zeste基因增强子同源物2抑制剂GSK126对舌鳞状细胞癌细胞增殖与凋亡的影响

Abstract

目的

观察zeste基因增强子同源物2（EZH2）抑制剂GSK126对人舌鳞状细胞癌细胞体外增殖与凋亡的影响，并探讨其相关机制，为舌鳞状细胞癌的临床治疗提供新思路。

方法

将不同浓度的GSK126作用于舌鳞状细胞癌CAL-27细胞，通过甲基噻唑基四唑（MTT）、克隆形成、5-乙炔基-2′脱氧尿嘧啶核苷（EdU）荧光染色实验检测药物对细胞增殖能力的影响；采用Hoechst33342荧光染色、JC-1法观察细胞凋亡情况；采用Western blot法检测CAL-27细胞内相关蛋白细胞外调节蛋白激酶（ERK）、磷酸化的细胞外调节蛋白激酶（p-ERK）、Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-9的表达水平。

结果

GSK126能抑制CAL-27细胞增殖并对细胞凋亡有促进作用。GSK126能下调细胞内p-ERK、Bcl-2的表达水平，同时可增加Bax、Cleaved caspase-9的表达（P<0.05）。

结论

GSK126可抑制舌鳞状细胞癌CAL-27细胞的增殖，并且能促进其凋亡，其机制可能与抑制MEK/ERK信号通路以及激活Bax/Bcl-2通路有关。

头颈部癌症是全球第八大常见癌症。口腔鳞状细胞癌在口腔癌中发病率最高，其中发生在舌部最为多见。2018年，全世界约有345 900例口腔癌新病例，17.74万人死于口腔癌[1]，且近年来，发病年龄趋向年轻化[2]。以手术为主的综合序列治疗是舌癌的主要治疗方法，但由于舌癌恶性程度较高，且易发生淋巴转移，普通的化疗药物有时难以取得令人满意的治疗效果[3]。因此，探索针对舌鳞状细胞癌的新型治疗药物具有重要意义。

果蝇zeste基因增强子同源物2（enhancer of zeste homolog 2，EZH2）是多梳蛋白复合体家族的主要成员之一。研究[4]–[5]显示，在多种肿瘤组织中均可出现EZH2高表达现象。EZH2参与调节组蛋白H3第27位赖氨酸（H3K27）甲基化，在调控基因转录和基因沉默中发挥着重要的作用。GSK126作为一种高度选择性EZH2抑制剂[6]，已被证实在前列腺癌、肺癌、乳腺癌等多种癌症中具有治疗效果[7]，但目前在舌癌方面的研究不多。本文旨在观察GSK126对舌鳞癌CAL-27细胞增殖与凋亡的影响，并初步探讨其相关机制。

1. 材料和方法

1.1. 实验材料

人舌鳞状细胞癌细胞株CAL-27（中国生命科学院提供），胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、DMEM培养基（Gibco公司，美国），GSK126（Selleck公司，美国），Hoechst33342试剂（北京索莱宝科技有限公司），5-乙炔基-2′脱氧尿嘧啶核苷（5-ethynyl-2′-deoxyuridine，EdU）试剂盒（广州锐博生物科技有限公司），JC-1试剂盒（上海爱必信生物科技有限公司），二辛可酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）抗体、磷酸化的细胞外调节蛋白激酶（phospho-extracellular regulated protein kinases，p-ERK）抗体、Bax抗体、Bcl-2抗体、Cleaved caspase-9抗体、β-actin抗体（CST公司，美国），电化学发光（electrochemiluminescence，ECL）试剂（沈阳万类生物科技有限公司）。

1.2. 方法

1.2.1. 细胞培养

使用含10%FBS和1%双抗（青霉素/链霉素）的DMEM培养基，将人舌癌CAL-27细胞置于5%CO₂，37 °C恒温环境下培养。细胞传代时使用胰蛋白酶消化贴壁细胞，DMEM终止消化并离心，重悬后接种于培养皿中。

1.2.2. 药物干预

将GSK126用二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶解后放置于−80 °C保存，实验时各给药组按照不同浓度对储存液进行稀释，溶剂对照组加入相同体积的DMSO。

1.2.3. 甲基噻唑基四唑（methyl

thiazolyl tetrazolium，MTT）实验 取处于对数生长期的细胞，消化离心后将细胞密度调整为每孔5×10³个，均匀铺于96孔板中。设置5个复孔，边缘孔使用无菌PBS补充。细胞贴壁后加入浓度梯度的GSK126（1、2.5、5、10、15 µmol·L⁻¹），空白对照组不加药（0 µmol·L⁻¹），溶剂对照组加入相同体积的DMSO，继续培养48 h后向每孔加入20 µL MTT溶液，孵育3 h后吸弃上清，加入150 µL DMSO，低速震荡使结晶充分溶解。最后用酶标仪测定各孔在490 nm处的光密度（optical density，OD）值，计算细胞存活率=（实验组OD值/空白对照组OD值）×100%。

1.2.4. 克隆形成实验

将对数生长期的CAL-27细胞消化，离心，重悬后接种于六孔板中，细胞密度设为每孔1 000个。待细胞贴壁且生长良好时按不同的浓度（5、10 µmol·L⁻¹）给予药物处理，对照组加入同等体积的DMSO，继续培养10 d后吸弃上清，使用4%多聚甲醛室温固定30 min，再加入结晶紫染色，20 min后用PBS洗涤2次，拍照记录实验结果并计算每孔中的细胞群落数，克隆形成率=（克隆数/接种细胞数）×100%。

1.2.5. EdU增殖成像检测

将对数生长期的CAL-27细胞以细胞密度为每孔3×10⁴个接种于3个共聚焦皿中，培养至正常生长阶段，药物处理浓度分别为5、10 µmol·L⁻¹，对照组用等体积DMSO进行处理，培养48 h后更换细胞培养液为含EdU的培养基，孵育2 h，吸弃培养基，用4%多聚甲醛进行细胞固定化处理，用2 mg·mL⁻¹甘氨酸脱色，加入渗透剂（0.5%Triton-100）后行Apollo染色，避光室温下摇床孵育30 min，用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染料染核，使用共聚焦显微镜拍照并记录每个视野内的阳性细胞数目。细胞增殖率=（EdU阳性细胞数/DAPI阳性细胞数）×100%。

1.2.6. Hoechst33342染色

实验收集处于对数生长期的CAL-27细胞并按照细胞密度为每孔5×10⁴个均匀接种于3个小培养皿内，细胞贴壁且生长良好时分别加入浓度梯度为5、10 µmol·L⁻¹的GSK126，并设置DMSO溶剂对照组，继续培养48 h后，向每个培养皿中加入Hoechst33342工作液充分覆盖细胞，37 °C恒温孵箱内孵育20 min，置于荧光显微镜下观察，拍照并记录实验结果。

1.2.7. JC-1染色实验

将CAL-27细胞按照细胞密度为每孔3×10⁴个均匀接种在3个共聚焦皿中，细胞贴壁后分别加入5、10 µmol·L⁻¹的GSK126，溶剂对照组不加药，培养48 h后吸去培养液，PBS洗涤1次，加入1 mL培养液及配置好的JC-1工作液，充分混匀，37 °C孵育20 min，孵育结束后吸除上清，用JC-1染色缓冲液洗涤2次，加入培养液并放置于共聚焦显微镜下观察红/绿荧光比例，拍照记录实验结果。

1.2.8. Western blot实验

收集经不同浓度GSK126处理后的舌癌细胞，加入蛋白裂解液置于冰上充分裂解，离心后取上清使用BCA蛋白定量法定量，测定蛋白浓度并制样。配置凝胶进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）电泳，聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜转膜，5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）封闭2 h后，分别加入ERK、p-ERK、Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-9兔抗人一抗及β-actin鼠抗人一抗，4 °C过夜，TBST洗膜3次后加入HRP标记的二抗，室温孵育2 h后再次洗膜，ECL显色。

1.3. 统计学分析

采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析，各组细胞存活率、增殖率及克隆形成率均以均数±标准差表示，多组之间比较使用单因素方差分析，两两比较使用t检验，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2. 结果

2.1. GSK126可抑制CAL-27细胞增殖

MTT实验结果表明，随着GSK126药物浓度变化（0、1、2.5、5、10、15 µmol·L⁻¹），细胞存活率分别为100.00%±0.00%、88.13%±4.16%、83.76%±4.16%、53.73%±2.21%、31.47%±2.76%、13.11%±0.85%，细胞存活率随着药物浓度增加而持续下降（图1）。与DMSO组相比，GSK126对CAL-27细胞增殖具有明显的抑制作用，且呈浓度依赖性，差异有统计学意义（P<0.05）。

图 1. MTT法检测不同浓度GSK126对CAL-27细胞增殖的影响.

Fig 1 MTT assay was used to detect the effects of GSK126 with different concentrations on CAL-27 cell proliferation

与DMSO组相比，*P<0.05，**P<0.01。

与DMSO组相比，随着GSK126浓度增加，克隆形成的群落数逐渐减少，其中DMSO组、5 µmol·L⁻¹组的克隆形成率分别为55.20%±3.91%、26.30%±2.91%。10 µmol·L⁻¹组中肉眼未见有明显的克隆群落形成（图2）。方差分析结果显示，GSK126组和DMSO组间差异有统计学意义（F=244.794，P=0.000）。

图 2. GSK126对CAL-27细胞克隆形成能力的影响.

Fig 2 Effect of GSK126 on the colony formation ability of CAL-27 cells

左：克隆群落形成情况；右：细胞克隆形成率的定量分析，**P<0.01。

EdU增殖成像检测结果见图3。由图3可见，经5、10 µmol·L⁻¹ GSK126处理后，CAL-27细胞的阳性比例明显较DMSO组降低，且呈浓度依赖性。DMSO组、5 µmol·L⁻¹、10 µmol·L⁻¹组增殖率分别为88.88%±7.87%、30.30%±10.02%、11.25%±13.15%。经方差分析，3组间差异具有统计学意义（F=58.582，P=0.000）。

图 3. EdU荧光染色实验检测细胞增殖能力 共聚焦显微镜.

Fig 3 Proliferation ability of cells was detected by EdU fluorescence staining confocal microscope

2.2. GSK126可促进CAL-27细胞凋亡

Hoechst33342染色后，DMSO组细胞形态正常，呈均匀淡染蓝色，核膜形态完整；5 µmol·L⁻¹组见部分CAL-27细胞形态大小不均，出现碎片化，细胞核呈高亮状态；10 µmol·L⁻¹组见细胞荧光强度更高，细胞核固缩、破碎更明显，大部分细胞形态变小且不规则，破裂成碎片状，死细胞明显增多（图4）。

图 4. Hoechst33342染色检测CAL-27细胞凋亡情况 倒置荧光显微镜 × 40.

Fig 4 Apoptosis of CAL-27 cells was detected by Hoechst33342 staining inverted fluorescence microscope × 40

左：DMSO组；中：5 µmol·L⁻¹组；右：10 µmol·L⁻¹组。

JC-1荧光探针检测结果见图5。DMSO组细胞活性良好，线粒体膜电位较高，JC-1聚集在线粒体基质中产生红色荧光；经不同浓度（5、10 µmol·L⁻¹）的GSK126处理后，JC-1不能聚集在线粒体基质中，而是以单体形式存在，呈现出绿色荧光，提示线粒体膜电位较低，细胞可能正在发生早期凋亡。

图 5. JC-1荧光探针检测CAL-27细胞凋亡情况 共聚焦显微镜.

Fig 5 Apoptosis of CAL-27 cells detected by JC-1 fluorescent probe confocal microscope

2.3. GSK126影响CAL-27细胞增殖、凋亡的机制分析

Western blot检测结果见图6和表1。与对照组相比，GSK126作用后的CAL-27细胞内，ERK的表达水平无显著性变化（P>0.05），p-ERK表达水平呈降低趋势。Bax、Cleaved caspase-9表达水平升高，Bcl-2的表达水平降低，各条带呈现近似浓度依赖性。经方差分析，差异具有统计学意义（P<0.05）。

图 6. Western blot检测p-ERK、ERK、Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-9蛋白表达.

Fig 6 Expressions of p-ERK, ERK, Bax, Bcl-2, Cleaved caspase-9 detected by Western blot

1~6：GSK126药物浓度分别为0、1、2.5、5、10、15 µmol·L⁻¹。

表 1. 不同浓度GSK126下各蛋白的相对表达水平.

Tab 1 Relative expression levels of each protein at different concentrations of GSK126

浓度/（µmol·L−1）	ERK	p-ERK	Bax	Bcl-2	Cleaved caspase-9
0	1.842±0.076	1.566±0.103	0.989±0.004	1.359±0.048	0.803±0.020
1	1.873±0.127	1.332±0.068	1.084±0.008	1.037±0.055	0.843±0.031
2.5	1.742±0.084	1.313±0.028	1.102±0.044	1.020±0.043	0.889±0.056
5	1.777±0.037	1.076±0.030	1.113±0.049	0.924±0.082	0.907±0.058
10	1.724±0.031	1.071±0.062	1.146±0.050	0.906±0.072	1.015±0.035
15	1.728±0.055	1.052±0.035	1.242±0.030	0.847±0.095	1.038±0.010
F值	2.075	34.431	15.735	21.346	17.065
P值	0.139	0.000	0.000	0.000	0.000

3. 讨论

舌鳞状细胞癌是口腔鳞状细胞癌中最具侵袭性的一种[8]。尽管在过去的30年里，各种治疗方法都取得了进步，但舌鳞状细胞癌患者的总体5年生存率仍不及50%[9]。化疗是舌癌的治疗方法之一，近年来，随着化疗技术的发展及新型化疗药物的问世，人们对于舌癌治疗药物的探索也逐步深入。

研究[10]–[11]表明，EZH2是多梳抑制复合物PRC2（polycomb repressive complex 2）的核心亚基，它可特异性催化组蛋白H3上第27位赖氨酸（H3K27）的甲基化，在表观遗传学领域发挥着不可替代的作用，目前已被证实EZH2与多种肿瘤的发生发展过程相关。GSK126是一种以EZH2为靶点的新型竞争性抑制剂[12]，其作为一种新型抗癌药物，已处于临床试验阶段[13]。本实验通过MTT、克隆形成、EdU荧光染色、Hoechst33342荧光染色、JC-1染色、Western blot等一系列的实验方法表明，GSK126可以有效抑制人舌癌CAL-27细胞增殖并促进其凋亡，且呈浓度依赖性。

在克隆形成及EdU染色实验中可见，GSK126作用于舌癌CAL-27细胞后，细胞增殖水平明显下降。研究发现，MEK/ERK通路与肿瘤细胞增殖过程密切相关，此通路能通过层层级联反应将细胞外刺激信号转导至细胞及其核内[14]–[15]，已经证实在舌鳞癌细胞中存在MEK/ERK过度激活现象[16]，因此抑制ERK信号的激活与传导对于抗肿瘤研究具有重要意义。Western blot实验结果证实，GSK126抑制了p-ERK的表达水平，使进入活化状态的ERK减少，这可能与CAL-27细胞增殖率下降有关。

细胞凋亡是一种程序性细胞死亡过程[17]，受到多种相关因子的共同调控，线粒体介导的细胞凋亡是其中一条途径。Bax和Bcl-2是参与调控细胞凋亡的一组基因，Bax过表达可促进细胞凋亡，而Bcl-2具有抑制凋亡作用。研究发现，正常情况下，细胞内部的Bax与Bcl-2比例固定，当细胞接收到凋亡信号时，Bax/Bcl-2比值增大，使线粒体膜通透性升高，细胞色素C（CytC）得以释放[18]–[19]，进而激活下游Caspase-9，Caspase-3等相关凋亡蛋白，产生级联反应[20]。而当Bcl-2含量增多时，它可与Bax形成异源二聚体，阻碍Bax发挥促凋亡作用[21]。本研究Western blot结果显示，随着GSK126浓度升高，Bax含量升高而Bcl-2含量下降，Bax/Bcl-2比值增大，而Cleaved caspase-9也呈现上升趋势，表明经GSK126处理后，激活了Bax/Bcl-2通路，从而诱导更多的细胞进入了凋亡阶段。

综上所述，GSK126作为一种新型EZH2抑制剂，可抑制舌鳞状细胞癌CAL-27细胞的增殖并且促进其凋亡，其机制可能与MEK/ERK通路以及Bax/Bcl-2通路有关，提示GSK126可能成为一种具有前景的新型舌癌治疗药物。然而，舌癌的侵袭与发展过程复杂，GSK126对于舌癌的抑制效果是否还与其他机制有关仍有待进一步研究。

Funding Statement

[基金项目] 辽宁省自然科学基金（2015020326）

Supported by: Natural Science Foundation of Liaoning Province (2015020326).