Abstract
目的
利用全基因组关联研究(genome-wide association study，GWAS)数据，从基因-基因交互作用和基因-环境交互作用方面探索WNT代谢通路相关基因在中国人群非综合征型唇腭裂(non-syndromic oral clefts，NSOC)发生风险中的作用。
方法
本研究样本来自“唇腭裂基因和交互作用的国际合作研究”项目在中国地区募集的806个非综合征型唇裂合并或不合并腭裂(non-syndromic cleft lip with or without cleft palate，NSCL/P)核心家系和202个非综合征型单纯腭裂(non-syndromic cleft palate，NSCP)核心家系。通过收集研究对象的DNA样本和问卷调查获得基因型数据和母亲孕期环境暴露信息, 利用此GWAS数据，采用条件Logistic回归模型探讨基因-基因交互作用和基因-环境交互作用，由R软件中的trio软件包完成。经过Bonferroni多重检验校正后，统计学检验的显著性阈值均设为P < 3.47×10-4。
结果
经过数据质量控制后，NSCL/P核心家系和NSCP核心家系各纳入7个基因上的144个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)位点进入分析。在NSCL/P和NSCP家系中，分别有三对SNPs交互作用达到统计学显著性水平(P < 3.47×10-4)：rs7618735(WNT5A)与rs10848543(WNT5B)，rs631948(WNT11)与rs556874(WNT5A)以及rs631948(WNT11)与rs472631(WNT5A)；rs589149(WNT11)与rs4765834(WNT5B)，rs1402704(WNT11)与rs358792(WNT5A)以及rs1402704(WNT11)与rs358793(WNT5A)。此外，基因-环境交互作用分析未发现显著结果。
结论
未发现WNT代谢通路相关基因-环境交互作用在NSCL/P和NSCP发病风险中的作用，但WNT代谢通路相关基因可能通过基因-基因交互作用影响NSOC的发病风险。
Keywords: 非综合征型唇腭裂, 全基因组关联研究, WNT信号通路
Abstract
Objective
In this study, we used genome-wide association study (GWAS) data to explore whether WNT pathway genes were associated with non-syndromic oral clefts (NSOC) considering gene-gene interaction and gene-environment interaction.
Methods
We conducted the analysis using 806 non-syndromic cleft lip with or without cleft palate (NSCL/P) case-parent trios and 202 non-syndromic cleft palate (NSCP) case-parent trios among Chinese populations selected from an international consortium established for a GWAS of non-syndromic oral clefts. Genotype data and maternal environmental exposures were collected through DNA samples and questionnaires. Conditional Logistic regression models were adopted to explore gene-gene interaction and gene-environment in teraction using trio package in R software. The threshold of significance level was set as 3.47×10-4 using Bonferroni correction.
Results
A total of 144 single nucleotide polymorphisms (SNPs) in seven genes passed the quality control process in NSCL/P trios and NSCP trios, respectively. Totally six pairs of SNPs interactions showed statistically significant SNP-SNP interaction (P < 3.47×10-4) after Bonferroni correction, which were rs7618735 (WNT5A) and rs10848543 (WNT5B), rs631948 (WNT11) and rs556874 (WNT5A), and rs631948 (WNT11) and rs472631 (WNT5A) among NSCL/P trios; rs589149 (WNT11) and rs4765834 (WNT5B), rs1402704 (WNT11) and rs358792 (WNT5A), and rs1402704 (WNT11) and rs358793 (WNT5A) among NSCP trios, respectively. In addition, no significant result was found for gene-environment interaction analysis in both of the NSCL/P trios and NSCP trios.
Conclusion
Though this study failed to detect significant association based on gene-environment interactions of seven WNT pathway genes and the risk of NSOC, WNT pathway genes may influence the risk of NSOC through potential gene-gene interaction.
Keywords: Non-syndromic oral clefts, Genome-wide association studies, WNT signaling pathway
唇腭裂(oral clefts)是一种常见的出生缺陷，中国人群的唇腭裂患病率高于其他地区和种族人群[1]。最近一项meta分析研究显示，中国人群唇腭裂患病率为1.4/1 000活产儿[2]。唇腭裂可按解剖结构分为单纯唇裂、单纯腭裂和唇裂合并腭裂[3]。单纯唇裂和唇裂合并腭裂由于流行病学特征以及胚胎发育起源上的相似性，常被归为一类，称为唇裂合并或不合并腭裂(cleft lip with or without cleft palate，CL/P)[4]。唇腭裂还可以按是否合并其他疾病分为综合征型与非综合征型两类，非综合征型唇腭裂(non-syndromic oral clefts，NSOC)更为常见，患儿不伴有其他畸形或异常，是受多基因及环境因素影响的复杂疾病[3]。
NSOC为多基因疾病，其发生不遵循简单的孟德尔遗传模式，虽然全基因组关联研究(genome-wide association study，GWAS)发现了多个NSOC相关基因位点和区域[5]，但发现的基因位点和区域只能解释少部分遗传度[6]，缺少交互作用分析可能是未发现的遗传度的重要来源。
WNT代谢通路参与调节多种细胞活动，与正常生长发育和疾病发生关系密切，尤其在颌面部形态形成中发挥重要作用。在胚胎发育过程中，上唇和上腭的形成是包括一系列相互协调步骤的复杂过程，这一过程受基因网络的精确调控。多项研究发现经典和非经典WNT信号通路均在唇腭的形态形成中发挥重要作用，并在转基因老鼠模型等动物模型中得到证实[7-8]。既往研究显示，WNT代谢通路多个基因突变与NSOC有关，但目前研究主要集中在基因主效应分析，基因-基因交互作用和基因-环境交互作用分析并不充分[9-12]。因此，本研究选择WNT代谢通路中既往单个位点研究证据比较充分的WNT3A、WNT3、WNT5A、WNT5B、WNT9A、WNT9B和WNT11基因，在中国人群中分析这些基因之间的交互作用以及基因与环境之间的交互作用对NSOC发生风险的影响，以探索中国人群NSOC的发生风险。
1. 资料与方法
1.1. 研究对象
本研究采用核心家系设计，即以患者及其双亲为研究对象, 核心家系样本来自“唇腭裂基因和交互作用的国际合作研究”项目[13-14]。该项目在中国台湾、山东潍坊、湖北武汉和四川成都4个地区共募集806个非综合征型唇裂合并或不合并腭裂(non-syndromic cleft lip with or without cleft palate，NSCL/P)核心家系(2 418人)和202个非综合征型单纯腭裂(non-syndromic cleft palate，NSCP)核心家系(606人)。样本分布情况见表 1。本研究中NSOC患者的诊断由各研究现场临床专家和医学遗传学专家完成，并已通过北京大学生物医学伦理委员会的审批。
表1.
中国人群NSOC核心家系数目分布情况
The distribution of NSOC trios in China
| Site | Male | Female | Total | |||
| CL/P | CP | CL/P | CP | |||
| NSOC, non-syndromic oral clefts; CL/P, cleft lip with or without cleft palate; CP, cleft palate. | ||||||
| Taiwan | 139 | 29 | 94 | 50 | 312 | |
| Shandong | 193 | 16 | 81 | 22 | 312 | |
| Hubei | 132 | 19 | 55 | 26 | 232 | |
| Sichuan | 75 | 18 | 37 | 22 | 152 | |
| Total | 539 | 82 | 267 | 120 | 1 008 | |
1.2. 母亲孕期环境暴露因素的收集
通过问卷调查收集母亲孕期环境暴露信息, 其中，吸烟、饮酒和补充复合维生素是指母亲在孕前3个月至怀孕最初期3个月内主动吸烟、饮酒和补充维生素(未区分维生素种类)的情况。被动吸烟是指母亲在孕前3个月及整个孕周期在家中、工作场所或其他环境中有人在其周围吸烟。本研究分析的环境变量均为二分类变量。
1.3. 基因型测定与质量控制
本研究基因型测定工作在美国约翰霍普金斯医学院McKusick-Nathans遗传医学研究所遗传病研究中心完成，使用检测芯片Illumina Human610-Quad v.1_B BeadChip(Illumina)进行基因型检测。生物样本的采集、处理以及DNA提取参见Beaty等[14]的研究。本研究采用以下标准进行基因型数据质量控制：(1)缺失率(missing rate)≤10%；(2)弱势等位基因频率≥1%；(3)父母人群符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)；(4)孟德尔遗传错误率(Mendelian errors)≤5%。经过质量控制之后，NSCL/P核心家系和NSCP核心家系各纳入7个基因上的144个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)位点进入分析。表 2列出了相关基因的名称、位置和SNPs数量信息。数据质量控制在NSCL/P和NSCP家系中分别进行，由Plink(v1.07)软件完成。
表2.
NSOC家系中WNT家族基因信息
Information of the seven genes in the WNT pathway
| Subtypes | Gene | Chromosome | Number of SNPs |
| NSCL/P, non-syndromic cleft lip with or without cleft palate; NSCP, non-syndromic cleft palate; SNPs, single nucleotide polymorphisms. | |||
| NSCL/P | WNT3 | 17 | 7 |
| WNT3A | 1 | 8 | |
| WNT5A | 3 | 45 | |
| WNT5B | 12 | 28 | |
| WNT9A | 1 | 13 | |
| WNT9B | 17 | 9 | |
| WNT11 | 11 | 34 | |
| Total | 144 | ||
| NSCP | WNT3 | 17 | 7 |
| WNT3A | 1 | 7 | |
| WNT5A | 3 | 46 | |
| WNT5B | 12 | 28 | |
| WNT9A | 1 | 13 | |
| WNT9B | 17 | 9 | |
| WNT11 | 11 | 34 | |
| Total | 144 | ||
1.4. 统计分析
1.4.1. 基因-基因交互作用
本研究采用Cordell法分析基因-基因交互作用。Cordell法主要用于在家系研究中进行二维基因-基因交互作用分析[15]，Cordell法的基本思想是在每一个亲本交配型(病例是受累唇腭裂患儿)中产生“虚拟对照”。对于两个SNPs位点，每一个子代可能出现16种不同的基因型组合，因此，虚拟对照与患儿的基因型组成1 :15匹配的病例对照样本，在加性遗传模式下建立条件Logistic回归模型：
 |
模型1 |
 |
模型2 |
模型中的x和z分别代表两个位点潜在基因型的哑变量，a和d是哑变量效应的系数，i为交互作用项的系数。用四个自由度(df)的似然比检验比较上述两个模型，评估是否存在统计学意义的基因-基因交互作用。此方法仅考虑不同基因之间SNPs的交互作用，不考虑同一个基因内的SNPs位点之间的交互作用。
1.4.2. 基因-环境交互作用
根据每一个核心家系中父母与患儿的基因型，将未传给子代的基因型构建成虚拟同胞对。对于每个SNP位点和一个环境变量，每一个子代可能出现4种不同的基因-环境组合，因此，虚拟对照与患儿构成1 :3匹配的样本。在加性遗传的模式下建立条件Logistic回归模型：
 |
模型3 |
 |
模型4 |
模型3中G代表基因型，为0、1或2，代表患儿基因型中弱势等位基因个数；E代表环境因素，为0或1，分别代表未暴露和暴露于某种环境因素。采用似然比检验的方法对模型的偏回归系数进行检验。将模型3与仅含有基因型变量的模型4进行比较，可得到自由度为1(1df)的似然比统计量及其P值。拒绝无效假设时，提示模型中的位点与环境暴露因素之间的交互作用具有统计学意义。模型3与无效假设模型进行比较，可得到自由度为2(2df)的似然比统计量及其P值。拒绝无效假设，提示在考虑基因-环境交互作用后，模型中的位点多态性与疾病之间的关联具有统计学意义。本研究采用R软件中的trio软件包进行基因-基因交互作用和基因-环境交互作用分析。
1.4.3. 显著性阈值
由于本研究纳入多个位点进行分析，采用Bonferroni进行多重检验校正，显著性阈值设为0.05/纳入分析位点的个数。由于NSCL/P和NSCP家系各纳入144个SNPs位点进入分析，因此，显著性阈值均设定为0.05/144=3.47×10-4。
2. 结果
2.1. 数据基本信息
本研究共纳入806个NSCL/P核心家系(共2 418人)进行GWAS分析，其中67%(539人)为男性患儿。在806名患儿中，有209名单纯唇裂患儿(25.9%)，597名唇裂合并腭裂患儿(74.1%)。有124个家系存在双亲之一基因型分型数据缺失的问题。
本研究共纳入202个NSCP核心家系(共606人)进行GWAS分析，其中41%为男性患儿。有18个家系存在双亲之一基因型分型数据缺失的问题。
2.2. 基因-基因交互作用分析结果
采用Cordell法进行不同基因之间SNPs位点的二维交互作用分析。表 3列出了NSCL/P家系和NSCP家系中基因-基因交互作用分析显著的位点(P < 3.47×10-4)，这些SNPs由于分布在不同的染色体上，可认为不存在连锁不平衡。
表3.
基因-基因交互作用分析结果
The results of gene-gene interaction analysis
| Subtypes | Gene1 | SNP1 | MAF1 | P1 | Gene2 | SNP2 | MAF2 | P2 | Pinteraction | RR | Empirical P |
| MAF, minor allele frequency; RR, relative risk; Other abbreviations as in Table 2. | |||||||||||
| NSCL/P | WNT5A | rs7618735 | 0.153 | 0.250 | WNT5B | rs10848543 | 0.268 | 0.355 | 2.66×10-4 | 1.01 | 2.00×10-4 |
| WNT11 | rs631948 | 0.360 | 0.601 | WNT5A | rs556874 | 0.318 | 0.540 | 3.10×10-4 | 1.06 | 3.00×10-4 | |
| WNT11 | rs631948 | 0.360 | 0.601 | WNT5A | rs472631 | 0.321 | 0.441 | 3.42×10-4 | 1.07 | 4.00×10-4 | |
| NSCP | WNT11 | rs589149 | 0.444 | 0.940 | WNT5B | rs4765834 | 0.306 | 0.153 | 1.08×10-4 | 1.19 | 1.00×10-4 |
| WNT11 | rs1402704 | 0.434 | 0.178 | WNT5A | rs358792 | 0.273 | 0.502 | 1.37×10-4 | 1.10 | 1.00×10-4 | |
| WNT11 | rs1402704 | 0.434 | 0.178 | WNT5A | rs358793 | 0.275 | 0.452 | 1.71×10-3 | 1.56 | 1.00×10-4 | |
在NSCL/P家系中，经过Bonferroni多重检验校正后，有三对SNPs达到统计学显著性水平(P < 3.47×10-4)。为rs7618735(WNT5A)与rs10848543(WNT5B)，rs631948(WNT11)与rs556874(WNT5A)以及rs631948(WNT11)与rs472631(WNT5A)。对三对SNPs交互作用进行10 000次置换检验后，置换检验P值均 < 0.05(表 3)。在置换检验中，将病例和虚拟同胞对照状态进行10 000次随机化，得到交互作用检验统计量，置换检验的P值表示在10 000次置换检验中获得的检验统计量大于等于交互作用分析中观察到的检验统计量(似然比检验，likelihood ratio test, LRT)的概率。
NSCP家系中，经过Bonferroni多重检验校正后，有三对SNPs达到校正后统计学显著性水平(P < 3.47×10-4)，分别为rs589149(WNT11)与rs4765834(WNT5B)、rs1402704(WNT11)与rs358792(WNT5A)以及rs1402704(WNT11)与rs358793(WNT5A)，三对SNPs交互作用置换检验P值均 < 0.05(表 3)。
2.3. 基因-环境交互作用结果
在NSCL/P家系和NSCP家系中，由于母亲孕期吸烟和饮酒的暴露率均小于3%，因此，仅将孕期被动吸烟和孕期补充复合维生素纳入基因-环境交互作用分析。自由度为1(1df)的检验用于检验模型中的交互作用项是否存在统计学交互作用，自由度为2(2df)的检验用于检验在考虑基因-环境交互作用后，纳入模型的基因位点与疾病之间是否存在统计学意义的关联。
对NSCL/P家系中的144个SNPs位点与被动吸烟进行交互作用分析，有一个SNP位点在1df检验和2df检验中P值均小于0.05。对NSCL/P家系中的144个SNPs位点与补充复合维生素进行交互作用分析，有16个SNPs位点在1df检验和2df检验中P值均小于0.05。这些位点经过多重检验校正后，均未达到统计学显著性水平(P>3.47×10-4)。
对NSCP家系中的144个SNPs位点与被动吸烟进行交互作用分析，有三个SNPs位点在1df检验和2df检验中P值均小于0.05。对NSCP家系中的144个SNPs位点与补充复合维生素进行交互作用分析，所有SNPs位点与补充复合维生素的交互作用分析P值均大于0.05。经过多重检验校正后，以上交互作用均未达到统计学显著性水平(P>3.47×10-4)。
3. 讨论
NSOC是一种常见的出生缺陷，中国人群NSOC患病率高于其他种族人群。患儿幼年往往需要接受一系列手术，严重影响患儿身心健康并给家庭和社会带来严重的经济负担。既往纵向研究还发现该病患者癌症等主要死因的死亡风险显著高于一般人群，患者及其亲属罹患各类癌症的风险也显著增高[16-17]。目前，这类常见的出生缺陷病因仍不明，缺乏有效的预防措施。因此，探索该病的病因将为制定有效的预防策略、更好地预测和降低人群发病风险提供重要依据。
NSOC是涉及多基因的复杂性疾病。IRF6基因和8q24是在NSOC遗传危险因素探索中研究证据较为充分的基因和区域，多个样本人群GWAS研究和功能实验均证实这两个基因位点和区域与NSCL/P发生风险有关[14, 18-23]。随着越来越多的NSOC易感基因和区域被发现，研究者从关注单一基因的效应逐渐转变为关注基因之间的交互作用，开始深入探索这些易感基因和区域是否可以通过交互作用影响疾病风险。交互作用是指当两个或两个以上基因位点共同作用时，对疾病发生风险的影响不同于这些位点单独作用时的简单累加。有学者认为NSOC的发生是由多种基因共同参与、相互作用的结果。基因-基因交互作用对NSOC发生的影响越来越受到关注[24]。
Chiquet等[9]在欧洲裔美国人的样本中发现WNT3A(rs752107)和WNT3(rs70602)之间存在显著的交互作用(P=0.0037)，并在西班牙裔样本中发现WNT3A(rs1745420)和WNT5A(rs566926)之间存在基因-基因交互作用(P=0.0388)。本研究缺乏rs70602、rs1745420和rs1745420三个SNPs的数据，未能验证Chiquet等[9]发现的显著交互作用，并未发现rs566926与其他基因位点之间存在显著的交互作用。本研究NSCL/P家系研究结果显示，WNT5A(rs7618735)和WNT5B(rs10848543)之间的交互作用达到了统计学显著性水平。WNT5A的SNP位点rs556874和rs472631与WNT11的SNP位点rs631948之间的交互作用在校正后均显著。虽然NSCP家系较少，但本研究仍然发现WNT11(rs589149)和WNT5B(rs4765834)之间存在统计学的显著性交互作用。WNT5A的SNP位点rs358792和rs358793与WNT11的SNP位点rs1402704之间的交互作用在校正后均显著。因此，WNT11、WNT5A和WNT5B可能通过相互之间的交互作用影响NSOC的发生风险。此外，WNT家族基因还可能通过与其他通路基因之间的交互作用影响NSOC发生风险。Li等[25]研究发现WNT5B和MAFB之间存在显著的交互作用，此外，WNT5A与IRF6和C1orf107基因间的交互作用在亚洲人群中得到了显著的结果。8q24区域基因位点与WNT5B在欧洲人群中存在显著的交互作用。WNT5B基因是WNT通路中7个跨膜受体的卷曲家族成员的配体。WNT5B在多种组织发育过程中发挥信号分子的作用，在体内存在差异表达。WNT5A和WNT5B在每个基因控制的不同区域之间的软骨细胞转变过程中的纵向骨生长中发挥重要作用[25]。由于之前研究未发现WNT11、WNT5A和WNT5B基因之间的交互作用，本研究的结果具有重要的提示作用，未来需要更大的样本量对这些结果进行进一步的验证。此外，关于这些交互作用生物学机制的探索也是未来研究的主要方向。
作为一种病因复杂且存在较大异质性的出生缺陷，NSOC的遗传和环境危险因素仍未完全确定[5]。许多研究表明, 遗传和环境危险因素之间的相互作用可能导致NSOC的发生[5, 14, 26]。通过研究基因与环境的交互作用，可以使携带某种易感基因的人群，避免接触特定的环境因素，从而保护易感人群，具有十分重要的公共卫生意义。本研究对来自7个基因上的144个SNPs与母亲孕期被动吸烟和复合维生素补充进行基因-环境交互作用分析，经过多重检验校正后，未发现这些位点与两种孕期环境因素暴露之间有统计学显著性交互作用。目前为止，关于WNT家族基因的基因-环境交互作用研究较少。张玉等[27]研究WNT3基因rs142167与rs3809857两个位点多态性与环境的交互作用与NSCL/P发生风险之间的关系，发现WNT3基因SNP rs142167多态性与母体孕前6个月至孕早期补充叶酸、被动吸烟、饮酒等存在交互作用。俞辉明等[28]研究发现WNT5A基因rs566926与孕早期服药的交互作用与NSCL/P的发生有关。
目前，NSOC研究较多的环境因素主要包括母亲孕早期吸烟、饮酒、被动吸烟、叶酸摄入、药物摄入和服用多种维生素补充剂等。由于本研究中母亲孕期吸烟和饮酒的暴露率很低(< 3%)，而被动吸烟与前两种暴露相比，对疾病发生风险作用相对较低，单纯腭裂家系数量较少以及严格的多重检验校正标准使研究的把握度较低，可能是未发现统计学显著性基因-环境交互作用的重要原因。此外，本研究的环境暴露信息通过问卷调查获得，母亲对孕期以及孕早期的暴露信息记忆难免存在偏差，数据收集的过程可能存在回忆偏倚。再者，本研究所收集的环境暴露信息均为二分类变量，无法将环境暴露分层进行分析，量化环境暴露对疾病发生风险的影响。在未来的工作中，可以采用更大的样本量进行基因-环境交互作用分析。
综上所述，本研究利用来自“唇腭裂基因和交互作用的国际合作研究”项目在中国地区募集的806个NSCL/P核心家系和202个NSCP核心家系GWAS数据，从基因-基因交互作用和基因-环境交互作用方面深入探索WNT代谢通路相关基因在中国人群NSOC发生风险中的作用。经过Bonferroni多重检验校正后，在NSCL/P和NSCP家系中，分别有三对SNPs交互作用达到统计学显著性水平。尽管本研究未发现WNT代谢通路相关基因-环境交互作用在NSCL/P和NSCP发病风险中的作用，但WNT代谢通路相关基因可能通过基因-基因交互作用影响NSCL/P和NSCP的发病风险。
志谢
感谢参与此项研究的所有家庭对本项目的支持；感谢临床专家、调查现场和实验室的工作人员为此项目所做出的贡献。
Funding Statement
国家自然科学基金(81102178、81573225)和北京市自然科学基金(7172115)
Supported by National Natural Science Foundation of China (81102178, 81573225) and Beijing Municipal Natural Science Foundation (7172115)
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