脱落细胞DNA 定量分析在口腔潜在恶性疾病诊断中的准确性

Abstract

Objective

To evaluate the diagnostic efficiency of oral mucosa disease, especially oral squamous cell carcinoma (OSCC) and oral potential malignant disorders (OPMDs) by DNA cytometry compared with histopathological diagnosis, so as to find a convenient, simple and low-invasive method for screening and follow-up.

Methods

203 subjects with OSCC, OPMDs and other oral mucosa disease without dysplasia according to the inclusion criteria and exclusion criteria were recruited from Peking University School and Hospital of Stomatology. The mean age was (52.44±13.55) years, 98 males and 105 females. Brush biopsy was taken before scalpel biopsy at the same site. The brush biopsy sample was screened by moticytometer system for DNA cytometry after Feulgen stain, and histopathological examination were taken for the scalpel tissue. Data from DNA cytometry were used to calculate the parameters, such as sensitivity, specificity, positive and negative predictive values, odds ratios, Youden index (YI), positive and negative likelihood ratios, compared with the golden standard, histopathological diagnosis. DNA cytometry and histopathological diagnosis were performed back to back.

Results

Totally, 42 OSCC and 4 tumor in situ (TIS), 39 oral leukoplakia (OLK) with dysplasia (17 mild dysplasia, 13 medium dysplasia and 9 severe dysplasia), 29 OLK with hyperplasia, 1 verrucous OLK, 83 oral lichen planus (OLP) and 5 inflammation were included in our research. We grouped the OSCC, TIS and dysplasia as the positive group and others without dysplasia as the negative group, the sensitivity of DNA cytometry was 79.07%, the specificity was 81.20%, and the diagnostic accuracy was 80.30%,We grouped the OSCC and TIS as the tumor group, OLP, OLK with hyperplasia and inflammation as the non-tumor group, The sensitivity of DNA cytometry in diagnosing OSCC and TIS was 95.65%, and the specificity was 81.2%, The diagnostic accuracy was 85.28%. positive predictive values 66.67%, negative predictive values 97.94%, ratio odds 95, positive likelihood ratio 5.09, negative likelihood ratio 0.05, and Youden index 0.77. For the dysplasia, we grouped the different dysplasia together as the dyaplasia group, OLP, OLK with hyperplasia and inflammation as the non-tumor group, the sensitivity of DNA cytometry in diagnosing dyaplasia is 60%, the specificity is 81.2%. The diagnostic accuracy is 75.8%, positive predictive values 52.17%, negative predictive values 85.59%, ratio odds 6.48,positive likelihood ratio 3.19, negative likelihood ratio 0.49, and Youden index 0.41.

Conclusion

DNA cytometry is convenient and low-invasive, which can be used as an adjuvant method for screening the early OSCC and OPMDs, monitoring the prognosis of OSCC after surgery. Further large-scale and long period prospective studies are necessary to validate the better value of DNA cytometry.

口腔癌是头颈部常见的恶性肿瘤, GLOBOCAN统计,2012年全球新发的口咽部肿瘤442 760例,死亡241 458例^[1]。我国新发肿瘤病例中的1.2%是口咽部肿瘤^[2], 5年生存率在50.4%左右^[3]。有研究报道70%~90%的口腔癌患者均是由口腔黏膜潜在恶性疾病转变而来,2018年的meta分析结果表明,全世界范围内口腔潜在恶性疾病(oral potential malignant disorders, OPMDs)的患病率是4.47%^[4],据报道,白斑每年的癌变率为2%~3%^[5],口腔扁平苔藓的癌变率约为1.1%^[6],因此具有癌变风险的OPMDs的早期筛查和诊断具有重要的临床意义,且随着上皮异常增生程度的加重,癌变的风险增加^[7]。目前临床上诊断口腔黏膜上皮异常增生的金标准是组织病理学检查,因其有创性和主观性,临床应用有一定限制,尤其是在随访期,由于活检取材的限制,会影响对预后的判断,因此临床急需一种创伤小且敏感性、特异性较高的辅助检查方法,协助诊断及预后判断。DNA异倍体和染色体异倍体一致,其可以作为细胞恶性变的标志在国际上已经得到广泛认可^[8]。使用DNA定量检测系统可以自动检测脱落细胞的细胞核DNA含量,是一种微创、快速、客观的检查方法。本研究拟采用前瞻双盲的方法,使用DNA定量分析系统,分析口腔黏膜脱落细胞诊断口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)和OPMDs的灵敏度和特异度,评价DNA定量分析系统诊断的准确性及临床应用价值。

1. 资料与方法

1.1. 研究对象

选择2015年9月到2017年2月,在口腔黏膜科门诊和口腔颌面外科门诊就诊的患者作为研究对象。

本研究开始前已经北京大学口腔医院生物医学伦理委员会审查批准(批准号:PKUSSIRB-201520013), 所有研究对象均签署知情同意书。

1.1.1 纳入标准 (1) 18~75岁,男女不限;(2)临床和病理诊断符合口腔白斑病(oral leukoplakia, OLK)伴黏膜上皮单纯增生或者轻、中、重度异常增生,口腔扁平苔藓(oral lichen planus, OLP),OSCC以及其他无异常增生患者;(3)受试者自愿参加并签署知情同意书。

1.1.2 排除标准 (1)全身状况较差,不能耐受取样刷操作者;(2)妊娠、哺乳期妇女;(3)有精神疾患不能很好合作者;(4)经病理学检查,证实不符合入选标准中病理诊断的患者。

1.1.3 样本量计算 样本量计算根据单个诊断试验样本含量计算方法,计算公式:

$n=\frac{u_{\alpha /2}^{2}P(1-P)}{{\delta }^2}$,

式中n为所需例数,u_α/2为检验水准α所对应的双侧正态分布界值,P为灵敏度或特异度的预期值(计算阳性组样本量P为灵敏度,计算阴性组样本量P为特异度), δ为允许误差。若设定允许误差δ=0.08,检验水准α =0.05( u_δ/2=1.96), 根据既往研究的灵敏度86.36%和特异度90%^[9],计算出阴性组需要54例,阳性组需要71例,根据阳性和阴性的构成比推算出在调查人群中的患病率为 56.8%,根据计算公式N=K×Q/P,允许误差为15%,K=178,最后需要的样本量总数至少为135例。

1.2. 取材方法

组织病理学检查前,注射麻药后先进行口内消毒,用专用毛刷在拟活检部位同方向中等力度旋转10~15次,然后将毛刷放入专用的标记受试者信息细胞保存液中。脱落细胞取材后,在脱落细胞取材部位切取组织,用于组织病理学检查。

1.3. 标本制作和DNA定量分析

将装有毛刷的细胞保存液转移到15 mL离心管, 2 000 r/min离心15 min,弃上清液,在细胞沉渣中滴入100~200 μL细胞保存液,震荡后吸取50 μL置于载玻片,晾干,BS液固定30 min,盐酸酸化25 min,Feulgen染色40 min,梯度酒精脱水后树脂封片,置于DNA定量分析系统配置的显微镜下观察,使用DNA定量分析系统 moticytometer分析。操作指南中对于口腔标本的要求为≥200个细胞即为满意,本研究中的样本均符合细胞数量要求。

1.4. 细胞学结果的判读

本研究moticytometer系统所需要的显微镜、计算机、显示器以及扫描软件等均由厦门麦克奥迪医疗诊断系统有限公司提供。DNA定量分析系统采用全自动数码显微镜以及摄像头对标本切片中的细胞进行扫描,以标本中的正常细胞作为内参照,并根据参数特征对被测细胞核进行自动分类和计数,其中DNA指数(DNA index,DI)为关键参数,表示DNA含量。正常上皮细胞DI为1.00±0.25,对于增生或疑似病变细胞,1.25<DI <2.50, DI≥2.50时,则为病变细胞。淋巴细胞、中性粒细胞、细胞碎片等不参与诊断分析。分析结果如下:(1) 阴性:未见DNA倍体异常细胞; (2) 5%~10%增生:可见少量细胞增生;(3) 1~2个 DI≥2.5:可见少量DNA倍体异常细胞;(4) ≥10% 增生:可见细胞异常增生;(5) 3个及3个以上DI≥2.5:可见DNA倍体异常细胞;(6)可见异倍体细胞峰。结果(1)代表检测阴性, (2)、(3)代表可疑或少量病变, (4)~ (6)代表检测阳性。所有诊断标准均按照系统提供的技术手册和操作指南。本研究的DNA定量分析结果为电脑自动生成。

1.5. 组织病理学检查

HE染色后判读结果由两位病理医师根据2005年WHO关于上皮组织异常增生分类进行判别。根据上皮异常增生程度分为无异常增生(包括单纯增生、OLP、炎症等),轻、中、重度异常增生,原位癌,OSCC早期浸润以及OSCC。异常增生以较重结果判定。

1.6. 盲法

在判定结果的时候采用盲法,即病理医师和DNA诊断医师互盲。

1.7. 统计学分析

使用SPSS17.0软件计算患者一般信息。以组织病理学诊断结果作为金标准,计算DNA定量分析系统诊断的灵敏度、特异度、准确度、阳性预测值、阴性预测值、诊断比值比、阳性似然比、阴性似然比和Youden指数。

2. 结果

2.1. 研究对象的一般资料

共纳入脱落细胞样本203例,其中男性98例,女性105例,年龄(52.44±13.55)岁。病理诊断包括OSCC,OSCC早期浸润,TIS,OLK伴上皮单纯增生,OLK伴上皮轻、中、重度异常增生,OLP以及炎症(表1)。

1.

组织病理学诊断和DNA定量分析基本情况

Description of the histopathological diagnosis and DNA cytometry

Pathological diagnosis	DNA cytometric			Total
	-	±	+
OSCC, oral squamous cell carcinoma; TIS, tumor in situ; OLK, oral leukoplakia; OLP, oral lichen planus.
OSCC	1	4	25	30
OSCC, early infiltration	1	2	9	12
TIS	0	2	2	4
OLK, hyperplasia	23	3	3	29
OLK, mild dysplasia	9	4	4	17
OLK, medium dysplasia	3	2	8	13
OLK, severe dysplasia	4	1	4	9
OLP	67	11	5	83
Inflammation	5	0	0	5
Verrucous OLK, active hyperplasia	0	0	1	1
Total	113	29	61	203

2.2. DNA定量分析在诊断OSCC、 TIS和上皮异常增生的情况

将上皮无异常增生组作为阴性组,将有异常增生包括癌变作为阳性组,以组织病理学诊断结果作为金标准,比较DNA定量分析系统的诊断效力(表2), 同时分别比较DNA定量分析系统在诊断OSCC(表3)以及口腔黏膜上皮异常增生(表4)时的结果。计算此部分结果时,将阳性和可疑合并为阳性结果进行分析。

2.

组织病理学诊断和DNA定量分析诊断比较

Comparison of histopathology and DNA cytometry

Items	Histopathology +	Histopathology -	Total
DNA cytometry +	68	22	90
DNA cytometry -	18	95	113
Total	86	117	203

3.

组织病理学诊断和DNA定量分析诊断口腔鳞状细胞癌比较

Comparison of histopathology and DNA cytometry in OSCC and TIS

Items	Histopathology +	Histopathology -	Total
DNA cytometry +	44	22	66
DNA cytometry -	2	95	97
Total	46	117	163

4.

组织病理学诊断和DNA定量分析诊断上皮异常增生比较

Comparison of histopathology and DNA cytometry in dysplasia

Group	Histopathology +	Histopathology -	total
DNA cytometry +	24	22	46
DNA cytometry -	16	95	111
Total	40	117	157

以口腔扁平苔藓、口腔白斑上皮单纯增生和炎症为阴性组;以上皮异常增生、TIS、早期浸润以及OSCC为阳性组,DNA定量分析系统诊断灵敏度为79.07%(95%CI: 68.69%~86.80%),特异度为81.20%(95%CI: 72.7%~87.6%),准确度为80.30%,阳性预测值75.56%(95%CI: 65.16%~83.74%),阴性预测值84.07%(95%CI: 75.72%~90.04%), 诊断比值比16.19,阳性似然比4.21(95%CI: 2.84~6.22), 阴性似然比0.26(95%CI: 0.17~0.39), Youden指数为0.60。

以口腔扁平苔藓、口腔白斑上皮单纯增生和炎症为非鳞癌组;以TIS、早期浸润以及OSCC为鳞癌组,DNA定量分析系统诊断灵敏度为95.65%(95%CI: 83.96%~99.24%),特异度为81.20%(95%CI: 72.7%~87.6%), 准确度为85.28%, 阳性预测值66.67% (95%CI: 53.88%~77.50%), 阴性预测值97.94% (95%CI: 92.03%~99.64%),诊断比值比95,阳性似然比5.09 (95%CI: 3.47~7.45), 阴性似然比0.05 (95%CI: 0.01~0.21),Youden指数为0.77。

以口腔扁平苔藓、口腔白斑上皮单纯增生和炎症为非上皮异常增生组,以上皮异常增生及增生活跃为异常增生组,DNA定量分析系统诊断灵敏度为60.00%(95%CI: 43.39%~74.72%),特异度为81.20%(95%CI: 72.7%~87.6%),准确度75.80%,阳性预测值为52.17% (95%CI:37.13%~66.86%), 阴性预测值为85.59% (95%CI:77.35%~91.28%), 诊断比值比为6.48,阳性似然比3.19 (95%CI:2.03~5.02), 阴性似然比0.49 (95% CI:0.34~0.72),Youden指数为0.41。

2.3. DNA定量分析系统在不同程度上皮异常增生诊断的差异

以口腔扁平苔藓、口腔白斑上皮单纯增生和炎症为非上皮异常增生组,分别计算DNA定量分析系统在诊断上皮轻、中、重度异常增生的情况(表5)。通过对不同程度的异常增生分层分析,发现DNA定量分析系统诊断不同程度异常增生的灵敏度为中度异常增生>重度异常增生>轻度异常增生。

5.

DNA定量分析诊断上皮异常增生的灵敏度、特异度和准确度

The sensitivity, specificity and accuracy of DNA cytometry in different stages of dysplasia /%

Group	Sensitivity (95%CI)	Specificity (95%CI)	Accuracy (95%CI)
Mild dysplasia	47.06 (23.86-71.47)	81.20 (72.7-87.6)	64.13
Medium dysplasia	76.92 (45.98-93.84)	81.20 (72.7-87.6)	79.06
Severe dysplasia	55.56 (22.65-84.66)	81.20 (72.7-87.6)	68.38

3. 讨论

口腔癌是头颈部常见的恶性肿瘤,有研究报道70%~90%的口腔癌患者均是由OPMDs转变而来,因此具有癌变风险的OPMDs的早期筛查和诊断具有重要的临床意义,多年来有很多研究致力于使用简便、创伤小、准确性高的方法进行OPMDs的筛查,包括甲苯胺蓝染色^[10]、脱落细胞的微核计数^[11]、组织荧光成像(例如VELscope)^[12]等。上述多种方法均为主观判断结果,且有的临床操作费时费力。甲苯胺蓝染色是活体染色,作为诊断口腔黏膜上皮异常增生的方法,容易出现假阳性结果。DNA定量分析技术是临床常规检测方法之一,除了宫颈黏膜脱落细胞的检测外,多种脱落细胞(如口腔黏膜脱落细胞,胸水、腹水和尿液中的细胞诊断等)均可使用DNA定量分析技术^[13,14]。

本研究采用DNA定量分析系统,以组织病理学为金标准对OSCC、OLK伴上皮异常增生、OLK单纯增生、没有异常增生的OLP,以及炎症进行了诊断,以评价DNA定量分析系统的诊断效能。诊断口腔癌相关的疾病包括OSCC 30例,OSCC早期浸润12例,TIS 4例。46例中DNA定量分析诊断阳性45例,灵敏度和特异度分别是95.65%和 81.20%。国内有学者研究52例OPMDs,DNA定量分析的灵敏度为86.36%,特异度为90%^[9],与本研究结果基本相似。Xiao等^[15]研究65例口腔白斑患者,发现异常增生程度高者,DNA定量分析异常的比例升高,DNA定量分析的结果与口腔白斑的分级呈正相关。

本研究共纳入上皮异常增生者39例,其中轻度17例,中度13例,重度9例。在诊断中度异常增生时,灵敏度和特异度均较高,达到76.92%和81.20%,而轻度和重度异常增生时,灵敏度较低,分别为47.06%和55.56%。国内学者研究报道,DNA倍体异常的比率随着异常增生程度的升高而增加^[15],分析本研究轻度和重度异常增生灵敏度较低的可能原因,一是轻度异常增生时,发生病变的细胞较少;二是重度异常增生的患者例数较少,可能出现偏倚;三是重度异常增生的患者一般是颗粒型白斑或者红白斑,上皮萎缩的病损比较明显,因此可能出现刷取的细胞数量不足的问题,导致了假阴性结果;四是可能因为炎性渗出较多,刷取了大量的粒细胞,而没有收集到足够的上皮细胞,造成了结果的不准确。这也提示在以后取样的过程中,对于类似临床表现的病损,为了获得更好的结果,细胞能够较好地平铺在载玻片上,需要避开炎症期,避免渗出对刷取脱落细胞取材的影响。如果必须感染期取材,建议感染控制以后重新取材,或者在不同时期进行多次取材,以提高诊断的准确性。

在组织病理学显示为OLP、OLK单纯增生以及炎症的117例中,DNA定量分析的结果和组织病理学检查结果不一致,出现了22例假阳性,出现假阳性结果的原因可能有3个,一是DNA倍体的改变要在组织病理学变化早1~15个月,这可以解释部分假阳性结果的出现的原因,因此需要对此类患者的长期随访以及定期脱落细胞的DNA定量分析进行验证,虽然组织病理学目前是诊断的金标准,但是假阳性结果是否真的是“假”阳性仍有待商榷;二是在制片过程中,脱落细胞的重叠容易出现假阳性结果,有时为了保证检测细胞数量足够,可能出现细胞重叠;三是因为糜烂型OLP较斑纹型OLP病情更重,且会影响到病理诊断的准确性,因此针对糜烂型OLP的患者,在糜烂愈合以后行组织病理学检查,也可能出现假阳性。

本研究是诊断研究,没有进行随访,因此也无法追踪癌变情况,因此在后续的工作中需要进行患者的长期随访,以评价其在诊断和预测预后中的作用。Liu等^[16]根据DNA定量的结果建立了统计学模型,用于计算白斑的恶变风险度。本研究设定的关于阳性、阴性和可疑的标准是根据使用手册进行评价的,对所有来源的脱落细胞,包括宫颈、尿液、胸水、腹水等都采用同样的标准。考虑到不同部位上皮结构的不同以及获取脱落细胞的数量不同,我们认为当研究中有足够的样本量时,可以考虑设定阈值,找到一个能达到最高的灵敏度和特异度的的DI值。DNA定量分析技术,是采用计算机辅助的自动检测方式,有明确的诊断标准,结果相对客观,可与其他检查方法联合应用进行OSCC及OPMDs的筛查,以增加诊断的灵敏度和特异度,提高临床诊断效率。

综上所述,脱落细胞的DNA定量分析系统是一种快速,微创的检查手段,具有良好的灵敏度、特异度以及诊断准确度,在OSCC以及OPMDs的筛查和早期诊断,尤其是OSCC患者长期随访监测中具有一定的作用。

Funding Statement

北京大学口腔医学院临床新技术新疗法项目（PKUSSNCT-15A05）

Supported by the Program for New Clinical Techniques and Therapies of Peking University School and Hospital of Stomatology(PKUSSNCT-15A05)