Abstract
目的
通过检测白细胞介素35受体（IL-35R）两亚基糖蛋白130（gp130）、白细胞介素12受体β2（IL-12Rβ2）及信号转导和转录激活因子（STAT）1、STAT4在口腔扁平苔藓（OLP）组织中的表达，探讨IL-35R在OLP病损形成和发展中的作用及意义。
方法
收集41例OLP组织（OLP组）和15例正常口腔黏膜组织（对照组）为研究对象。采用实时荧光定量聚合酶链反应检测组织中gp130、IL-12Rβ2、STAT1、STAT4 mRNA的表达水平，免疫组织化学（IHC）检测组织中gp130、IL-12Rβ2蛋白的表达及分布，并分析gp130、IL-12Rβ2蛋白表达与OLP临床特征的关系。
结果
1）OLP组gp130、IL-12Rβ2、STAT1、STAT4 mRNA的相对表达量均高于对照组（P<0.05）。2）OLP组gp130、IL-12Rβ2蛋白的阳性表达率均高于对照组（P<0.05），且gp130、IL-12Rβ2蛋白在OLP组织中的表达呈正相关（r=0.984，P<0.001）。3）糜烂型OLP组织gp130、IL-12Rβ2蛋白的阳性表达率高于非糜烂型（P<0.05）。
结论
IL-35R及STAT在OLP组织中表达上调，且IL-35R的表达与OLP的临床分型有关，提示IL-35R可能在OLP病损形成及发展中起重要作用。
Keywords: 口腔扁平苔藓, 白细胞介素35, 白细胞介素35受体, 糖蛋白130, 白细胞介素12受体β2, 信号转导和转录激活因子1, 信号转导和转录激活因子4
Abstract
Objective
To investigate the expression of glycoprotein 130 (gp130) and interleukin 12 receptor β2 (IL-12Rβ2) in two subunits of interleukin-35 receptor (IL-35R), singal transducer and activator of transcription (STAT) 1 and STAT4 in oral lichen planus (OLP) tissues, and to explore the role and significance of IL-35R in the formation and development of OLP lesions.
Methods
Totally 41 samples of OLP tissues (OLP group) and 15 samples of normal oral mucosa (control group) were collected. The expression levels of gp130, IL-12Rβ2, STAT1, STAT4 mRNA in the tissues were detected by real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction and the distribution and expression of protein gp130 and IL-12Rβ2 were detected by immunohistochemistry. The potential relationship between gp130 and IL-12Rβ2 and clinical features of OLP was analyzed.
Results
1) The expression levels of gp130, IL-12Rβ2, STAT1 and STAT4 mRNA in the OLP group were significantly higher than those in the control group (P<0.05). 2) The positive expression rates of gp130 and IL-12Rβ2 protein in the OLP group were higher than those in the control group (P<0.05). The expression of gp130 and IL-12Rβ2 proteins in OLP tissues were positively correlated (r=0.984, P<0.001). 3) The expression rates of gp130 and IL-12Rβ2 protein in erosive OLP tissues were significantly higher than those in non-erosive ones (P<0.05).
Conclusion
The expression of IL-35R and STAT is up-regulated in OLP tissues, and the expression of IL-35R is related to the clinical classification of OLP, suggesting that IL-35R might play an important role in the formation and development of damage OLP lesions.
Keywords: oral lichen planus, interleukin-35, interleukin-35 receptor, glycoprotein 130, interleukin-12 receptor β2, singal transducer and activator of transcription 1, singal transducer and activator of transcription 4
口腔扁平苔藓（oral lichen planus，OLP）是一种较常见的口腔黏膜慢性炎性疾病[1]，具有病程迁延、有癌变危险的特点[2]。目前，OLP的病因和发病机制尚未明确，研究[3]认为T细胞介导的细胞免疫与其发病密切相关，其典型病理学改变为基底细胞液化变性及固有层T淋巴细胞呈带状浸润。白细胞介素（interleukin，IL）35是一种具有独特免疫抑制作用的分泌型蛋白，主要由调节性T细胞（regulatory T cells，Treg）分泌，且是Treg发挥免疫抑制作用的关键细胞因子，其生物学功能的发挥有赖于细胞表面受体的表达[4]–[6]。IL-35受体（interleukin-35 receptor，IL-35R）由gp130和IL-12受体β2（interleukin-12 receptor β2，IL-12Rβ2）构成，当IL-35与IL-35R结合，可激活信号转导和转录激活因子（singal transducer and activator of transcription，STAT）1和（或）STAT4，从而增加IL-35的表达，形成IL-35反馈回路，发挥免疫抑制作用[7]–[10]。本课题组前期研究[11]发现，IL-35在OLP组织中的表达升高，且与临床分型有关，提示IL-35在OLP局部病损形成和发展中具有重要作用。为进一步研究IL-35信号通路相关因子在OLP发生发展中的意义，本研究通过检测IL-35R两亚基gp130、IL-12Rβ2及STAT1、STAT4在OLP组织中的表达，分析IL-35R与OLP患者临床特征的相关性，探讨IL-35R在OLP病损形成及发展中的作用和意义。
1. 材料和方法
本项研究经贵州医科大学附属医院伦理学委员会审批[2014伦审第（06）号]，所有研究对象均被告知研究内容并均签署知情同意书。
1.1. 标本来源
研究纳入的41例OLP组织来自2010年10月—2016年12月就诊于贵州医科大学附属医院口腔黏膜专科门诊的初诊患者（OLP组）。纳入标准：参考卫生部规划教材《口腔黏膜病学》第4版OLP诊断标准，结合OLP临床表现和组织病理学检查[1]确诊为OLP者。排除标准：1）1个月内使用过抗生素，3个月内使用过糖皮质激素、免疫抑制剂等相关药物者；2）伴全身系统性疾病，既往有免疫系统性疾病者；3）某些药物、残冠残根或银汞合金充填物等引起苔藓样反应者；4）患感染性疾病、肿瘤及其他口腔黏膜病者；5）处于妊娠及哺乳期女性患者。
研究纳入的15例正常口腔黏膜组织来自于正颌手术或牙龈环切术的正常口腔黏膜（对照组），均经病理科证实无明显炎症及病理改变。
将收集到的组织标本分为2份：一部分经过石蜡包埋，制备组织切片用于免疫组织化学染色；另一部分保存在RNA液中，用于mRNA检测。
1.2. 主要试剂及仪器
鼠抗人gp130单克隆抗体（Santa Cruz公司，美国），兔抗人IL-12Rβ2多克隆抗体（Abcam公司，美国），DAB显色试剂盒、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）抗原修复液（pH=9.0）、PV6001山羊抗兔IgG/辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）聚合物、PV6002山羊抗小鼠IgG/HRP聚合物（北京中杉金桥生物技术有限公司），RNAiso Plus、Prime Script™RT Reagent Kit反转录试剂盒（宝生物工程大连有限公司），Fast Start Essential DNA Green Master试剂盒（Roche公司，瑞士），电热恒温培养干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司），YS100光学显微镜（Nikon公司，日本），核酸蛋白分析仪（Gene Quant 100，Biochrom公司，美国），聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增仪、CFX96荧光定量PCR仪、GelDoc XR+凝胶成像分析系统（BIO-RAD公司，美国）。实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）引物设计与合成均由上海生工生物工程技术服务有限公司完成，引物序列详见表1。
表 1. 引物序列.
Tab 1 Primer sequence
| 引物名称 | 引物序列 | 产物大小/bp |
| gp130 | 上游：5′-TTGAGTTGCATTGTGAACGA-3′ | 111 |
| 下游：5′-CTTGTGTGTTGCCCATTCAG-3′ | ||
| IL-12Rβ2 | 上游：5′-AAAGTTCCCTGATGGCTGTC-3′ | 110 |
| 下游：5′-GAGGTGAGGTGCGTTTATGC-3′ | ||
| STAT1 | 上游：5′-TTCCCTTCTGGCTTTGGATT-3′ | 133 |
| 下游：5′-GGCTGCTGGTCCTTCAACA-3′ | ||
| STAT4 | 上游：5′-TCCAAGTGTGTATGCGGTGT-3′ | 107 |
| 下游：5′-TGGTGCGTCAGAGTTTATCCT-3′ | ||
| β-actin | 上游：5′-TAGTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3′ | 151 |
| 下游：5′-TCACCTTCACCGTTCCAGTTT-3′ |
1.3. 实验方法
1.3.1. qPCR
取样本组织50 mg，Trizol法提取组织总RNA，检测RNA浓度及纯度；按照Prime Script™ RT Reagent Kit反转录试剂盒说明合成cDNA。按照Fast Start Essential DNA Green Master试剂盒说明在冰上配制10 µL qPCR反应体系，在荧光定量PCR仪上机并设置反应条件：95 °C10 min；95 °C10 s，60 °C15 s，共40个循环。
qPCR结果判断：利用软件Bio-Rad CFX Manager 3.0获取数据Ct值，通过扩增曲线和溶解曲线分析排除非特异性扩增，每个样本重复 2 次，使用2−ΔCt法[12]对gp130、IL-12Rβ2、STAT1、STAT4基因的表达进行相对定量分析。
1.3.2. 免疫组织化学
采用免疫组织化学超敏二步法检测OLP组织以及正常口腔黏膜组织切片中gp130、IL-12Rβ2蛋白的表达。检测时均采用高温高压抗原修复（切片浸入装有pH=9.0 EDTA抗原修复液的修复盒内，修复盒放入装有水的高压锅中，高温加热4 min）；一抗：鼠抗人gp130单抗（1︰100）、兔抗人IL-12Rβ2多抗（1︰200）；二抗：gp130用PV6002山羊抗鼠IgG/HRP聚合物、IL-12Rβ2用PV6001山羊抗兔IgG/HRP 聚合物；严格按照试剂盒说明进行操作，用已知阳性表达gp130、IL-12Rβ2的人胎盘组织切片作阳性对照，以PBS代替一抗为阴性对照。
染色结果判定：阳性染色表现为棕黄色颗粒，gp130、IL-12Rβ2阳性染色主要位于细胞膜。按照Fu等[13]的方法进行分析，2人双盲阅片，每张切片随机选取观察5个400倍视野观察，计算5个视野中阳性细胞数的平均百分比。阳性细胞计分：0分（≤5%）；1分（6%~25%）；2分（26%~50%）；3分（51%~75%）；4分（>75%）。细胞染色强度计分：0分（无染色），1分（淡黄色），2分（棕黄色），3分（棕褐色）。以两计分之积判断染色结果：0~2分为阴性（−），3~5分为弱阳性（+），6~8分为阳性（++），9~12分为强阳性（+++），将+~+++都归为阳性表达。
1.4. 统计学分析
采用SPSS 23.0软件对实验数据进行统计学分析。所有的计量资料数据经K-S正态性检验，符合正态分布的数据采用均数±标准差表示，2组间均数比较采用独立样本t检验，非正态分布的数据用“M（Q25，Q75）”的形式表示，2组间均数比较采用秩和检验；计数资料用卡方检验；gp130、IL-12Rβ2蛋白表达与OLP临床特征（临床类型、病程）的相关性分析采用Spearman相关性分析。
2. 结果
2.1. 2组的基本信息分析
OLP组患者的年龄为18~70岁，平均年龄（44.1±12.6）岁；男性18例，女性23例；非糜烂型21例，糜烂型20例；病程≥6个月者15例，病程<6个月者26例。对照组患者的年龄为19~67岁，平均年龄（46.4±14.5）岁；男性7例，女性8例。统计分析表明，OLP组和对照组年龄、性别的差异均无统计学意义（年龄，t=-0.581，P=0.564；性别，χ2=0.034，P=0.854）。
2.2. gp130、IL-12Rβ2、STAT1、STAT4 mRNA的表达
OLP组gp130、IL-12Rβ2、STAT1、STAT4 mRNA的相对表达量均高于对照组，差异具有统计学意义（P<0.05，表2）；但在OLP不同临床类型之间差异无统计学意义（P>0.05，图1）。
表 2. 2组gp130、IL-12Rβ2、STAT1、STAT4 mRNA的表达.
Tab 2 The expression levels of gp130, IL-12Rβ2, STAT1, STAT4 mRNA in 2 groups
| 项目 | OLP组/（×10−3） | 对照组/（×10−3） | Z值 | P值 |
| gp130 | 11.55（3.43，36.40） | 1.25（0.85，2.80） | -3.895 | <0.001Δ |
| IL-12Rβ2 | 17.13（4.36，60.35） | 4.66（1.38，14.57） | -2.600 | 0.009Δ |
| STAT1 | 16.89（7.14，47.78） | 2.38（1.60，3.99） | -3.876 | <0.001Δ |
| STAT4 | 6.17（2.00，26.64） | 2.32（1.36，3.43） | -2.655 | 0.008Δ |
注：括号中，前面的数据为Q25，后面的数据为Q75。Δ表示差异有统计学意义，P<0.05。
图 1. 非糜烂型、糜烂型OLP组织和正常口腔黏膜组织gp130、IL-12Rβ2、STAT1、STAT4 mRNA的表达.
Fig 1 The expression of gp130, IL-12Rβ2, STAT1, STAT4 mRNA in non-erosive, erosive OLP tissues and normal oral mucosa
2.3. gp130、IL-12Rβ2蛋白的表达
gp130和IL-12Rβ2蛋白在对照组中均为阴性表达，在OLP组中的阳性表达率分别为36.59%（15/41）、34.15%（14/41）。OLP组中gp130、IL-12Rβ2蛋白的阳性表达率均高于对照组，差异具有统计学意义（gp130，χ2=7.496，P=0.006；IL-12Rβ2，χ2=6.829，P=0.009）。在OLP组织固有层炎性浸润细胞中可见散在分布的gp130、IL-12Rβ2阳性细胞，gp130、IL-12Rβ2阳性染色主要位于细胞膜（图2）。Spearman相关性分析显示，gp130及IL-12Rβ2蛋白在OLP组织中的表达呈正相关（r=0.984，P<0.001）。
图 2. gp130、IL-12Rβ2的表达 免疫组织化学.
Fig 2 The expression of gp130, IL-12Rβ2 immunohistochemistry
上：gp130；下：IL-12Rβ2。左：对照组，× 400；中：OLP组，× 100；右：OLP组，× 400。
2.4. gp130、IL-12Rβ2与OLP临床特征的相关性
gp130、IL-12Rβ2蛋白与OLP临床特征的相关性分析表明，糜烂型OLP组织中gp130、IL-12Rβ2蛋白的阳性表达率高于非糜烂型OLP组织，差异具有统计学意义（P<0.05），但gp130、IL-12Rβ2蛋白的阳性表达率在不同病程OLP组中差异无统计学意义（P>0.05，表3）。
表 3. gp130、IL-12Rβ2与OLP临床特征的相关性分析.
Tab 3 The relationship gp130, IL-12Rβ2 expressions and clinical characteristics of OLP
| 项目 | n | gp130 |
IL-12Rβ2 |
|||||
| 阳性数/% | χ2值 | P值 | 阳性数/% | χ2值 | P值 | |||
| 临床类型 | 非糜烂型 | 21 | 4/19 | 5.707 | 0.017Δ | 4/19 | 4.264 | 0.037Δ |
| 糜烂型 | 20 | 11/55 | 10/50 | |||||
| 病程 | ≥6个月 | 15 | 6/40 | 0.119 | 0.730 | 6/40 | 0.363 | 0.548 |
| <6个月 | 26 | 9/35 | 8/31 | |||||
注：Δ表示差异有统计学意义，P<0.05。
3. 讨论
OLP是一种较常见的口腔黏膜慢性炎性疾病，其病因和发病机制尚未明确，目前普遍认为细胞免疫在OLP的发生发展中占重要作用。研究[14]–[15]证实，具有促炎作用的Th17细胞以及具有抑制免疫炎症作用的Treg细胞参与了OLP的发生发展，IL-35是Treg细胞发挥最大免疫抑制作用的关键细胞因子之一，在OLP的发生发展中具有一定作用。
IL-35是由Collison等[4]2007年首先发现并命名的IL-12家族新成员，由异源二聚体Ebi3和p35构成，具有独特的免疫抑制作用。IL-35主要通过诱导T细胞分化为特殊的新型调节性T细胞，介导其免疫抑制功能；此外，还可通过促进Treg细胞增殖、抑制Th17细胞分化来发挥其免疫抑制作用，从而抑制炎症反应，在炎症性疾病、自身免疫性疾病及肿瘤中发挥重要作用[16]–[18]。本课题组前期研究[11]发现，IL-35在OLP组织中表达上调，且与临床分型有关，提示IL-35在OLP局部病损形成及发展中具有重要作用。IL-35是一种分泌型蛋白，其生物学功能的有效发挥依赖于细胞表面受体的表达及STAT对其信号的传导。因此，本研究就IL-35R及STAT进行研究，以进一步探讨及完善IL-35信号通路相关因子在OLP发生发展中的意义。
IL-35R是由IL-12Rβ2和gp130组成的，IL-35与IL-35R结合可以激活T细胞中的STAT1和STAT4[19]。研究发现，当IL-35与其同源二聚体gp130:gp130或IL-12Rβ2:IL-12Rβ2结合，只激活STAT1或STAT4一个信号转导分支，会导致IL-35的抑制活力部分丧失；当IL-35与其异源二聚体gp130:IL-12Rβ2结合，诱导Janus激酶家族成员磷酸化，同时激活STAT1和STAT4进行信号转导，形成独特的异源二聚体，促进基因Ebi3和p35启动子转录，从而上调IL-35的表达，形成IL-35的反馈回路，发挥最大的免疫抑制作用[7]–[10]。
本研究发现，gp130和IL-12Rβ2蛋白在OLP组织固有层浸润的炎性细胞中呈阳性表达，且高于对照组，说明其与OLP局部病损的形成有关。通过分析gp130和IL-12Rβ2蛋白与OLP临床特征的相关性发现，gp130和IL-12Rβ2蛋白与OLP的临床类型有关，在糜烂型中的表达高于非糜烂型，但与OLP不同病程无相关性，提示IL-35R水平可能反映了OLP局部病损的形成及疾病的炎症程度，但与OLP病程长短无关，不能反映疾病发展情况；且gp130和IL-12Rβ2蛋白与IL-35两配体在OLP中的表达结果一致[11]，说明随着OLP病情的加重，IL-35和IL-35R表达均升高，因此推测可能是IL-35与IL-35R结合中，部分IL-35与其同源二聚体结合，导致其免疫抑制作用部分丧失，以致IL-35发挥的免疫抑制作用不能弥补OLP免疫抑制功能的不足，从而使疾病加重，提示IL-35R协同IL-35参与了OLP的发病过程。
STAT1和STAT4是具有信号转导和转录调节功能的蛋白质家族成员，不仅能把细胞外的信号传递到细胞内，而且能直接参与细胞的基因调控，调节免疫、炎症反应[20]，亦是IL-35R信号转导中不可缺少的下游细胞因子。本研究运用qPCR检测gp130、IL-12Rβ2、STAT1和STAT4 mRNA的表达水平，发现其在OLP组织中明显升高，提示IL-35R激活后，进一步激活下游STAT1和STAT4基因的表达，从而对IL-35信号进行传导。因此推测：IL-35与IL-35R结合后，激活JAK激酶，启动下游信号转导，上调IL-35的表达，从而形成IL-35的反馈回路，发挥IL-35免疫抑制作用，参与OLP疾病的发生。
本研究中gp130、IL-12Rβ2蛋白在糜烂型OLP与非糜烂型OLP中的表达具有差异，而其mRNA的表达在OLP两型中无差异，分析其原因可能有：1）mRNA到蛋白质需经翻译、加工、修饰等一系列过程，基因翻译的调控因素可能调节了蛋白的表达；2）mRNA与蛋白质的半衰期不同，mRNA极易降解，而蛋白质性质相对较稳定，实验过程中可能部分标本mRNA发生降解。蛋白质是行使功能的基本单位，故认为gp130、IL-12Rβ2蛋白对OLP的发生具有一定的调节作用。
综上，本研究发现，IL-35R及STAT在OLP组织中表达升高，且与临床分型有关，提示IL-35R及STAT的异常表达可能参与了OLP的发生。
Funding Statement
[基金项目] 国家自然科学基金（81460104）
Supported by: The National Natural Science Foundation of China (81460104).
Footnotes
利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。
References
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