(extracellular matrix,ECM)中最主要的有机成分,构成ECM基本的网架结构,并且含有特定的细胞识别信号,对牙本质的形成和矿化起重要作用[3]。大量的研究表明,胶原作为一种天然高分子支架材料,具有优异的生物相容性、生物可降解性、弱抗原性及良好的亲水性,有利于细胞的黏附、增殖、分化等[4,5,6]。
胶原在天然细胞外基质中主要以纤维形式存在,其纤维直径50~500 nm,研究显示,这种纳米纤维状的结构对细胞的黏附、增殖、分化及功能表达等都起着非常重要的作用[7,8,9]。模拟这种结构的支架应用于牙髓再生时能诱导生成更接近于天然牙髓的新生组织,这主要得益于纳米纤维支架具有极高的比表面积,一方面可显著提高蛋白的吸附(如纤连蛋白等[10]),促进支架与细胞的相互作用,另一方面,高比表面积可增加支架与细胞间的接触面积,有利于细胞的黏附[9],从而促进细胞迁移、增殖、分化及功能表达[11,12]。但是,目前胶原支架的主要形式为水凝胶[13,14]、海绵[15],或与人工合成高分子材料复合[16]等,而纳米纤维形式的胶原支架在牙髓再生中鲜有报道。
静电纺丝技术是一种简便高效的制备高分子聚合物纳米纤维的技术,其制得的纳米纤维支架孔隙率高、比表面积大,与天然的细胞外基质相仿,已广泛应用于组织工程领域[17]。因此,本实验拟采用静电纺丝方法制备胶原纳米纤维膜(collagen nanofibrous matrix,Col_NFM),通过与直接沉积的胶原膜(collagen flat film,Col_FF)相比较,研究胶原纳米纤维支架对人牙髓细胞黏附、增殖和分化的影响,从而探索其在牙髓再生中的应用前景。
1. 材料与方法
1.1. 实验材料和设备
Ⅰ型胶原粉平均相对分子质量30×104,购自天津市赛宁生物工程技术有限公司;三氟乙醇(tetrafluoroethylene,TFE)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸[1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride, EDC]、N-羟基琥珀酰亚胺[N-Hydroxy-succinimide, NHS], 均购自梯希爱(上海)化成工业发展有限公司;DMEM培养基、胰蛋白酶、青霉素100 U/mL、链霉素100 g/L及磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution, PBS)均购自美国Gibco公司;胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)购自ScienCell公司;4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(dihydrochloride,DAPI)购自北京索莱宝科技有限公司;细胞骨架红色荧光探针(ActinRed)购自南京凯基生物有限公司;细胞增殖检测试剂盒(Cell Counting Kit-8, CCK-8)购自东仁化学科技(上海)有限公司。
实验所用设备:傅立叶红外变换光谱仪(Nicolet 8700)购自德国Bruker公司,扫描电镜(Hitachi S-4800)购自日本日立公司,表面接触角测量仪(JC2000C1)购自北京中怡远大科技有限公司,激光共聚焦显微镜(Zeiss LSM700)购自德国蔡司公司。
1.2. Col_NFM与Col_FF的制备
将Ⅰ型胶原加入TFE溶剂中,37 ℃搅拌72 h,配置成9%(质量分数)的纺丝溶液。室温下将纺丝液通过实验室自制的静电纺丝装置制备得到胶原纳米纤维膜,纺丝电压15 kV,挤出速率2 mL/h,接收距离为12 cm。将胶原纳米纤维膜置于 0.5 mol/L的EDC/NHS(溶剂为无水乙醇)溶液中交联24 h,用蒸馏水清洗3次,干燥备用,记为Col_NFM。
将9%(质量分数)的胶原溶液(同前)置于四氟乙烯的平底容器中,置于通风橱中待溶剂完全挥发后获得胶原直接沉积膜。胶原直接沉积膜置于0.5 mol/L的EDC/NHS(溶剂为无水乙醇/蒸馏水,无水乙醇与蒸馏水的体积比为3 :2)溶液中交联24 h,用蒸馏水清洗3次,干燥备用,记为Col_FF。
1.3. Col_NFM与Col_FF的理化性能表征
1.3.1 SEM观察 将Col_NFM与Col_FF干燥后喷金,使用SEM对两种胶原膜的表面形貌进行观察。
1.3.2 表面接触角测定 将Col_NFM与Col_FF置于表面接触角测量仪测量平台上,将水滴垂直滴于样品表面,录制观察不同时间水滴在胶原膜表面的形状,通过量角法测量不同时间的接触角。
1.3.3 溶胀性能测试 将Col_NFM与Col_FF裁成约50 mg的试样,放入PBS中,置于37 ℃的恒温箱内,定时取出试样,吸干表面的水分,称取湿重,溶胀性能用吸水溶胀度S表示:S= ,式中,Mw为溶胀后试样的质量,M为溶胀前试样的质量。
1.4. Col_NFM与Col_FF的细胞相容性实验
1.4.1 细胞培养 将Col_NFM与Col_FF用打孔器裁剪为直径6 mm的圆片,95%(体积分数)乙醇溶液消毒30 min,再用PBS溶液漂洗3次,每次30 min,用细胞培养基浸泡过夜,置于96孔板板底。选择状态良好(第3~6代)的hDPCs制备细胞悬液,调整细胞浓度为5×104个/mL,每孔接种100 μL细胞悬液,置于培养箱内,隔天换液。
1.4.2 SEM观察 取第1天的细胞支架复合物,经4%(质量分数)多聚甲醛固定,乙醇逐级脱水,六甲基二硅胺烷置换,干燥,表面喷金后观察。
1.4.3 细胞骨架染色 取第1天的细胞支架复合物,用4%(质量分数)多聚甲醛固定,0.1%(体积分数)Triton-X-100破膜,1%(质量分数)BSA孵育1 h,使用ActinRed 37 ℃避光孵育1 h,PBS洗涤细胞3次,每次5 min,DAPI复染细胞核,使用Zeiss荧光显微镜观察。
1.4.4 hDPCs增殖情况检测 在培养的第1、4、7天时,按照CCK-8试剂盒说明书测定细胞增殖情况[450 nm处光密度值(D)],绘制各组的细胞增殖曲线,每组设4个复孔。
1.5. 两种胶原膜对hDPCs的成牙本质分化作用
1.5.1 细胞培养 将Col_NFM与Col_FF裁剪为3.5 cm×3.5 cm大小的正方形,95%(体积分数)乙醇溶液消毒30 min,再用PBS溶液漂洗3次,每次30 min,DMEM浸泡过夜,用CellCrown固定于6孔板,同时设立无支架的空白培养皿作为空白对照组(Control组)。选择状态良好(第3~6代)的hDPCs制备细胞悬液,每孔接种2×105个细胞,每2~3天更换一次成牙本质诱导液。成牙本质诱导液成分为:DMEM、10%(质量分数)FBS、10 nmol/L地塞米松、5 mmol/L β-甘油磷酸钠、50 μg抗坏血酸。
1.5.2 实时荧光定量PCR测定 收集成牙本质诱导第14天后Col_NFM与Col_FF组的细胞支架复合体及Control组的细胞,利用RNA提取试剂提取细胞总RNA,逆转录合成cDNA,实时荧光定量PCR检测成牙本质分化相关基因[牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)和牙本质基质蛋白(dentin matrix proten-1,DMP1)]的表达,相关引物序列见表1。数据分析采用2-ΔΔCt法,以GAPDH为内参照,实验重复3次。
1.
引物序列
The chain of reaction primers
| Gene | Gene sequence (5'-3') |
| DSPP, dentin sialophosphoprotein; DMP1, dentin matrix proten-1. | |
| DSPP | Forward: ATATTGAGGGCTGGAATGGGGA Reverse: TTTGTGGCTCCAGCATTGTCA |
| DMP1 | Forward: AGGAAGTCTCGCATCTCAGAG Reverse: TGGAGTTGCTGTTTTCTGTAGAG |
| GAPDH | Forward: GAAGGTGAAGGTCGGAGTC Reverse: GAGATGGTGATGGGATTTC |
1.5.3 茜素红矿化结节染色 在成牙本质诱导第14天,收集Col_NFM/hDPCs (+)、Col_FF/hDPCs (+)的细胞支架复合体及Control组的样本,另取无细胞培养的Col_NFM/hDPCs (-)、Col_FF/hDPCs (-)作对比,均用PBS冲洗3次,4%(质量分数)多聚甲醛固定,Milli-Q水轻柔漂洗3次,加入 0.1%(质量分数)茜素红染液,室温染色10 min,Mill-Q水轻轻冲洗至洗脱水无色,干燥后观察。
1.6. 统计学分析
采用SPSS 20进行统计分析,表面接触角测定、溶胀度测试、CCK-8测定、实时荧光定量PCR结果均采用单因素方差分析(ANOVA),两两比较采用SNK法,P<0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1. 支架的微观形貌
Col_NFM与Col_FF的微观形貌见图1。Col_NFM组纤维表面光滑、连续均匀,直径为(884±159) nm,纤维呈无规则取向,纤维之间搭建出大量三维连通的孔隙结构,具有高比表面积和极高的孔隙率。Col_FF组表面平坦,呈二维平面结构,未见孔隙结构。
1.
支架的扫描电镜图片
Scanning electron microscopy view of the scaffolds
A,Col_NFM group; B, Col_FF group.
2.2. 支架的理化性能
Col_NFM组与Col_FF组的水接触角典型图像见图2。Col_NFM组的瞬间接触角为85.03°±4.45°,Col_FF组的瞬间接触角为98.98°±5.81°,两者均随着时间的延长,接触角逐渐减小,其中Col_NFM组接触角下降较快,8 s时降低至30°,明显小于同时间内Col_FF组的接触角,提示Col_NFM组具有更好的亲水性。
2.
支架表面接触角
Contact angles of the scaffolds
A,Col_NFM group, 0 s; B, Col_NFM group, 8 s; C, Col_FF group, 0 s; D, Col_FF group, 8 s.
两种胶原膜的支架溶胀度见图3,Col_NFM组表现出更高的吸水溶胀性,在达溶胀平衡时,溶胀度接近3,Col_FF组溶胀性较低,溶胀度仅为1,两者间差异有统计学意义(P<0.05)。
3.
支架溶胀度
Swelling ratio of the scaffolds
*P<0.05, compared with the Col_FF group at the same time.
2.3. hDPCs在支架上的生长形态
SEM和LSM观察hDPCs在两种支架表面的生长形态(图4、5)。培养1 d后,Col_NFM组细胞呈现不规则多角形生长,可跨越纤维间孔隙或长入纤维孔内部,呈现三维生长,细胞伸出长而丰富的伪足包绕纳米纤维,与支架材料结合紧密,细胞表面形成少量细胞外基质(图4A、B)。Col_FF组细胞呈纺锤形生长,单个细胞在支架表面伸展面积更大,表面未见明显细胞外基质的沉积,呈现二维平面生长(图4C、D)。LSM结果与SEM一致,通过肌动蛋白染色观察细胞骨架,可以看到Col_NFM组细胞呈多角形三维生长,而Col_FF组细胞更为伸展,呈纺锤形二维平面生长(图5)。
4.
扫描电镜观察不同支架表面hDPCs的生长形态
Scanning electron microscopy view of hDPCs cultured on different surfaces
A, B, Col_NFM group; C, D, Col_FF group. B and D were the red box region view of A and C at high magnification.
5.
激光共聚焦显微镜观察不同支架表面hDPCs的生长形态
Laser scanning microscope view of hDPCs cultured on different surfaces
A, B, Col_NFM group; C, Col_FF group.
2.4. hDPCs在支架上的增殖
hDPCs在两种支架上的增殖结果见图6。总体来说,随着培养时间从1天增加到7天,两组的光密度值均有明显增加,可见hDPCs均处于良好的增殖状态。Col_NFM组hDPCs表现出更高的增殖速率,其增殖活性在第4、7天时较Col_FF组分别高34%、23%,组间差异均有统计学意义(P<0.05)。
6.
hDPCs在不同支架上的增殖情况
The proliferation of hDPCs on different scaffolds
*P<0.05, compared with the Col_FF group at the same time.
2.5. 支架对hDPCs的成牙本质分化作用
诱导14 d后,hDPCs在两种支架上成牙本质分化相关基因的相对表达情况及茜素红染色情况见图7和图8。从图7可见,Col_NFM组与Col_FF组DSPP、DMP1基因的相对表达量均显著高于Control组,其中Col_NFM组表达量更高,组间差异有统计学意义(P<0.05)。从图8可见,相比未接种细胞支架组与Control组,Col_NFM/hDPCs(+)组与Col_FF/hDPCs(+)组茜素红染色均呈现阳性结果,且从大体观看,Col_NFM组染色更深。显微镜下Col_FF组可见明显的矿化结节生成,Col_NFM组细微结构显示不清。
7.
实时荧光定量PCR检测hDPCs诱导14天后DSPP、DMP1基因相对表达情况
Quantitative real-time PCR analysis of DSPP and DMP1 gene expression of hDPCs for 14 days
*P<0.05, compared with the control group; # P<0.05, compared with the Col_FF group. Abbreviations as in Table 1.
8.
诱导第14天后茜素红染色结果
Alizarin red staining of hDPCs cultured on different scaffolds at day 14
3. 讨论
hDPCs来源广泛,具有多向分化的潜能,可分化为成牙本质细胞等多种细胞,形成牙髓牙本质复合体,目前在牙髓再生中已得到广泛的应用[18],因此,本研究采用hDPCs作为后续支架材料生物学性能的研究。
支架材料在诱导组织再生过程中具有重要的作用。理想的支架材料应具备适宜的理化性能、良好的生物相容性和一定的生物活性,为细胞提供适宜的局部生长环境,利于细胞的黏附、增殖和分化。目前,模拟天然细胞外基质进行仿生支架的设计是支架材料的研究趋势。为了充分模拟牙髓组织天然细胞外基质,即以Ⅰ型胶原为主要成分的纳米纤维骨架,本研究采用静电纺丝技术制备了Col_NFM,通过与Col_FF相比较,体外实验证实具有纳米纤维结构的胶原支架可以促进hDPCs的黏附、增殖和成牙本质分化。
本研究构建的两种胶原膜的本质区别在于两者微观形貌的差异。SEM结果表明,Col_NFM组为大量纳米纤维堆叠形成,纤维表面平滑均匀,纤维之间交错排列,具有极高的比表面积和大量的孔隙结构,而Col_FF组表面完全平坦,缺乏微/纳米的微观结构。首先,这种具有高比表面积的纳米纤维支架,可大幅提高细胞外基质蛋白的吸附量,并大幅增加细胞与支架间的接触面积,从而提高细胞黏附效率,促进细胞的黏附和增殖[10],其次,其孔隙结构也有利于营养物质的转运及细胞和组织的长入[12],再者,支架的纳米纤维结构本身对细胞的生物学行为也有着深刻影响。研究表明,具有纳米纤维结构的支架,能够提供大量纤维性的黏附位点,当细胞在纳米纤维的支架上生长时,由于无法黏附于充盈在纤维之间的水性液体培养基,而只能顺着纳米纤维的固有形态黏附伸长,从而细胞最终不得不呈现出被拉长且多分叉的生长形态[19]。细胞的生长形态与细胞的功能表达之间关系密切[20,21,22],有研究证实,在完全平坦的支架上经成骨诱导培养后的骨髓间充质干细胞即呈现这种拉长且分叉较多的细胞形态,且这种纳米纤维性的支架确实促进了骨髓间充质干细胞的成骨分化,但是目前在牙髓再生领域还缺乏类似研究。
此外,两种胶原膜微观结构的差异会进一步影响两者的理化性能,从而影响细胞的生物学行为。本研究测量了两种胶原膜的表面接触角,结果显示Col_NFM组的瞬间接触角略小于Col_FF组,随着时间的延长,Col_NFM组的接触角下降更快,表现出更好的亲水性能,这是因为纳米纤维形式的Col_NFM比完全平坦的Col_FF表面粗糙度更高且孔隙率也更高。材料表面的亲疏水性影响细胞的黏附、增殖和迁移,是评估细胞生物学反应的重要参数。以往的研究表明,适度亲水的表面更有利于细胞的生长[23,24]。本研究还对比了两组的溶胀性能,结果表明Col_NFM组更迅速地达到平台期,溶胀度更高,具有更强的溶胀性能,这也是得益于纳米纤维形式的支架具有更高的孔隙率,大量的水分子进入纤维之间的空隙内,同时还有部分水分子进入胶原大分子内部,而对于缺乏孔隙结构的Col_FF,其溶胀度仅取决于少量进入胶原大分子内部的水分子。支架的溶胀度直接反映了支架的吸水和保水能力,足够的溶胀度保证了支架具有良好的体液保持能力,保住营养成分,为细胞和组织的生长提供必需的微环境。
基于以上支架微观结构及理化性能的探究可以推测,具有纳米纤维结构的胶原膜更有利于细胞的生长。因此,本研究首先利用CCK-8法证实了Col_NFM组hDPCs确实表现出更高的增殖速率,其次,使用SEM和LSM观察发现,hDPCs在Col_NFM支架表面沿着纳米纤维黏附生长,呈不规则多角形且细胞分叉较多,并且能长入纤维之间,深入支架内部,呈现出更利于分化的细胞生长形态,与前述研究结果相吻合。进一步的实时荧光定量PCR测定及茜素红染色结果也均证实,Col_NFM组成牙本质分化相关基因(DSPP和DMP1)表达较Col_FF组明显上调,Col_NFM组染色也更深,生成了更丰富的矿化结节。这些研究结果初步证明了纳米纤维形式的胶原膜能促进hDPCs的黏附、增殖和成牙本质分化。
本研究仍局限于体外研究,且对纳米纤维的支架结构是如何影响hDPCs增殖和分化的内在分子机制缺乏深入探讨。如何将这种胶原纳米纤维膜实际应用于临床治疗是本研究后续亟待解决的问题,一种可行的应用思路是以胶原纳米纤维膜为基础构建三维纳米纤维支架,并使其外形适应髓腔及根管的解剖结构,继而联合种子细胞和适宜的生长因子,实现牙髓牙本质复合体的再生。在本研究中,我们观察到利用静电纺丝技术直接获得的纳米纤维膜孔径过小,制约了细胞深入支架内部,实现真正的三维生长,因此,如何扩大纳米纤维膜的孔径,获得微观孔径可调、宏观形态可控的三维大孔纳米纤维支架,并观察其诱导牙髓再生的效果,是本课题组下一步的研究重点。
综上,相较于Col_FF,hDPCs在Col_NFM表面表现出更好的黏附、增殖和分化性能,初步表明Col_NFM适宜hDPCs的生长,可能在牙髓再生领域具有极大的应用前景。
Funding Statement
国家自然科学基金（51503004）
Supported by the National Natural Science Foundation of China(51503004)
Footnotes
The authors have declared that no competing interests exist.
作者已声明无竞争性利益关系。
Contributor Information
温 世鹏 (Shi-peng WEN), Email: wensp@mail.buct.edu.cn.
王 晓燕 (Xiao-yan WANG), Email: wangxiaoyan@pkuss.bjmu.edu.cn.
References
- 1.Lysaght MJ, Reyes J. The growth of tissue engineering. Tissue Eng. 2001;7(5):485–493. doi: 10.1089/107632701753213110. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 2.Malhotra N, Kundabala M, Acharya S. Current strategies and applications of tissue engineering in dentistry: a review part 1. Dent Update. 2009;36:577- 579,–581-582. doi: 10.12968/denu.2009.36.9.577. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 3.Wiesmann HP, Meyer U, Plate U, et al. Aspects of collagen mineralization in hard tissue formation. Int Rev Cytol. 2005;242:121–156. doi: 10.1016/S0074-7696(04)42003-8. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 4.Sumita Y, Honda MJ, Ohara T, et al. Performance of collagen sponge as a 3-D scaffold for tooth-tissue engineering. Biomaterials. 2006;27(17):3238–3248. doi: 10.1016/j.biomaterials.2006.01.055. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 5.Prescott RS, Alsanea R, Fayad MI, et al. In vivo generation of dental pulp-like tissue by using dental pulp stem cells, a collagen scaffold, and dentin matrix protein 1 after subcutaneous transplantation in mice. J Endod. 2008;34(4):421–426. doi: 10.1016/j.joen.2008.02.005. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 6.Kim NR, Lee DH, Chung PH, et al. Distinct differentiation pro-perties of human dental pulp cells on collagen, gelatin, and chitosan scaffolds. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 2009;108(5):94–100. doi: 10.1016/j.tripleo.2009.07.031. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 7.Strom SC, Michalopoulos G. Collagen as a substrate for cell growth and differentiation. Methods Enzymol. 1982;82(Pt A):544–555. doi: 10.1016/0076-6879(82)82086-7. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 8.Grinnell F, Bennett MH. Ultrastructural studies of cell: collagen interactions. Methods Enzymol. 1982;82(Pt A):535–544. doi: 10.1016/0076-6879(82)82085-5. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 9.Elsdale T, Bard J. Collagen substrata for studies on cell behavior. J Cell Biol. 1972;54(3):626–637. doi: 10.1083/jcb.54.3.626. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 10.Woo KM, Chen VJ, Ma PX. Nano-fibrous scaffolding architecture selectively enhances protein adsorption contributing to cell attachment. J Biomed Mater Res A. 2003;67(2):531–537. doi: 10.1002/jbm.a.10098. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 11.Wang J, Ma H, Jin X, et al. The effect of scaffold architecture on odontogenic differentiation of human dental pulp stem cells. Biomaterials. 2011;32(31):7822–7830. doi: 10.1016/j.biomaterials.2011.04.034. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 12.Kuang R, Zhang Z, Jin X, et al. Nanofibrous spongy microspheres enhance odontogenic differentiation of human dental pulp stem cells. Adv Healthc Mater. 2015;4(13):1993–2000. doi: 10.1002/adhm.201500308. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 13.Kwon YS, Lee SH, Hwang YC, et al. Behaviour of human dental pulp cells cultured in a collagen hydrogel scaffold cross-linked with cinnamaldehyde. Int Endod J. 2017;50(1):58–66. doi: 10.1111/iej.12592. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 14.Coyac BR, Chicatun F, Hoac B, et al. Mineralization of dense collagen hydrogel scaffolds by human pulp cells. J Dent Res. 2013;92(7):648–654. doi: 10.1177/0022034513488599. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 15.Pan S, Dangaria S, Gopinathan G, et al. SCF promotes dental pulp progenitor migration, neovascularization, and collagen remo-deling: potential applications as a homing factor in dental pulp regeneration. Stem Cell Rev. 2013;9(5):655–667. doi: 10.1007/s12015-013-9442-7. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 16.Kim JJ, Bae WJ, Kim JM, et al. Mineralized polycaprolactone nanofibrous matrix for odontogenesis of human dental pulp cells. J Biomater Appl. 2014;28(7):1069–1078. doi: 10.1177/0885328213495903. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 17.Liu H, Ding X, Zhou G, et al. Electrospinning of nanofibers for tissue engineering applications. J Nanomater. 2013;47(2013):63–72. [Google Scholar]
- 18.Huang GT, Gronthos S, Shi S. Mesenchymal stem cells derived from dental tissues vs. those from other sources: their biology and role in regenerative medicine. J Dent Res. 2009;88(9):792–806. doi: 10.1177/0022034509340867. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 19.Kumar G, Tison CK, Chatterjee K, et al. The determination of stem cell fate by 3D scaffold structures through the control of cell shape. Biomaterials. 2011;32(35):9188–9196. doi: 10.1016/j.biomaterials.2011.08.054. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 20.Chen CS, Mrksich M, Huang S, et al. Geometric control of cell life and death. Science. 1997;276(5317):1425–1428. doi: 10.1126/science.276.5317.1425. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 21.Folkman J, Moscona A. Role of cell shape in growth control. Nature. 1978;273(5661):345–349. doi: 10.1038/273345a0. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 22.McBeath R, Pirone DM, Nelson CM, et al. Cell shape, cytoske-letal tension, and RhoA regulate stem cell lineage commitment. Developmental Cell. 2004;6(4):483–495. doi: 10.1016/s1534-5807(04)00075-9. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 23.Lee JH, Lee JW, Khang G, et al. Interaction of cells on chargeable functional group gradient surfaces. Biomaterials. 1997;18(4):351–358. doi: 10.1016/s0142-9612(96)00128-7. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 24.Khorasani MT, Mirzadeh H, Irani S. Plasma surface modification of poly (-lactic acid) and poly (lactic-co-glycolic acid) films for improvement of nerve cells adhesion. Radiat Phys Chem. 2008;77(3):280–287. [Google Scholar]