Abstract
目的
评估miR-106b-5p对内皮细胞基因表达谱的影响。
方法
对动脉粥样硬化组(n=9)及对照组(n=9)血浆中miRNAs表达谱进行筛查,采用共表达网络分别对两组样本全体miRNAs 的共表达模式进行分析。选取从两组网络中得到的共表达地位差异最为显著的miR-106b-5p进一步研究,通过转染miR-106b-5p mimics上调人脐静脉内皮细胞的miR-106b-5p表达水平,筛查转染后差异基因表达谱,并进一步通过日本京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)信号转导通路数据库对差异基因富集的信号通路进行分析。
结果
动脉粥样硬化组患者血浆中miRNAs的共表达模式(140个节点,1 154条连接线)与对照组(140个节点,612条连接线)相比存在明显差异,在过表达miR-106b-5p后人脐静脉内皮细胞有746个基因水平发生了显著变化(组间差异倍数≥1.5,芯片错误发现率<0.01),主要包括磷脂酰肌醇-3激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,PKB,又称Akt)信号通路、哺乳动物雷帕霉素受体蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号通路、转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)信号通路、酪氨酸激酶-信号转导及转录激活因子信号通路(janus kinase / signal transducer and activator of transcription,Jak-STAT)信号通路、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)信号通路、toll样受体(toll-like receptor,TLR)信号通路、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)信号通路等20个信号通路。
结论
动脉粥样硬化患者血浆中miRNAs共表达模式发生了显著变化,其中共表达地位差异最为显著的miR-106b-5p可靶向调节血管内皮细胞多个信号通路。
Keywords: 动脉粥样硬化, 微RNAs, 转录组, 内皮细胞
Abstract
Objective
To evaluate the role of miR-106b-5p in the regulation of gene expression in endothelial cells.
Methods
The Taqman low-density microRNAs (miRNAs) array (TLDA) was used to identify miRNA expression profiles in the plasma of patients with atherosclerotic coronary artery disease (CAD) (atherosclerosis group, n=9) and individuals without atherosclerotic CAD disease (control group, n=9). A weighed and undirected miRNA coexpression network analysis was performed to investigate the interactions among miRNAs in the two groups. MiR-106b-5p, whose coexpression pattern in atherosclerosis group was most different from that of control group, was further studied. Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) were transfected with miR-106b-5p mimic or negative control mimic, and Affymetrix GeneChip Human Transcriptome Array 2.0 was used to screen the differential gene expression profiles after transfection. And the signal transduction pathway of differential gene profiles was further analyzed in Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) signal pathway database. After parsing the whole KEGG database, all differentially expressed genes involved pathways were extracted, and the hypergeometric distribution was used to calculate the pathway enrichment.
Results
The coexpression pattern of the patients with atherosclerosis (140 nodes, 1 154 edges) differed from that of the non-atherosclerosis control group (140 nodes, 612 edges). The analysis of array data with significant analysis of microarray (SAM) identified 746 significantly deregulated genes (fold change ≥ 1.5 and false discovery rate < 0.01) altered by overexpression of miR-106b-5p with miR-106b-5p mimic in HUVEC. By calculating the pathway enrichment, we found that multiple signaling pathways enriched in differential gene profiles were closely related to the process of formation and rupture of atherosclerotic plaque, including phosphatidylinositol-3 kinase (PI3K)/ protein kinase B (PKB, also called Akt), mammalian target of rapamycin (mTOR), transforming growth factor-β (TGF-β), janus kinase / signal transducer and activator of transcription (Jak-STAT), tumor necrosis factor (TNF), toll like receptor (TLR) and hypoxia-inducible factor 1α (HIF-1α) and other signal pathways.
Conclusion
The coexpression pattern of miRNAs in plasma of patients with atherosclerosis is more significantly changed than that of individuals without atherosclerotic disease. MiR-106b-5p, which shows the most significant dif-ference between groups, targets multiple signal pathways in vascular endothelial cells, and might play an important role in the regulatory network of atherosclerotic gene expression.
Keywords: Atherosclerosis, MicroRNAs, Transcriptome, Endothelial cells
microRNAs(miRNAs)是一类在进化上高度保守的非编码小分子单链RNA(约22 nt),在转录后水平负性调控基因表达[1]。目前在人体中已发现1 000多个miRNAs,约30%的人类蛋白编码基因受到miRNAs的调控[2]。我们以往的研究表明,冠状动脉(冠脉)粥样硬化性心脏病患者血浆中存在包括miR-106b-5p等在内的多种miRNAs水平显著升高[3],也有研究发现miR-106b-5p在脑卒中、癌症等疾病进程中发挥了重要的调控作用,通过靶向调节特定的靶基因可以调控细胞炎症反应、氧化应激、凋亡等重要环节[4,5]。
共表达网络分析是一种基于miRNAs整体网络背景下,系统分析每对miRNAs之间相互关系以及具体某个miRNAs在整体网络中的重要程度和贡献性的生物信息学技术[6]。
本研究拟将动脉粥样硬化疾病患者与对照者血浆中miRNAs表达谱进行比对,并进一步选取从两组样本的共表达网络得到的共表达地位差异最为显著的miRNA,进一步探讨目标miRNA对血管内皮细胞基因表达谱的调节作用。
1. 资料与方法
1.1. 研究对象的入选和排除标准
选择2011年12月至2013年10月于北京大学人民医院心血管内科住院并行冠脉造影检查的冠脉粥样硬化性心脏病患者,包括不稳定性心绞痛(unstable angina,UA)以及非心源性胸痛对照者。
UA患者的诊断标准参照2011年美国心脏病学会(American College of Cardiology,ACC)/美国心脏协会(American Heart Association,AHA)关于UA/非ST段升高心肌梗死(non-ST-elevation myocardial infarction,NSTEMI)的诊断和治疗指南。所有非心源性胸痛患者(对照组)经冠脉造影检查均未发现冠脉管腔狭窄,同时在入院之前未曾服用过他汀类药物,并经过随访明确其胸痛的原因为非心源性,如胃食管反流、心脏神经症等其他原因。
排除标准包括各种急慢性炎症、肝肾功能异常、自身免疫性疾病、恶性肿瘤以及血液系统疾病等。
获取入选者主要临床资料,包括年龄、性别、身高、体重、血压、腰围、臀围、临床血生化指标、高血压病史、糖尿病病史、高脂血症病史、吸烟状况及服用药物的情况等。
1.2. 血浆中miRNAs的提取和芯片检测
所有研究对象的血浆均在患者接受冠脉造影术之前抽取,使用EDTA抗凝管保存于4 ℃冰箱,于1 h内在4 ℃下分离血浆。参照文献[3]中的方法,采用miRNAs提取试剂盒(miRNeasy kit,Qiagen,德国)提取血浆中含有miRNAs的总RNAs,并进行miRNA反转录实验(A、B板分别采用15 ng RNA起始)。采用美国ABI公司的反转录试剂盒(TaqMan®Micro-RNA Reverse Transcription Kit)和miRNAs特异的反转录引物池(Megaplex® RT Primer Pools, Human Pools Set v3.0)进行miRNAs的反转录反应[3]。随后采用预扩增试剂(TaqMan® PreAmp Master Mix,2×)和miRNAs特异的Megaplex预扩增引物池(Megaplex® PreAmp Primer Pools,Human Pools Set v3.0)进行miRNAs的预扩增反应[3],采用美国ABI公司的Taqman低密度芯片(Taqman low-density array,TLDA, TaqMan Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0)进行筛查实验,采用Mamm U6作为内参,目标miRNAs的相对表达水平表示为2-(CT[miRNA]-CT[U6])。两组间差异倍数的计算采用2-ΔΔCt的方法[3]。
1.3. 共表达网络分析
采用miRNAs共表达网络分析进一步在整体miRNAs网络的背景下对miRNAs的表达模式进行分析,使用Cytoscape v.3.5.0软件分别对动脉粥样硬化组、对照组的miRNAs对进行共表达分析,得到疾病组和对照组各自的静态共表达整体网络[7]。
1.4. 人脐静脉内皮细胞培养及miRNA mimic转染
人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)获取于北京大学基础医学院。细胞接种于6孔板,待细胞融合率达70%~80%,换新的全培养液(含P/S双抗和血清)2.5 mL,进行miRNA mimic(或阴性对照negative control mimic)的转染,终浓度为30 nmol/L,转染所用试剂为Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent(Invitrogen,美国), 详细方法参照文献[8]。转染24 h后,用磷酸盐缓冲液清洗6孔板3遍,采用TRIzol法提取细胞总RNA。以实时聚合酶链反应(real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)实验检测转染后目标miRNA水平升高的倍数,采用miRNAs PCR预混试剂(TaqMan Universal PCR Master Mix,No Amp-Erase® UNG)及预设计的FAM染料标记miRNA MGB荧光探针(Taqman Small RNA Assay, 20×)。
1.5. 基因表达谱芯片筛查及信号通路富集性分析
进一步采用Affymetrix GeneChip Human Trans-criptome Array 2.0芯片对转染后的基因表达谱进行检测,使用微阵列显著性分析(significant analysis of microarray,SAM)软件包筛选差异表达的基因,通过设置错误发现率(false discovery rate,FDR)<0.01,差异倍数≥1.5,得到组间差异表达的基因。进一步通过日本京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)的信号通路数据库对差异基因富集的信号通路进行分析[9,10],构建基因间的相互作用网络[9,10,11]。
1.6. 统计学分析
数值型变量以均数±标准差表示,两组间差异性比较采用Student’s t检验;分类型变量采用百分率(%)表示,两组间差异性比较采用卡方(χ2)检验或Fisher精确概率法(Fisher’s exact test)。对双变量呈正态分布的连续性变量,采用Pearson线性相关分析,对双变量呈非正态分布的等级变量,采用Spearman等级相关分析。由SPSS 13.0统计软件完成,以P<0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1. miRNAs芯片试验研究对象的临床基线资料
共入选研究对象18例,其中包括冠脉粥样硬化性心脏病患者(动脉粥样硬化组,n=9)及经冠脉造影检查不存在冠脉粥样硬化症的非心源性胸痛患者(对照组,n=9)。对于芯片筛查对象,两组间各项临床基线资料(包括年龄、性别、体重指数、临床血生化指标、高血压病史、糖尿病病史及高脂血症病史等)差异无统计学意义(P>0.05,表1)。
1.
miRNAs芯片试验研究对象的临床基线资料
Clinical characteristics of the study population for plasma miRNAs profiling
| Items | Control group (n=9) | Atherosclerosis group (n=9) | P value |
| BMI, body mass index; PLT, platelet; WBC, white blood cell; LDL, low-density lipoprotein; CCB, calcium channel blocker; ACEI, angiotensin-converting enzyme inhibitor; ARB, angiotensin receptor blocker. Comparisons between groups were performed with Student’s t test for continuous variables and with the Fischer exact test or χ2 test for categorical variables. | |||
| Gender, Male/Female | 5/4 | 5/4 | >0.99 |
| Age/years, x±s | 56.1±9.3 | 60.4±9.0 | 0.33 |
| BMI/(kg/m2), x±s | 24.5±2.3 | 24.8±4.0 | 0.86 |
| PLT/(×1012/L), x±s | 219.2±79.3 | 209.3±46.2 | 0.75 |
| WBC/(×109/L), x±s | 6.9±2.8 | 5.8±1.5 | 0.31 |
| LDL cholesterol/(mmol/l), x±s | 2.5±0.9 | 2.4±0.5 | 0.65 |
| Hypertension, n(%) | 5 (55.6) | 8 (88.9) | 0.11 |
| Diabetes mellitus, n(%) | 1 (11.1) | 2 (22.2) | 0.53 |
| Hyperlipemia, n(%) | 5 (55.6) | 6 (66.7) | 0.63 |
| CCB, n(%) | 2 (22.2) | 3 (33.3) | 0.60 |
| Beta-blocker, n(%) | 3 (33.3) | 5 (55.6) | 0.34 |
| Aspirin, n(%) | 1 (11.1) | 4 (44.4) | 0.11 |
| Clopidogrel, n(%) | 0 | 3 (33.3) | 0.06 |
| ACEI, n(%) | 1 (11.1) | 2 (22.2) | 0.53 |
| ARB, n(%) | 1 (11.1) | 2 (22.2) | 0.53 |
2.2. miRNAs芯片共表达网络分析
对动脉粥样硬化组及对照组的血浆miRNAs进行Taqman miRNAs TLDA低密度芯片(A+B板)检测,并根据两组标本中miRNAs的表达水平的相关性分别建立共表达网络。在共表达网络中,每一个节点(node)代表一个miRNA,而节点与节点之间的连接线(edge/link)代表两个miRNAs之间存在表达水平线性相关关系。通过对共线性表达关系较强的miRNAs对(Pearson相关系数≥0.75,P<0.05,FDR<0.01)构建共表达网络,发现动脉粥样硬化组患者血浆中miRNAs的共表达模式(140个节点,1 154条连接线)与对照组(140个节点, 612 条连接线)相比存在明显差异(图1)。
1.
对照组(A)与动脉粥样硬化组(B)血浆中miRNAs的共表达网络分析图
Coexpression network analysis of plasma miRNAs in controls (A) and atherosclerosis patients (B)
因两个网络中所含的miRNA数量不同且表达关系也不同,为了进行更严谨的横向比较,本研究进一步对同一miRNA在不同网络中的miRNA值进行了标准化后再比较,标准化方法为将某一miRNA的连接度(degree)值除以该网络中连接度最大值[Normalized degree(i)=Degree(i)/Degree(Max)],然后比较同一miRNA在不同网络中标准化后连接度的差值(DiffK)以及该差值的绝对值(|DiffK|),来体现目标miRNA在不同网络中变化的程度(表2)[7]。本研究发现,miR-106b-5p在两组间共表达网络地位差异最为显著,|DiffK|值为0.78。
2.
组间共表达模式存在差异的miRNAs列表
miRNAs with differential coexpression pattern in the plasma of atherosclerosis patients compared to controls
| microRNA ID | Degree in atherosclerosis | Degree in controls | K1-atherosclerosis | K2-controls | |
| Data include miRNAs showing differential coexpression pattern (|DiffK|>0.5) in plasma of atherosclerosis patients (n=9) compared to controls (n=9). | |||||
| miR-106-5p | 43 | 7 | 1.00 | 0.21 | 0.78 |
| miR-636 | 4 | 28 | 0.09 | 0.85 | 0.76 |
| miR-302b | 3 | 27 | 0.07 | 0.81 | 0.75 |
| miR-15a* | 3 | 24 | 0.07 | 0.73 | 0.66 |
| miR-597 | 2 | 21 | 0.05 | 0.64 | 0.59 |
| miR-543 | 31 | 5 | 0.72 | 0.15 | 0.57 |
| miR-196b | 15 | 29 | 0.35 | 0.88 | 0.53 |
| miR-1271 | 6 | 22 | 0.14 | 0.67 | 0.53 |
| miR-212 | 6 | 22 | 0.14 | 0.67 | 0.53 |
| miR-29b | 33 | 8 | 0.77 | 0.24 | 0.53 |
| miR-365 | 25 | 2 | 0.58 | 0.06 | 0.52 |
| miR-19b-1* | 21 | 33 | 0.49 | 1.00 | 0.51 |
| miR-452 | 16 | 29 | 0.37 | 0.88 | 0.51 |
| miR-886-3p | 27 | 4 | 0.63 | 0.12 | 0.51 |
2.3. 过表达miR-106b-5p对HUVEC基因表达谱的影响
选取从两组样本的共表达网络得到的共表达地位差异最为显著的miR-106b-5p进行进一步研究。转染miR-106b-5p mimics后24 h,HUVEC的miR-106b-5p表达水平发生显著上调(组间差异倍数=1 401.2,P<0.001)。
采用高通量人基因表达谱芯片Affymetrix GeneChip Human Transcriptome Array 2.0筛查转染过表达miR-106b-5p后HUVEC细胞发生显著变化的mRNA表达谱,发现在过表达miR-106b-5p后,聚类分析的热图显示HUVEC细胞有746个基因水平发生了显著变化(组间差异倍数≥1.5,芯片FDR<0.01,图2),绝大多数为下调表达的负性调节作用(253个基因上调表达,493个基因下调表达)。
2.
转染miR-106b-5p mimics后人脐静脉内皮细胞基因表达谱发生显著变化
Profile of mRNAs in human umbilical vein endothelial cells transfected with miR-106b-5p mimics compared with negative control mimic
Heat map illustrates the levels of significantly changed mRNAs (fold change ≥ 1.5 and FDR<0.01) in human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) transfected with miR-106b-5p mimics compared with negative control mimic. Color intensity is scaled within each row, such that the highest expression value corresponds to bright red and the lowest to bright green.
2.4. 差异表达基因的信号通路富集性分析
进一步通过KEGG信号转导通路数据库对组间差异表达基因富集的信号通路进行信号通路富集性分析。目前,KEGG 是有关信号通路的主要公共数据库[9]。根据挑选出的差异基因,计算这些差异基因同信号通路的超几何分布关系,信号通路富集性分析会对每个有差异基因存在的信号通路返回一个P值,P 值具有显著性(P<0.05)表示组间差异表达基因在该信号通路中出现了富集[10]。同时基于KEGG信号转导通路数据库,还可寻找不同样品组间的差异表达基因可能参与调控的细胞通路,同时将上调及下调的差异基因映射到每一个信号通路地图上,定位关键通路的关键基因[10,11]。
通过信号通路富集性分析发现,在过表达miR-106b前后,HUVEC表达水平发生显著性变化的这部分基因主要在20个信号通路中出现了显著性富集(P<0.05,图3),其中有多个与动脉粥样硬化斑块形成过程、由稳定状态向不稳定状态转化的过程密切相关的信号通路,包括磷脂酰肌醇-3激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,PKB,又称Akt)信号通路、哺乳动物雷帕霉素靶向基因(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号通路、转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)信号通路、酪氨酸激酶-信号转导及转录激活因子信号通路(janus kinase / signal transducer and activator of transcription,Jak-STAT)信号通路、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)信号通路、toll样受体(toll-like receptor,TLR)信号通路、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)信号通路及缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α)等信号通路(图3)。
3.
人脐静脉内皮细胞中miR-106b-5p靶向调控的信号通路
Potential gene signaling pathway targets of miR-106b-5p in human umbilical vein endothelial cells
PI3K-Akt, phosphoinositide 3-kinase / protein kinase B; mTOR, mammalian target of rapamycin; Jak-STAT, janus kinase/signal transducer and activator of transcription; TGF-β, transforming growth factor-β; HIF-1, hypoxia-inducible factor 1; MAPK, mitogen-activated protein kinase; TNF, tumor necrosis factor; VEGF, vascular endothelial growth factor; ECM, extracellular matrix. Potential gene signaling pathway targets of miR-106b-5p in human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) that showed significant difference between groups (HUVEC transfected with miR-106b-5p mimics compared with negative control mimic, P<0.05) were listed. The P value of each gene signaling pathway target is presented in a negative value of logarithmic form (-lgP), which indicate that the higher the value, the higher the significance level of the gene signaling pathway.
本研究进一步基于KEGG数据库,利用KEGG数据库中的基因之间、基因产物之间的作用关系,通过数据库搜索得到每个基因与其他基因的作用关系,发现目标基因群之间作用关系,突破单一的信号通路,在整个数据库中定位上游蛋白和下游蛋白,而后构建基因间的全局信号转导网络(图4)[10,11]。从该网络图中可以看出,miR-106b-5p的多个靶基因,包括PI3K、AKT/PKB、JAK、TGF-β和磷酸酶-张力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog,PTEN)等连接度>10的基因在该信号转导网络中均起到了非常重要的作用。
4.
人脐静脉内皮细胞中miR-106b-5p靶向调控基因及其上、下游基因所构建的全局信号转导网络
Global signal transduction network constructed with potential gene targets of miR-106b-5p and the upstream and downstream genes in human umbilical vein endothelial cells
Using the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) database, the relationship between the miR-106b-5p-targeting genes and the upstream and downstream genes/proteins could be found, and the global signal transduction network (interaction network) between genes could then be constructed. Red spots represented upregulated genes, and blue spots indicated downregulated genes.
3. 讨论
一系列研究提示血管内皮细胞损伤是动脉粥样硬化疾病发生的始动因素[12], 而miRNAs通过参与调控血管内皮细胞的功能,从而影响动脉粥样硬化的发生和发展,加速斑块由稳定状态向不稳定状态转化[13]。我们以往的研究表明,不稳定性冠状动脉粥样硬化性心脏病患者血浆中多种miRNAs水平显著升高,且其升高的原因可能是由于疾病状态下血管内皮细胞源性的微颗粒数量的显著增加导致的[3],这些在患者血浆中水平升高的miRNAs可能来自于血管内皮细胞的释放,且在动脉粥样硬化疾病状态下血管内皮细胞中miR-106b-5p水平反而会发生降低[3]。
共表达网络分析是一种系统分析每对miRNAs之间相互关系的方法,这种将单个miRNAs的水平改变置于整体miRNAs共表达相关网络背景之下的分析方法优于以往专注于单个miRNA水平上调还是下调的传统分析方法[6, 14]。本研究进一步采用了共表达网络分析对全体miRNAs的共表达模式进行了系统分析,发现动脉粥样硬化患者血浆中的miRNAs不仅表达水平发生了显著变化,而且动脉粥样硬化组共表达网络所包含的连接线数量(miRNAs之间的共表达关系)要远远高于对照组,这种有趣的现象可能再次揭示了miRNAs在疾病状态下所发挥的协同调控作用。
之后,本研究根据 miRNAs 在动脉粥样硬化组样本与对照组样本的两个网络中共表达地位的差异情况,发现miR-106b-5p的|DiffK|值为整个共表达网络中最高值,在两组间共表达网络地位差异最为显著,从生物信息学角度分析,相较于网络中其余的miRNAs,miR-106b-5p所处的位置对于全体共表达网络具有更重要的调控价值,对于维系网络的稳定性处于极重要的地位[6, 14]。以往研究发现,miR-106b-5p可通过靶向调节髓细胞白血病-1(myeloid cell leukemia-1,MCL-1)基因的表达水平,从而在缺血性脑卒疾病进程中抑制细胞凋亡和氧化应激反应,可能是缺血性脑卒中疾病的潜在治疗靶点[4]。此外,miR-106b-5p还可调节PI3K/ AKT信号通路,从而在乳腺癌疾病进程中发挥重要调控作用[5]。因此,本研究选择miR-106b-5p作为进一步离体血管内皮细胞试验的研究对象,发现转染miR-106b-5p mimics后,血管内皮细胞的基因表达谱发生了显著变化。
本研究进一步通过KEGG信号转导通路数据库对组间差异表达基因靶向调控的信号通路进行信号通路富集性分析,发现在过表达miR-106b-5p前后,HUVEC细胞表达水平发生显著性变化的这部分基因主要在20个信号通路中出现了显著性富集。在出现显著性富集的这部分信号通路中,有多个与动脉粥样硬化斑块形成过程、由稳定状态向不稳定状态转化的过程密切相关的信号通路,涉及炎症、凋亡、细胞趋化、血管新生以及DNA损伤修复等多方面作用[15,16,17,18],提示miR-106b-5p可通过调控血管内皮细胞功能的多个关键因素影响动脉粥样硬化斑块的形成及破裂过程。
本研究发现miR-106b-5p是PI3K/AKT/PTEN信号通路的重要调控因子,与以往研究一致[5, 8],可能通过抑制内皮细胞凋亡、抑制炎症因子释放等方式在动脉粥样硬化疾病起始阶段发挥保护血管内皮细胞作用[15,16]。此外,本研究发现miR-106b-5p是TGF-β信号通路的关键调节因素,可靶向TGF-β信号通路中多个关键性蛋白,而TGF-β信号通路正是决定炎症和纤维化平衡从而影响斑块不稳定性的关键性信号通路[17,18]。miR-106b-5p也可靶向调节Jak-STAT、TNF和TLR等重要炎症反应信号通路,可能从多个方面拮抗血管内皮细胞的炎症反应。此外,miR-106b-5p还可能通过调节血管新生相关的信号通路(VEGF、HIF-1α等)影响动脉粥样硬化斑块的稳定性。
本研究存在以下不足:(1)本研究仅选择了在两组间共表达网络地位差异最为显著的miR-106b-5p进行研究,其他在组间共表达地位存在显著差异的miRNAs的作用有待进一步研究。(2)本研究采用了表达谱芯片筛查和生物信息学预测的方法对miR-106b-5p的功能进行了初步研究,有必要通过体内和体外实验证实miR-106b-5p在动脉粥样硬化斑块形成和破裂过程中的作用和分子机制。
总之,本研究发现动脉粥样硬化患者血浆中miRNAs共表达模式发生了显著变化,其中共表达地位差异最为显著的miR-106b-5p可靶向调节血管内皮细胞多个基因表达,为基于miR-106b-5p的治疗策略向临床应用转化提供了参考,其功能及潜在的分子治疗价值值得进一步研究。
(本文编辑:赵 波)
Funding Statement
国家自然科学基金（81400264）
the National Natural Science Foundation of China(81400264)
References
- 1.Bartel DP. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 2004;116(2):281–297. doi: 10.1016/s0092-8674(04)00045-5. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 2.Small EM, Olson EN. Pervasive roles of microRNAs in cardiovascular biology. Nature. 2011;469(7330):336–342. doi: 10.1038/nature09783. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 3.Ren J, Zhang J, Xu N, et al. Signature of circulating microRNAs as potential biomarkers in vulnerable coronary artery disease. PLoS One. 2013;8(12):e80738. doi: 10.1371/journal.pone.0080738. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 4.Li P, Shen M, Gao F, et al. An antagomir to microRNA-106b-5p ameliorates cerebral ischemia and reperfusion injury in rats via inhibiting apoptosis and oxidative stress. Mol Neurobiol. 2017;54(4):2901–2921. doi: 10.1007/s12035-016-9842-1. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 5.Li N, Miao Y, Shan Y, et al. MiR-106b and miR-93 regulate cell progression by suppression of PTEN via PI3K/Akt pathway in breast cancer. Cell Death Dis. 2017;8(5):e2796. doi: 10.1038/cddis.2017.119. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 6.Wang J, Haubrock M, Cao KM, et al. Regulatory coordination of clustered microRNAs based on microRNA-transcription factor regulatory network. BMC Syst Biol. 2011;5(12):199. doi: 10.1186/1752-0509-5-199. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 7.Prieto C, Risueño A, Fontanillo C, et al. Human gene coexpression landscape: confident network derived from tissue transcriptomic profiles. PLoS One. 2008;3(12):e3911. doi: 10.1371/journal.pone.0003911. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 8.Zhang J, Li SF, Chen H, et al. MiR-106b-5p inhibits tumor necrosis factor-α-induced apoptosis by targeting phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10 in vascular endothelial cells. Chin Med J (Engl) 2016;129(12):1406–1412. doi: 10.4103/0366-6999.183414. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 9.Ogata H, Goto S, Sato K, et al. KEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes. Nucleic Acids Res. 1999;27(1):29–34. doi: 10.1093/nar/27.1.29. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 10.Du J, Yuan Z, Ma Z, et al. KEGG-PATH: Kyoto encyclopedia of genes and genomes-based pathway analysis using a path analysis model. Mol Biosyst. 2014;10(9):2441–2447. doi: 10.1039/c4mb00287c. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 11.Kanehisa M, Goto S, Sato Y, et al. KEGG for integration and interpretation of large-scale molecular data sets. Nucleic Acids Res. 2012;40(Database issue):D109–114. doi: 10.1093/nar/gkr988. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 12.Ross R. Atherosclerosis: an inflammatory disease. N Engl J Med. 1999;340(2):115–126. doi: 10.1056/NEJM199901143400207. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 13.任 景怡, 许 宁, 韩 冠平, et al. microRNAs 参与动脉粥样硬化疾病的发生. 中国生物化学与分子生物学报. 2011;27(6):511–515. [Google Scholar]
- 14.Zampetaki A, Willeit P, Drozdov I, et al. Profiling of circulating microRNAs: from single biomarkers to re-wired networks. Cardiovasc Res. 2012;93(4):555–562. doi: 10.1093/cvr/cvr266. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 15.Weber C, Noels H. Atherosclerosis: current pathogenesis and therapeutic options. Nat Med. 2011;17(11):1410–1422. doi: 10.1038/nm.2538. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 16.Zernecke A, Weber C. Chemokines in the vascular inflammatory response of atherosclerosis. Cardiovasc Res. 2010;86(2):192–201. doi: 10.1093/cvr/cvp391. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 17.Lutgens E, Daemen MJ. Transforming growth factor-β: a local or systemic mediator of plaque stability? Circ Res. 2001;89(10):853–855. [PubMed] [Google Scholar]
- 18.Lutgens E, Gijbels M, Smook M, et al. Transforming growth factor-beta mediates balance between inflammation and fibrosis during plaque progression. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2002;22(6):975–982. doi: 10.1161/01.atv.0000019729.39500.2f. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]