Genetic Testing in Autoinflammatory Diseases

Abstract

Autoinflammatory syndromes are characterized by periodic fever attacks in combination with increased inflammatory markers. The dysregulation of different cellular signaling pathways leads to an excessive immune response which can in turn promote multisystemic inflammatory processes. Due to overlapping symptoms, variable expressivity, and pleiotropy, a purely clinical diagnosis of autoinflammatory diseases is difficult in many cases. Because an early and definitive diagnosis can greatly improve the quality of life of many patients, molecular genetic methods have become an important part of the diagnostic process. With the development of next-generation sequencing (NGS), the genetic diagnosis of patients with autoinflammatory diseases has improved significantly. Considerable progress has not only been made in the genetic characterization of undiagnosed patients, but additionally in identifying numerous new disease-associated genes. However, the plethora of molecular genetic analysis methods makes it difficult to select the method with the highest diagnostic specificity and sensitivity. The NGS technologies have led to a strong increase in the number of identified variants, making the clinical evaluation of these variants more complex. Consensus-driven and standardized molecular diagnostic guidelines, both for the diagnostic process and for the interpretation of the obtained results, have therefore become essential.

1. Hinführung zum Thema

Autoinflammatorische Erkrankungen, auch periodische Fiebersyndrome genannt, beruhen auf eine Dysregulation des angeborenen Immunsystems. Heute sind fast 40 monogene autoinflammatorische Syndrome beschrieben, welche sich durch unspezifische und überlappende Krankheitssymptome auszeichnen. Eine Ergänzung der klinischen Diagnostik durch molekulargenetische Methoden kann daher in vielen Fällen dazu beitragen den Diagnoseprozess zu verkürzen. Dies ermöglicht eine zeitnahe, auf die Grunderkrankung des Patienten zugeschnittene Therapie und kann so zu einer Verbesserung der Lebensqualität führen.

2. Vererbung autoinflammatorischer Erkrankungen

Die meisten der heute beschriebenen autoinflammatorischen Syndrome folgen einem der klassischen Erbgänge und werden entweder autosomal-rezessiv, autosomal-dominant oder X-chromosomal rezessiv vererbt (Tabelle 1). Im Falle einer autosomal-rezessiven Vererbung trägt der Patient je eine krankheitsassoziierte Genvariante auf je einem der beiden elterlichen Allele (in trans). Die Pathogenese autosomal-rezessiver Erkrankungen beruht meist auf dem Verlust der Expression oder der Funktion eines essentiellen Proteins durch loss-of-function Varianten. Dabei beeinflusst die Menge an verbleibendem funktionsfähigem Protein maßgeblich die phänotypische Ausprägung der jeweiligen autoinflammatorischen Erkrankung. Als Beispiele hierfür dienen die Mevalonatkinase Defizienz (Hyper-IgD- Syndrom [HIDS]/Mevalonazidurie) , die Defizienz der Adenosin Deaminase 2 (DADA2), sowie die TRNT1 Defizienz (Sideroblastische Anämie, Immunschwäche und periodisches Fieber [SIFD]).

Tabelle 1:

Monogene autoinflammatorische Erkrankungen

Kategorie	Krankheit	Akronym	Gen	Protein	Vererbung
Inflammasomopathien	Familiäres Mittelmeerfieber / Pyrin-assoziierten Autoinflammation mit neutrophiler Dermatose	FMF/PAAND	MEFV	Pyrin	AD oder AR
	Hyperimmunglobulin D und periodisches Fiebersyndrom / Mevalonazidurie	HIDS/MKD	MVK	Mevalonate kinase	AR
	Neonalonsetmultsystemicinflammatory disease/Kälteinduziertes autoinflammatorisches Syndrom 1 / Muckle-Wells-Syndrom	NOMID/CINCA/FCAS-1/MWS	NLRP3	NACHT, LRR and PYD domains-containing protein 3	AD/De novo
	Kälteinduziertes autoinflammatorisches Syndrom 2	FCAS-2	NLRP12	NACHT, LRR and PYD domains-containing protein 12	AD
	NLRC4-abhängiges autoinflammatorisches Syndrom mit Makrophagen-Aktivierungssyndrom / Kälteinduziertes autoinflammatorisches Syndrom	NLRC4-MAS/FCAS-4	NLRC4	NLR family CARD domain-containing protein 4	AD/De novo
	Multiple Self-healing Palmoplantar Carcinoma Syndrom / Familial Keratosis Lichenoides Chronica / NLRP1-assoziierte Autoinflammation mit Arthritis und Dyskeratose	MSPC/FKLC/NAIAD	NLRP1	NACHT, LRR and PYD domains-containing protein 1	AD
	PLCG2-assoziierter Antikörpermangel und Immundysregulation / Autoinflammation und PLCG2-assoziierter Antikörpermangel und Immundysregulation	PLAID/APLAID	PLCG2	phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate phosphodiesterase gamma-2	AD
Aktin-assoziierte Erkrankungen	Pyogene Arthritis, Pyoderma gangrenosum und Akne / PSTPIP1-assoziiertes inflammatorisches Syndrom mit MRP8/14-Proteinämie / Pyoderma gangraenosum, Akne, suppurative Hidradenitis / Pyoderma gangraenosum, Akne, Colitis ulcerosa	PAPA/PAMI/PASH/PAC	PSTPIP1	Proline-serine-threonine phosphataseinteracting protein 1	AD
	Periodisches Fieber, Immunschwäche und Thrombozytopenie	PFIT	WDR1	WD repeat protein 1	AR
	ARPC1B Defizienz		ARPC1B	Actin-related protein 2/3 complex subunit 1B	AR
NF-kB Signalweg assoziierte Erkrankungen / Relopathien	Haploinsuffizienz von A20	HA20	TNFAIP3	Tumor necrosis factor alpha-induced protein 3/A20	AD/De novo
	Spaltungsresistene RIPK1-induziertes autoinflammatorisches Syndrom / Immunodefizienz mit Autoinflammation	CRIA	RIPK1	Receptor-interacting serine/threonine-protein kinase 1	AD oder AR
	Keratinozyten-spezifische CARD14-Hyperaktivität / CARD14-assoziierte Psoriasis	CAMPS	CARD14	Caspase recruitment domain-containing protein 14	AD
	OTULIN-assoziiertes autoinflammatorisches Syndrom	ORAS	OTULIN	Ubiquitin thioesterase otulin	AR
	Haploinsuffizienz von RELA		RELA	Transcription factor p65/RELA	AD
	HOIL1 Defizienz / Immunschwäche, Autoinflammation und Amylopektinose	PGBM	RBCK1	RanBP-type and C3HC4-type zinc finger-containing protein 1/HOIL1	AR
	HOIP Defizienz		RNF31	E3 ubiquitin-protein ligase RNF31/HOIP	AR
	Blau-Syndrom	BS	NOD2	Nucleotide-binding oligomerization domain-containing protein 2	AD
Proteinfaltung-assoziierte Erkrankungen und Interferonopathien	Sideroblatische Anämie, Immunschwäche und periodisches Fieber	SIFD	TRNT1	CCAtRNA nucleotidyltransfer ase 1	AR
	TNF-Rezeptor-assoziiertes periodisches Syndrom	TRAPS	TNFRSF1A	TNF receptor 1	AD
	STING-assoziierte Vaskulopathie	SAVI	TMEM173	Stimulator of interferon genes protein	AD/De novo
	Aicardi-Goutiéres Syndrome	AGS1-7	TREX1, RNASEH2B RNASEH2C RNASEH2A SAMHD1 ADAR1 IFIH1	Proteine zur Detektion und Metabolisierung von Nukleinsauren	AD oder AR
	DNase2 Defizienz		DNASE2	Deoxyribonuclease-2-alpha	AR
	Proteasom-assoziiertee autoinflammatorische Syndrome / Chronische atypische neutrophile Dermatose mit Lipodystrophie und erhohter Temperatur	PRAAS/CANDLE	PSMA3, PSMB4, PSMB8, PSMB9, PSMB10, POMP, PSMG2	Proteine zur Faltung und Zusammensetzung des Proteasoms und des Immunoproteasoms	AD/De novo, AR oder digenisch
	Andere Interfonopathien / Singleton-Merten Syndrome		ACP5, C1QA, C1R, DDX58, DNASE1, DNASE1L3, IFIH1, ISG15, POLA1, PRKDC, STAT2, USP18	Proteine zur Detektion, Metabolisierung und Editierung von Nukleinsäuren; DNA Synthese und Reparatur; Komplementsystem	AD, AR oder X-chromosom al rezessiv
Andere autoinflammatorische Erkrankungen	Defizienz der Adenosin-Deaminase 2	DADA2	ADA2	Adenosine deaminase 2	AR
	ADAM17 Defizienz / Neonatale inflammatorische Haut- und Darmerkrankung	NISBD1	ADAM17	Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 17	AR
	COPA-Syndrom	COPA	COPA	Coatomer subunit alpha	AD
	Frühe chronisch-entzündliche Darmerkrankung		IL10, IL10RA, IL10RB	Interleukin-10/lnterleukin-10 receptor subunit α/β	AR
	Defizienz des Interleukin 1-Rezeptor-Antagonisten	DIRA	IL1RN	lnterleukin-1 receptor antagonist protein	AR
	Defizienz der Interleukin 36-Rezeptor-Antagonisten	DITRA	IL36RN	Interleukin-36 receptor antagonist protein	AR
	Monogenetisches Still-Syndrom		LACC1	Laccase domain-containing protein 1	AR
	Majeed Syndrom		LPIN2	Phosphatidate phosphatase LPIN2	AR
	Cherubismus		SH3BP2	SFI3 domainbinding protein 2	AD

Monogene autoinflammatorische Erkrankungen gruppiert nach betroffenem zellularem System (Kategorie). Gelistet werden die Erkrankungsnamen (Krankheit), das Akronym der Erkrankung (Akronym), der Name des Gens (Gen) und des kodierten Proteins (Protein) sowie die Art der Vererbung (Vererbung). AD, autosomal-dominant; AR, autosomal-rezessiv; NF-κB, nuclear factor ‘kappa-light-chain-enhancer’ of activated B-cells.

Autosomal-dominant vererbte autoinflammatorische Syndrome zeichnen sich durch das Auftreten einer de novo krankheitsassoziierten Genvariation im Patienten aus, die nicht bei beiden Eltern vorliegt, sondern während der Meiose der Keimzellen entsteht. Es besteht aber auch die Möglichkeit, dass die gleiche pathogene Genvariante auch in einem Elternteil vorliegt, dieses jedoch aufgrund reduzierter Penetranz oder variabler Expressivität keine oder nur milde Krankheitssymptome aufweist. Der molekularen Pathogenese solcher autoinflammatorischen Syndrome liegt häufig eine gain-of-function Genvariante zugrunde, welche dem Protein eine neue oder verstärkte Funktion verleiht und dadurch zu einer verstärkten Immunantwort führt. Als Beispiele lassen sich hier die NLRP3-assozierten autoinflammatorischen Erkrankungen sowie die STING-assoziierte Vaskulopathie (SAVI) anführen. Ein weiterer Mechanismus, der zur Manifestation einer dominant-vererbten Autoinflammation führen kann, ist die Haploinsuffizienz. Dabei verursacht die pathogene Genvariante auf einem Allel eine Reduktion der notwendigen Proteinmenge und dieser Mangel kann durch das andere, funktionale Allel nicht kompensiert werden. Klassische Beispiele hierfür sind die Haploinsuffizienz von A20, verursacht durch pathogene Varianten in TNFAIP3, sowie die Haploinsuffizienz von RelA, hervorgerufen durch loss-of-function Varianten im RELA Gen.

Mit der Identifizierung der X-chromosomalen Erkrankung mit retikulären Pigmentierungen, welche durch loss-of-function Varianten in POLA1 verursacht wird, wurde im Jahre 2016 das erste X-chromosomal rezessive autoinflammatorische Syndrom beschrieben [22]. Wie andere X-chromosomal rezessiv vererbte Erkrankungen, zeichnet sich auch die X-chromosomale Erkrankung mit retikulären Pigmentierungen durch überwiegend männliche Patienten aus.

Einige autoinflammatorische Erkrankungen lassen sich nicht in eine der klassischen Kategorien einordnen. So kann das familiäre Mittelmeerfieber (FMF), abhängig von der jeweiligen Genvariante in MEFV, sowohl autosomal-rezessiv als auch autosomal-dominant vererbt werden [21]. Aufgrund der Tatsache, dass heterozygote Träger pathogener Genvarianten oft subklinische Inflammation aufweisen, lässt sich FMF in einigen Fällen auch einem semi-dominanten Erbgang zuordnen. Wie viele andere krankheitsassoziierte Gene weißt auch das MEFV Gen pleiotropische Eigenschaften auf, und spezifische gain-of-function Varianten führen zur Ausprägung der phänotypisch sehr unterschiedlichen Pyrin-assoziierten Autoinflammation mit neutrophiler Dermatose (PAAND) [13]. Seit der Beschreibung des CRIA Syndroms (spaltungsresistente RIPK1-induziertes autoinflammatorisches Syndrom) zählt auch RIPK1 zu den Genen, welche sowohl mit einer autosomal-dominant als auch autosomal-rezessiv vererbten autoinflammatorischen Erkrankung assoziiert sind [8] [24].

Die Verwendung von NGS-basierten Methoden und die damit verbundene Möglichkeit viele Gene gleichzeitig zu analysieren führte zur Identifikation von weiteren nicht-mendelschen Vererbungsmechanismen in der Gruppe der autoinflammatorischen Syndrome. So kann die Familie der Proteasom-assoziierten autoinflammatorischen Syndrome (PRAAS), auch chronische atypische neutrophile Dermatose mit Lipodystrophie und erhöhter Temperatur (CANDLE) genannt, eine digenische Vererbung aufweisen [2] [26]. Dabei trägt das betroffene Individuum je eine pathogene Variante in zwei unterschiedlichen Genen. Diese Art der Vererbung betrifft meist Proteine, die Teil eines Multiproteinkomplexes sind, wie im Falle der PRAAS, das Proteasom bzw. das Immunoproteasom. Darüber hinaus kann eine spezielle Art von CANDLE, welche sich durch eine ausgeprägte neutrophile Dermatose und Immunschwäche auszeichnet, durch heterozygote Varianten in POMP verursacht werden [18].

Die Anwendung von NGS führte auch zur Identifikation von Mosaizismus als Ursache für autoinflammatorische Syndrome. Als Mosaizismus bezeichnet man das Auftreten von zwei genetisch unterschiedlichen Zellpopulationen in einem Individuum. Dabei entsteht eine de novo Genvariation erst nach der Befruchtung der Eizelle, in der post-zygotischen Phase der Entwicklung [29]. Handelt es sich bei einer solchen somatischen Veränderung um eine pathogene Genvariante, kann dies zur Manifestation der Erkrankung führen. Krankheitsassoziierte somatische Varianten treten hauptsächlich bei autosomal-dominant vererbten autoinflammatorischen Erkrankungen auf, und können, abhängig davon, welche Zelltypen und Gewebe die Veränderung tragen, zu stark variierenden Krankheitssymptomen und Erkrankungsalter führen. Das bekannteste und häufigste Beispiel für Mosaizismus bei autoinflammatorischen Erkrankungen ist die Gruppe der Cryopyrin-assoziierten periodischen Fiebersyndrome (CAPS). CAPS wird durch pathogene gain-of-function Varianten in NLRP3 verursacht, und es wird vermutet, dass bis zu 20% der betroffenen Patienten somatische Varianten aufweisen [11].

Weitere Beispiel für autoinflammatorische Erkrankungen, welche durch somatische Varianten verursacht werden können, sind SAVI, NLRC4-assoziiertes NOMID und NLRC4-abhängige infantile Enterocolitis mit Autoinflammation (AIFEC) [10]. In einigen Fällen kann die pathogene somatische Variante auch das Gonadengewebe betreffen und kann somit möglicherweise an die nachfolgenden Generationen weitergegeben werden. Liegt ein solcher Keimbahn Mosaizismus vor, erhöht sich das Residualrisiko von Eltern ein erkranktes Kind zu zeugen, selbst wenn keiner der beiden Eltern eine nachweisbare pathogene Variante trägt. Dies wurde unter anderem für Patienten mit dem Blau-Syndrom, verursacht durch pathogene Varianten in NOD2, und dem TNFR1-assoziiertem periodischem Syndrom (TRAPS) beschrieben [12, 20].

3. Methoden der genetischen Diagnostik autoinflammatorischer Erkrankungen

Während für einige autoinflammatorische Syndrome, wie beispielsweise FMF und MKD, etablierte klinische Diagnosekriterien vorliegen, fehlen solche Richtlinien aufgrund der Seltenheit, der starken phänotypischen Überlappung, sowie der hohen variablen Expressivität innerhalb dieser Krankheitsgruppe häufig [6]. Die Hauptindikation für eine genetische Analyse an einem betroffenen Patienten ist das Auftreten von klinischen Symptomen, die mit mehreren der bekannten autoinflammatorischen Erkrankungen übereinstimmen können. Um den Kosten-Nutzen-Aspekt eines Gentests zu optimieren ist eine Interaktion zwischen dem behandelten Arzt und dem genetisch-diagnostischen Labor von großer Bedeutung. Da eine molekulare Analyse, die auf sukzessiven Einzel-Gen-Analysen basiert, zeitaufwändig und teuer ist und eine nur geringe diagnostische Erfolgsrate aufweist, empfiehlt sich eine breite Differentialdiagnostik, welche mehrere autoinflammationsassoziierte Gene inkludiert. Im Falle einer unklaren Symptomatik bieten sich NGS-basierte Methoden wie die Panelsequenzierung und Exomsequenzierung zur diagnostischen Abklärung an. Da heutzutage wirksame und spezifische Behandlungen für viele autoinflammatorischen Erkrankungen zur Verfügung stehen, ist eine korrekte und zeitnahe Diagnose für den Patienten von essentieller Bedeutung. Ebenso kann, aufgrund bestehender Genotyp-Phänotyp-Korrelationen, eine genetische Diagnose auch bei einigen klinisch etablierten autoinflammatorischen Erkrankungen für den Patienten von Nutzen sein.

3.1. Sanger Sequenzierung

Die Sanger Sequenzierung dient der spezifischen Analyse eines Gens oder Genabschnitts zur Identifikation von Punktmutationen oder kleineren Deletionen oder Insertionen (InDels). Dabei wird der jeweilige Genabschnitt per PCR amplifiziert und anschließend mittels der Sanger-Kettenabbruchsynthese sequenziert. Während die Sanger Sequenzierung über viele Jahre hinweg die Methode der Wahl zur genetischen Diagnose von autoinflammatorischen Erkrankungen war, verliert diese seit nunmehr einem Jahrzehnt an Bedeutung. Da die Sanger Sequenzierung mit relativ hohen Kosten und Zeitaufwand verbunden ist, wird sie heute meist nur von sehr spezialisierten Laboren mit einem geringen Volumen an Patientenproben angewandt. So kann die Sanger Sequenzierung zur diagnostischen Abklärung bei Patienten mit einer eindeutigen klinischen Diagnose wie FMF oder MKD, oder zur Analyse von Mutations-Hotspots, wie dem Exon 10 von MEFV oder den Exons 2 bis 5 von TNFRSF1A, dienen. Große Bedeutung kommt der Sanger Sequenzierung heute durch ihre Anwendung zur Bestätigung von durch NGS Methoden identifizierten Genvarianten zu.

3.2. Next-Generation Sequenzierung (NGS) Methoden

NGS beruht auf einer Reihe von Technologien, welche eine simultane Generierung und Sequenzierung von Millionen von DNA-Fragmenten ermöglichen. Dies erlaubt die Analyse von zahlreichen krankheitsassoziierten Genen (Panelsequenzierung), die Analyse eines Großteils der mehr als 20.000 humanen protein-kodierenden Genbereiche (Exomsequenzierung) oder des nahezu vollständigem menschlichen Genoms inklusive der mehr als 20.000 nicht-proteinkodierenden Gene sowie der genregulierenden Regionen (Genomsequenzierung) (Abbildung 1) [16, 17].

Abbildung 1: Schematische Darstellung unterschiedlicher Sequenziermethoden.

Bei der Sanger Sequenzierung (Sanger) wird meist nur ein Exon eines Gens pro Reaktion sequenziert. Die Panelsequenzierung (Panel) erlaubt die simultane Anreicherung und Analyse zahlreicher Gene. Dabei können Millionen von DNA Fragmente gleichzeitig sequenziert werden, was zu einer hohen Sequenziertiefe führt. Die Sequenziertiefe bei der Exomsequenzierung ist meist geringer als bei der Panelsequenzierung, dafür wird ein Großteil der bekannten humanen Gene analysiert. Bei der Genomsequenzierung erfolgt eine recht gleichmäßige Abdeckung und Sequenzierung des fast vollständigen menschlichen Genoms, allerdings mit einer geringeren Sequenziertiefe.

Im ersten Schritt der NGS Technologie erfolgt eine Fragmentierung der extrahierten DNA-Probe durch enzymatischen Verdau oder Ultraschallbehandlung. Anschließend werden die generierten DNA-Fragmente mit proben- und plattform-spezifischen Adaptern versehen. Im Falle der Panel- und der Exomsequenzierung erfolgt daraufhin eine Anreicherung der relevanten Genomregionen durch eine Hybridisierung mit ziel-spezifischen Oligonukleotiden und einer anschließenden Aufreinigung der hybridisierten Fragmente. Im Anschluss daran werden die isolierten Fragmente durch eine Bridge-PCR auf einer festen, mit komplementären Adaptern beschichteten Oberfläche amplifiziert. Anschließend erfolgt die Nukleinsäure-Sequenzbestimmung der Amplifikationsprodukte durch eine der existierenden Methoden (Pyrosequenzierung, Sequenzierung durch Ligation, Sequenzierung durch Synthese). Die gewonnenen Sequenzen werden dann mit Hilfe von Algorithmen mit dem humanen Genom abgeglichen, urn mögliche Abweichungen vom Referenzgenom zu identifizieren. Seit etwa einem Jahrzehnt sinken die Kosten des NGS durch Fortschritte in Methodik und Technologie rapide und einige Firmen bieten heute bereits Genomsequenzierungen auf Forschungsbasis für unter 100 Euro an.

3.2.1. Panelsequenzierung

Die Panelsequenzierung erlaubt die simultane Analyse relevanter Genombereiche von mehreren Patienten und ist heute die bevorzugte Testmethode für Patienten mit unklarer autoinflammatorischer Symptomatik. Aufgrund der meist hohen Sequenziertiefe der Panelsequenzierung und der damit einhergehenden hohen analytischen Empfindlichkeit eignet sich diese Methode zur Identifikation von somatischen Genvarianten. Da der Nachweis von InDels (<1000bp) sowie „copy number variations“ (CNVs, >1000bp) in NGS Datensätzen meist auf Detektion von Unterschieden in der Sequenziertiefe beruht, bietet sich die Panelsequenzierung auch für den Nachweis dieser beiden Variantengruppen an [15]. Die in klinischen Laboren angebotenen autoinflammationsspezifischen Genpanels umfassen meist die klassischen autoinflammatorischen Gene (ADA2, ELANE, LPIN2, MEFV, MVK, NLRP12, NLRP3, NOD2, PSTPIP1, TNFRSF1A), können aber laborspezifische Unterschiede aufweisen. Diese Genpanels decken daher bei weitem noch nicht alle heutzutage bekannten autoinflammationsassoziierten Gene ab, lassen sich aber meist individualisieren.

3.2.2. Exomsequenzierung

Mit Hilfe der Exomsequenzierung lässt sich ein Großteil der bekannten proteinkodierenden Gene im humanen Genom gleichzeitig analysieren. Trotz zahlreicher Studien, die zeigen, dass die Exomsequenzierung bei vielen unterschiedlichen genetischen Erkrankungsgruppen zu einer verbesserten diagnostischen Erfolgsrate und geringeren Kosten im Vergleich zur Einzelgen- bzw. Panelanalyse führt, gehört diese Methode bei autoinflammatorischen Erkrankungen heute noch nicht zum Standardrepertoire der genetischen Diagnostik [3]. Gründe hierfür sind die wohl noch immer signifikanten Mehrkosten einer Exomsequenzierung gegenüber einer Panelanalyse, sowie das erhöhte Risiko auf Varianten unklarer klinischer Signifikanz (VUS) zu stoßen, also Genvarianten, deren Pathogenität noch nicht abschließend geklärt ist. Aufgrund der meist geringeren Sequenziertiefe im Vergleich zu Genpanels kommt es bei der Exomsequenzierung zu einer Reduktion der analytischen Empfindlichkeit der Detektion von somatischen Genvarianten und InDels/CNVs. Anwendung im Bereich der autoinflammatorischen Syndrome findet die Exomsequenzierung vor allem bei Patienten, deren Einzelgenanalyse bzw. Panelsequenzierung keine eindeutige Diagnose liefern konnte, sowie im Bereich der Forschung zur Identifikation von neuen krankheitsverursachenden Genen [7].

3.2.3. Genomsequenzierung

Da bei der Genomsequenzierung keine Anreicherung für bestimmte Regionen des humanen Genoms erfolgt, werden annähernd alle Bereiche des Genoms gleichmäßig abgedeckt. Neben den kodierenden Genvarianten, welche sich auch mit anderen Sequenziermethoden analysieren lassen, kann die Genomsequenzierung auch Genvarianten in nichtkodierenden Regionen identifizieren. Da allerdings bis heute nur wenig über diese nichtkodierenden Bereiche im menschlichen Genom bekannt ist, lassen sich die Auswirkungen solcher Genvarianten in den meisten Fällen nur schwer interpretieren. Dies trägt unter anderem dazu bei, dass sich durch eine Genomsequenzierung das Risiko der Identifikation von VUS signifikant erhöht. Als Vorteile der Genomsequenzierung lassen sich unter anderem ein Zugewinn der Detektionsrate von CNVs, sowie die Möglichkeit, die genomweiten Daten auf kürzlich neu entdeckte krankheitsassoziierte Gene oder neu klassifizierte Varianten regelmäßig erneut zu analysieren, anführen. Dies trägt wohl zu der in einigen Studien gezeigten erhöhten Diagnoserate der Genomsequenzierung gegenöber anderen NGS Methoden bei [9].

4. Interpretation und Klassifikation von Genvarianten

Die beschriebenen NGS Technologien weisen eine hohe analytische Empfindlichkeit für die Erkennung heterozygoter und somatischer Veränderungen auf und führen dadurch zu bemerkenswerten Fortschritten bei der genetischen Charakterisierung vieler bisher nicht diagnostizierter Patienten. Allerdings kommt es durch NGS auch zu einer beschleunigten Identifikation von neuen, bisher nicht beschriebenen Genvarianten, was die Interpretation dieser Varianten auf ihre Kausalität hin erschwert (Tabelle S1).

Um eine korrekte und standardisierte Einschätzung der klinischen Bedeutung von molekularen Befunden zu ermöglichen, entwickelte das ,American College für Medical Genetics and Genomics (ACMG)‘ in Zusammenarbeit mit der ,Association for Molecular Pathology (AMP)‘ Richtlinien für die Interpretation von Genvarianten [19]. Diese Richtlinien bewerten die Pathogenität einer Genvariante anhand von Kriterien aus unterschiedlichen Bereichen, wie beispielsweise in-silico Vorhersagen, die Frequenz der Variante in der Bevölkerung, Funktionsanalysen der Genvariante im Labor, oder der Segregation der Variante in einer betroffenen Familie (Tabelle S2). Dazu werden die zur Verfügung stehenden Kriterien in unterschiedliche Gewichtungsklassen eingeteilt und können entweder mit einer sehr starken, einer starken, einer moderaten, oder einer untersfützenden Gewichtung in den Interpretationsprozess einfließen.

Die herangezogenen Kriterien werden dann gemäß eines Bewertungsschemas kombiniert, um eine endgültige Klassifizierung der Genvariante aus einem 5-stufigen Klassifizierungssystem (benigne, wahrscheinlich benigne, VUS, wahrscheinlich pathogen, pathogen) zu erreichen (Tabelle S3).

Genvarianten mit einer pathogenen oder wahrscheinlich pathogenen Klassifizierung werden als krankheitsverursachend erachtet und im molekulargenetischen Diagnostikbefund aufgeführt. Wie bei allen Mendelschen Erbkrankheiten basiert die endgültige genetische Diagnose von autoinflammatorischen Syndromen auf der Identifikation von pathogenen oder wahrscheinlich pathogenen Genvarianten in einem krankheitsassoziierten Gen. Dabei bestätigt die Feststellung von zwei in trans vorliegenden Varianten bei rezessiven Erkrankungen bzw. der Nachweis einer Genvariante bei dominanten Erkrankungen die Diagnose.

Im Verlauf der letzten 5 Jahre erfuhren diese generellen Richtlinien nicht nur zahlreiche Aktualisierungen und Optimierungen, sondern wurden auch für ihre bessere Anwendbarkeit auf unterschiedliche Krankheitsgruppen modifiziert und spezifiziert [1, 14, 25]. Speziell für autoinflammatorische Erkrankungen gibt es zahlreiche Bestrebungen, eine standardisierte und konsensgesteuerte Klassifizierung von Genvarianten sicherzustellen und diese in Form von Datenbanken anderen medizinischen Genetikern zur Verfügung zu stellen [27].

4.1. Klassifizierungskriterium – Bevölkerungsdaten

Die Häufigkeit einer bestimmten Genvariante in großen Kontrolldatensätzen, wie der Genome Aggregation Database (gnomAD) oder dem 1000 Genomes Project (siehe Tabelle S1), kann ein wichtiger Anhaltspunkt für die klinische Bewertung dieser Variante sein. Gemäß der ACMG/AMP Richtlinien, kann eine Genvariante, welche in mehr als 5% der Kontrollpopulation vorliegt, nicht krankheitsverursachend sein und wird als benigne Variante klassifiziert. Im Gegensatz dazu, deutet die Abwesenheit bzw. die sehr geringe Frequenz einer Variante in diesen Datensätzen auf eine potentielle Pathogenität hin [4]. Allerdings sollten immer krankheits- und genspezifische Besonderheiten berücksichtigt werden. So kann die Häufigkeit eines krankheitsassoziierten Genvariante auch von der Art der Vererbung, der Penetranz und der variablen Expressivität der Krankheit abhängen. Ebenso wird die Frequenz bestimmter Varianten durch populationsgenetische Faktoren wie genetische Drift oder Gründereffekte beeinflusst. Als Beispiel hierfür dienen pathogene Varianten in MEFV (p.M680I, p.M694V, M694I, p.V726A) und ADA2 (p.G47R und p.R169Q).

Eine weitere Möglichkeit die Pathogenität einer Genvariante abzuschätzen, bieten Fall-Kontroll-Studien in Form von genomweiten Assoziationsstudien (GWAS) [23]. Dabei gilt die Annahme, dass eine Genvariante, welche signifikant häufiger bei Patienten als bei Kontrollen vorkommt, in einer kausalen Beziehung zur untersuchten Erkrankung steht. Da Fall-Kontroll-Studien allerdings relativ großer Patientenzahlen bedürfen, um statistisch signifikante Ergebnisse zu erzielen, eignet sich diese Methode nur bedingt zur Analyse von seltenen Erkrankungen.

4.2. Klassifizierungskriterium – Auswirkungen auf die Proteinfunktion

Ein weiteres wichtiges Evaluierungskriterium ist die Auswirkungen einer Genvariante auf die Expression, das Spleißen und die Translation des jeweiligen Gens. So kann dieses Kriterium mit einer sehr starken Gewichtung zur Klassifizierung beitragen, wenn die Genvariante zu einem vollständigen Verlust der Expression auf einem Allel führt (Nonsense Varianten, kanonische Spleißvarianten oder Leserastervarianten) und die molekulare Pathogenese der Krankheit auf einem loss-of-function Mechanismus beruht. Nicht-synonyme Varianten in funktional bedeutenden Proteindomänen wie dem katalytischen Zentrum oder in Mutationshotspot tragen mit einer moderaten pathogenen Gewichtung zur Evaluierung bei. Genvarianten können auch mit Hilfe von in-silico oder computergestützten Vorhersagen anhand von Informationen über evolutionären Konservierung, biochemischen Konsequenz der Aminosäuresubstitution und Kontext der Substitution innerhalb der Proteinsequenz auf ihre Pathogenität hin beurteilt werden [5]. Dabei hängen Präzision und Verlässlichkeit dieser Algorithmen auch davon ab, wieviel über ein bestimmtes Gen, das kodierte Protein und die molekulare Pathogenese der Krankheit bekannt ist.

4.3. Klassifizierungskriterium – In vitro und in vivo Funktionsanalysen

Experimentelle Funktionsanalysen sind ein weiteres wichtiges Kriterium für die Bewertung der Pathogenitüt einer Genvariante. Dabei hängt die Verlässlichkeit einer funktionellen Analyse stark davon ab, inwieweit diese den physiologischen Kontext bzw. die molekulare Pathogenese einer Krankheit widerspiegelt. Darüber hinaus sollten Funktionsanalysen robuste, reproduzierbare und validierbare Ergebnisse liefern und idealerweise in einem oder mehreren zertifizierten Laboren durchgeführt worden sein. Speziell für autoinflammatorische Syndrome lassen sich hier enzymatische Funktionsanalysen anführen, wie beispielsweise die Messung der Aktivität der Adenosin Deaminase 2 in DADA2 oder die Bestimmung der Aktivität der Mevalonatkinase in HIDS. Eine zuverlässige funktionelle Analyse zum Nachweis von pathogenen Varianten in NLRP3 besteht im Nachweis erhöhter IL-1β-Produktion im Überstand stimulierter peripherer Blutzellen. Ein vielversprechender ex vivo Ansatz zur Verifizierung der Pathogenität von Genvarianten in MEFV wurde kürzlich entwickelt und zeigt eine hohe Spezifität und Sensitivität in der Erkennung von krankheitsassoziierten Varianten [28].

4.4. Klassifizierungskriterium – Segregation und Art der Vererbung

Weitere hilfreiche Kriterien für die Evaluierung der Pathogenität von Genvarianten sind Segregation und Vererbung. Liegt eine perfekte Segregation der Genvariante mit der Erkrankung vor, d.h. alle betroffenen Individuen in einer Familie tragen diese Veränderung, kann dies als ein unterstützendes Kriterium für die Pathogenität der entsprechenden Genvariante gewertet werden. Liegt eine Segregation in mehreren Familien mit unterschiedlichem ethnischem Hintergrund vor, kann dieses Kriterium auch mit einer stärkeren Gewichtung angewendet werden. Dementsprechend spricht eine Nicht-Segregation meist für eine benigne Bewertung der Variante, wobei eventuelle inkomplette Penetranz oder ein später Ausbruch der Krankheit Berücksichtigung finden sollten.

Informationen über die Art der Vererbung einer Genvariante innerhalb einer Kernfamilie können ebenfalls zur Bewertung herangezogen werden. Bei einer rezessiv vererbten Krankheit liegt eine moderate Gewichtung vor, wenn die Genvariante in trans mit einer bekannt pathogenen Variante im betroffenen Probanden vorliegt. Bei dominant vererbten Erkrankungen kann eine de novo Genvariante auch eine starke Gewichtung erhalten, wenn diese Variante in keinem Elternteil vorhanden ist und überdies sowohl Vaterschaft als auch Mutterschaft definitiv bestätigt wurden.

5. Diagnostischer Workflow

Da für viele autoinflammatorische Syndrome heute effektive Behandlungen zur Verfagung stehen, ist eine korrekte Diagnose für den Patienten von entscheidender Bedeutung. Eine frühe und definitive Diagnose erlaubt den Zugang zu einer auf die Grunderkrankung zugeschnittenen Therapie und kann so zu einer Verbesserung der Lebensqualität des Patienten féhren.

Eine molekulargenetische Untersuchung für autoinflammatorische Syndrome sollte in Betracht gezogen werden, wenn in einem Patienten mehrere, nicht erklärbare Fieberschübe auftreten und diese von erhöhten Entzündungswerten (Erythrozytensedimentationsrate, C-reaktives Protein, Serum Amyloid A) begleitet werden. Ebenso sollte eine Infektions- und Tumorerkrankung weitestgehend ausgeschlossen werden. Hinweise auf eine monogene Krankheit, wie ein frühes Erkrankungsalter, mehrere betroffene Geschwister oder dominante Vererbung, sind ebenfalls starke Indikatoren für eine genetische Diagnostik (Abbildung 2).

Abbildung 2: Workflow zur molekulargenetischen Diagnose von autoinflammatorischen Erkrankungen.

Empfohlener Befundungsprozess bei Patienten mit periodischen Fieberschüben, erhöhten Entzündungswerten, ausgeschlossener Infektions- und Tumorerkrankung und Hinweise auf eine monogene Vererbung. Eine eindeutige Symptomatik, Validierung einer klinischen Diagnose und eine positive Enzymanalyse sind Indikatoren für eine Einzelgensequenzierung. Eine Panelsequenzierung in Kombination mit sukzessiven Folgeanalysen ist bei einer unklaren Symptomatik ratsam. LP, likely pathogenic; P, pathogenic.

Die Sequenzierung eines spezifischen Gens ist empfohlen, wenn spezifische Manifestationen vorliegen, welche stark auf eine bestimmte autoinflammatorische Erkrankung hindeuten. Eine Einzelgenanalyse kann auch hilfreich sein, wenn der Patient zwar die klinischen Kriterien für ein bestimmtes autoinflammatorisches Syndrom erfüllt, eine Identifikation der spezifischen Genvariante aber wichtige, therapierelevante Informationen liefern kann. Ebenso kann die genetische Bestätigung einer positiven enzymatischen Analyse durch die Sequenzierung des entsprechenden Gens erfolgen. In einigen Fällen wird eine begrenzte initiale Analyse des Kandidatengens empfohlen und es werden Patienten, welche die klinische Diagnose für FMF, MKD und CAPS erfüllen, zunächst einer Analyse der Exons 2 und 10 von MEFV, 9 und 11 von MVK oder Exon 3 von NLRP3 unterzogen.

Werden durch die Einzelgenanalyse keine pathogenen Varianten identifiziert oder erfüllt ein Patient keine bzw. mehrere der klinischen Diagnosekriterien für autoinflammatorische Erkrankungen, ist eine Panelsequenzierung ratsam. Dabei besteht die Möglichkeit, die standardisierten, autoinflammationsspezifischen Genpanels in Zusammenarbeit mit einem Experten, um weitere plausible Kandidatengene zu ergänzen. Aufgrund der höheren Sensitivität für somatische Genvarianten und CNVs ist eine Panelsequenzierung auch ratsam, wenn die klinische Präsentation des Patienten auf eine bestimmte Erkrankung hindeutet, die Sanger Sequenzierung des assoziierten Gens allerdings keine pathogenen Varianten identifiziert hat.

Obwohl weder Exom- noch Genomsequenzierung zum routinemäßigen Diagnoserepertoire für autoinflammatorischen Erkrankungen gehören, kann die Exomsequenzierung selektiv bei Patienten angewendet werden, deren Genpanels negativ, bzw. nicht aussagekräftig sind. Um das Risiko der Identifikation von VUS bzw. sekundären Befunden zu minimieren, besteht die Möglichkeit die Anzahl der initial analysierten Gene bioinformatisch zu begrenzen (Slicing). Eine Exomanalyse kann pathogene Varianten in Genen identifizieren, welche erst kürzlich mit autoinflammatorischen Erkrankungen in Verbindung gebracht wurden und daher noch nicht durch kommerzielle Genpanels abgefragt werden. Werden Genvarianten in noch nicht publizierten Kandidatengenen gefunden, muss zunächst ein Nachweis der Kausalität durch komplexe Untersuchungen in Forschungslaboren erfolgen.

Eine Genomsequenzierung wird für Patienten empfohlen, bei denen der Verdacht auf eine monogene Störung besteht und deren Diagnose auch nach einer Exomanalyse nicht definitiv bestatigt werden kann. Eine Genomanalyse kann Genvarianten in regulatorischen Regionen oder Introns bekannter krankheitsverursachender Gene identifizieren und besitzt eine hohe Sensitivität für InDels und CNVs. Angesichts sinkender Kosten und immer effizienterer bioinformatischer Analysemethoden ist die Anwendung der Genomsequenzierung zu einem fmheren Zeitpunkt im diagnostischen Workflow nur eine Frage der Zeit. Pranataldiagnostische Untersuchungen sind für autoinflammatorische Syndrome generell nicht empfohlen, weil viele der Erkrankungen erfolgreich behandelt werden können. Ausnahmen bilden dabei Familien, die von besonders schweren oder sogar letalen Erkrankungen wie NOMID oder bestimmten Interferonopathien betroffen sind.

6. Kernaussagen.

• Die meisten autoinflammatorischen Erkrankungen folgen einer klassischen autosomal-rezessiven oder autosomal-dominanten Vererbung, aber nicht-klassische Vererbungsarten können auftreten.

• Eine schnelle Diagnose ist angesichts der Verfügbarkeit spezifischer Behandlungsmöglichkeiten bei vielen autoinflammatorischen Erkrankungen von großer Bedeutung.

• Neuartige NGS-basierte Sequenziermethoden sind mittlerweile zur Routine geworden und beschleunigen die genetische Diagnose sowie die Entdeckung neuer krankheitsverursachender Gene.

• NGS Methoden verbessern die Erkennungsrate für somatische Varianten und CNVs und erhöhen die diagnostische Erfolgsrate bei undefinierten autoinflammatorischen Syndromen.

• Die Klassifizierung genetischer Varianten ist ein komplexer Prozess, und Experteneinschätzungen sollten zur Bewertung der verfügbaren Kriterien für oder gegen die Pathogenität einer Genvariante herangezogen werden.

• Es besteht Bedarf an standardisierten Richtlinien für die genetische Diagnose autoinflammatorischer Erkrankungen.

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