Abstract
目的
探讨趋化素样因子超家族成员5 (CKLF-like marvel transmembrane domain containing member, CMTM5)基因与冠心病患者支架内再狭窄(in-stent restenosis, ISR)发生风险及该基因对人血管内皮细胞(endothelial cells, ECs)增殖和迁移作用及其机制。
方法
选择2015年1月至2016年12月在首都医科大学附属北京世纪坛医院心血管内科接受住院治疗并行经皮冠状动脉介入治疗手术的冠心病患者，共计124例，采用光学比浊法测定血小板聚集率并进行血小板高反应性分组；冠脉造影术明确患者支架内再狭窄发生；RT-PCR法测定CMTM5基因表达；构建CMTM5基因过表达、敲减及对照组内皮细胞系，采用细胞计数法、MTT法、Brdu掺入实验和流式细胞术检测ECs增殖能力，刮伤和Transwell实验检测ECs迁移能力，Western-blot检测信号通路表达。
结果
CMTM5基因在血小板高反应性(high on aspirin platelet reactivity，HAPR)组表达量为非血小板高反应性(no-high on aspirin platelet reactivity，No-HAPR)组表达量的1.72倍(P < 0.05)。HAPR组ISR发生率为25.8%(8例)，No-HAPR组ISR发生率为9.7%(9例)，HAPR组患者ISR的发生率高于No-HAPR组的发生率(P=0.04，OR=2.95，95%CI：1.16~7.52)，表明该基因与冠心病患者支架术后支架内再狭窄发生风险显著相关(P < 0.05)。CMTM5基因过表达抑制ECs增殖和迁移能力(P < 0.05)，PI3K/Akt信号通路参与该基因对内皮细胞增殖和迁移调控作用。
结论
CMTM5基因与冠心病患者支架内再狭窄事件发生风险可能存在相关性，CMTM5基因通过PI3K/Akt信号通路参与调控ECs增殖和迁移。
Keywords: 趋化素样因子超家族成员5, 内皮细胞, 血小板反应性, 心血管事件
Abstract
Objective
To elucidate the correlation between CKLF-like marvel transmembrane domain containing member (CMTM5) gene and the risk of in-stent restenosis (ISR) with coronary artery disease (CAD) patients and to detect the effects and mechanisms of CMTM5-stimulated genes on human vascular endothelial cells (ECs) proliferation and migration.
Methods
A total of 124 hospitalized patients in Shijitan Hospital were enrolled in this study. All the CAD patients were detected with platelet reactivity and grouped into two groups according to platelet reactivity; ISR was conformed by coronary angiography; RT-PCR method was used to detect CMTM5 gene expression; The CMTM5 over expression, reduction and control EC lines were established; Cell count, MTT, Brdu and flow cytometry methods were used to detect the proliferation of ECs, scratch and transwell experiments to test the migration of ECs, Western blot was used to detect signal path expressions.
Results
CMTM5 gene expression in HAPR (High on aspirin platelet reactivity) group was 1.72 times compared with No-HAPR group, which was significantly higher than No-HAPR group. HAPR group ISR rate was 25.8% (8 cases), the incidence of No-HAPR ISR group was 9.7% (9 cases), and the results showed that in HAPR group, the incidence of ISR was significantly higher than that in No-HAPR group (P=0.04, OR=0.04, 95%CI=1.16－7.52), which showed that CMTM5 gene was significantly correlated with the risk of ISR. In HAPR group ISR rate was 25.8% (8 cases), the incidence of ISR in No-HAPR group was 9.7% (9 cases), and the results showed that the risk of ISR in HAPR group was significantly higher than that in No-HAPR group. All the results showed that CMTM5 was significantly correlated with the risk of ISR in CAD patients (P < 0.05). CMTM5 overexpression inhibited the proliferation and migration ability of ECs (P < 0.05), PI3K/Akt signaling pathways were involved in the role of regulation on ECs.
Conclusion
Our results revealed that CMTM5 gene was closely related with ISR, CMTM5 overexpression may repress ECs proliferation and migration through regulating PI3K-Akt signaling.
Keywords: Platelet reactivity, CKLF-like marvel transmembrane dimain containing member 5, Coronary artery diseases, In-stent restenosis
经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention，PCI)的广泛应用挽救了大量急性冠脉综合征患者的生命，金属裸支架的应用伴随着术后支架内再狭窄(in-stent restenosis，ISR)问题的出现，一度成为心内科医生和介入操作者关注的焦点，据文献报道发生率在10%~60%[1]。随着药物涂层支架的广泛应用，ISR问题得到了部分解决，药物涂层支架能够有效地抑制损伤血管内皮细胞和平滑肌细胞的增殖，与金属裸支架相比能够显著降低ISR发生率，但ISR发生率仍在10%以上[2-5]。
内皮细胞(endothelial cells, ECs)完整性的损伤及功能缺陷是动脉粥样硬化损伤和血管损伤后新生内膜形成最初的始动因素[6-7]，目前多数研究都在强调药物涂层支架优于金属裸支架，具有显著降低PCI术后ISR的优点，而新生内膜的形成影响了PCI的术后效果，最终导致了ISR，但目前内皮细胞完整性保护和损伤后修复的研究尚少见报道，而保护血管内皮细胞的完整性和在血管损伤后加速血管内皮细胞的修复被看成是降低损伤，从而形成重要的靶向治疗策略。
CMTM5是趋化素样因子家族的第5个成员，由6个外显子和5个内含子组成，广泛表达于正常成人和胎儿组织内[8]。Voora等[9]的研究发现，CMTM5基因表达量的变化与心血管事件的发生风险紧密相关。本课题组既往的研究结果表明CMTM5基因与冠心病患者(coronary artery disease，CAD)支架术后血小板高反应性(high on aspirin platelet reactivity，HAPR)显著相关，该基因与CAD患者支架术后虽规律服用阿司匹林仍有部分患者发生心血管事件相关[10-11]。
CMTM5基因目前在心血管领域的研究仍处于探索阶段，本研究旨在探讨CMTM5基因表达量是否与中国CAD患者PCI术后支架内再狭窄的发生存在相关性，以内皮细胞的完整性的损伤作为切入点，聚焦于基因与内皮细胞完整性修复方面，进一步探讨CMTM5基因与人血管内皮细胞功能的关系。
1. 资料与方法
1.1. 病例资料及相关指标定义
选择2015年1月至2016年12月在首都医科大学附属北京世纪坛医院心血管内科接受住院治疗，并行PCI手术的冠心病患者，共计124例。
本研究遵循伦理和赫尔辛基宣言，研究开始前已经首都医科大学附属北京世纪坛医院伦理委员会审查批准，所有参与研究的患者本人及其家属均签署知情同意书。
入选标准：(1)年龄≥50岁; (2)经冠状动脉造影确诊为冠心病，均实行了PCI手术，术后均规律服用双联抗血小板治疗至少6个月，并已调整成单药阿司匹林100 mg/d治疗的心血管疾病患者。
排除标准：(1)裸金属支架置入者; (2)有阿司匹林或氯吡格雷使用禁忌者; (3)血小板计数小于100×109/L者；(4)血液系统疾病者；(5)严重肝肾疾病者；(6)恶性肿瘤者；(7)应用GP Ⅱb/Ⅲa拮抗剂、华法林或非甾体类抗炎药者；(8)近期有消化性溃疡导致胃肠出血者；(9)依从性不良者。
置入支架后6个月行冠脉造影，支架内再狭窄指PCI术后冠脉管腔出现狭窄直径≥50%可以伴或不伴临床症状。
1.2. 分组及CMTM5基因表达检测
血小板聚集率测定采用光学比浊法，分组方法同本课题组前期研究[10-11]，将入选患者分为HAPR组和非血小板高反应性(no-high on aspirin platelet reactivity，No-HAPR)组，其中HAPR组31例和No-HAPR组93例；提取采集外周血标本RNA，采用RT-PCR方法检测样本中CMTM5基因表达量。
1.3. 细胞培养及转染
本实验选取EA.hy926血管内皮细胞系，人脐静脉内皮细胞融合细胞，与原代脐静脉内皮细胞的生物学功能相似。培养条件为10%(质量分数)DMEM，37 ℃ 5%(体积分数)CO2培养箱，0.25%(质量分数)胰蛋白酶37 ℃消化，1 :3进行传代。采用山东维真生物科技有限公司包被过表达CMTM5的慢病毒，北京普瑞金生物科技有限公司包被低表达CMTM5的慢病毒，在六孔板每孔中接种1×105 ECs，当ECs融合度接近70%时，12 h后转染目的质粒，24 h后在荧光显微镜下观察转染效率，转染效率＞70%用于下一步实验。
1.4. 细胞迁移和增殖能力的检测
将实验细胞分为正常内皮细胞组(non-infected endothelial cells, EN)、过表达CMTM5内皮细胞组(CMTM5 overexpression endothelial cells, EO)、过表达对照组(ad-mock infected endothelial cells, EO-mock)、低表达CMTM5内皮细胞组(CMTM5 suppression endothelial cells, ES)和低表达对照组(lenti-mock infected endothelial cells, ES-mock)共5组。
细胞刮伤法检测ECs的横向迁移能力，Transwell法检测ECs的纵向迁移能力，细胞计数法、MTT、Brdu掺入实验和流式细胞术(flow cytometry，FCM)检测ECs的增殖能力，以上实验重复次数≥3次。
1.5. Western-blot检测信号通路蛋白表达
提取各实验组蛋白，BCA法测定的蛋白浓度后进行SDS-PAGE电泳，80 V垂直电泳约30 min，120 V电泳直至溴酚蓝泳道的最底部；根据目的蛋白的相对分子质量大小进行切胶；转膜，转膜时间为200 mA约2 h；5%(质量分数)牛奶进行封闭室温2 h或4 ℃过夜，一抗室温2 h或4 ℃过夜，TBST洗3次，每次5 min，二抗孵育室温1 h，增强化学发光试剂显色后，暗室曝光化学发光。
1.6. 统计学分析
采用SPSS 17.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用t检验，计数资料用百分数表示，组间比较采用卡方检验。Image pro plus5.0分析蛋白条带显影强度，COX回归模型分析危险因素和目的基因在不良心血管事件发生中所占的风险比例，P < 0.05认为差异具有统计学意义。
2. 结果
2.1. 基本资料
根据实验室检查结果符合HAPR诊断标准者共31例(14.7%)，两组患者的基线资料仅吸烟的组间差异有统计学意义(P < 0.05，表 1)。对所有患者进行出院后随访观察，在本研究中未出现失访患者，共有17例患者发生ISR，占13.7%，HAPR组有8例患者发生ISR，发生率为25.8%，而No-HAPR组有9例患者发生ISR，发生率为9.7%。
表1.
HAPR组和No-HAPR组的临床基线资料
Baseline characteristics of the patients in HAPR and No-HAPR groups
| Variables | HAPR(n=31) | No-HAPR(n=93) | P |
| HAPR, high on aspirin platelet reactivity; BMI, body mass index; ACEI, angiotensin converse enzyme inhibitor；ARB, angiotensin receptor inhibitor；CCB, calcium channel blocker. *P < 0.05. | |||
| Age/years, x±s | 76.3±7.3 | 74.8±8.9 | 0.063 |
| Male，n(%) | 27(87.1) | 72(77.4) | 0.308 |
| BMI/(kg/m2), x±s | 26.1±3.3 | 24.5±3.1 | 0.451 |
| Hypertension，n(%) | 25(80.6) | 66(71.0) | 0.354 |
| Diabetes，n(%) | 12(38.7) | 32(34.4) | 0.670 |
| Current smoking，n(%) | 11(35.5) | 15(16.1) | 0.039* |
| Hyperlipidemia，n(%) | 27(87.1) | 75(80.6) | 0.589 |
| Essential medicines，n(%) | 14(45.2) | 55(59.1) | 0.212 |
| ACEI/ARB | 22(70.9) | 61(65.6) | 0.663 |
| β-blocker | 12(38.7) | 45(48.4) | 0.408 |
| CCB | 13(41.9) | 31(33.3) | 0.395 |
| Nitrates | 24(77.4) | 81(87.1) | 0.249 |
| Stains | 27(87.1) | 72(77.4) | 0.308 |
| Cardiovascular events，n(%) | 8 (25.8) | 9 (9.7) | 0.037 |
2.2. CMTM5基因与血小板反应性及心血管事件发生风险
CMTM5基因在HAPR组的表达量是No-HAPR组表达量的1.72倍，该基因表达量在HAPR组显著高于No-HAPR组(P < 0.05)，与HAPR的发生存在显著相关性。HAPR组有8例患者发生ISR，发生率为25.8%(表 1)，而No-HAPR组有9例患者发生ISR，发生率为9.7%，发现HAPR组患者ISR的发生率显著高于No-HAPR组的发生率(P=0.04，OR=2.95，95%CI：1.16~7.52)。
COX回归分析将年龄、性别、BMI、吸烟史、高脂血症、合并糖尿病等传统心血管疾病危险因素及CMTM5基因纳入回归模型(表 2)，ΔCt CMTM5和吸烟因素是再狭窄事件发生的独立危险因素，其中吸烟因素每增加1，再狭窄事件的发生会增加1.998倍，ΔCt CMTM5每增加1，再狭窄事件发生率会降低至原来的8.6%，即CMTM5基因表达量降低，再狭窄事件发生率降低至原来的8.6%，反之CMTM5基因表达量增加，再狭窄事件的发生风险则会增加。
表2.
COX回归分析影响心血管事件发生的危险因素
COX regression analysis for the potential risk factors of cardiovascular events
| Risk factors | HR | 95%CI | P |
| ΔCt CMTM5 | 0.086 | 0.053－0.099 | 0.010 |
| Current smoking | 1.998 | 1.050－3.802 | 0.035 |
2.3. CMTM5过表达抑制内皮细胞增殖能力
采用细胞计数、MTT、FCM法检测CMTM5过表达对血管内皮细胞增殖能力的影响(图 1)，细胞连续培养至第4天计数，EO组细胞计数(128±17)显著低于EO-mock组(195±16)和EN组(201±17)(P均 < 0.05，图 1A)；MTT结果提示EO组ECs增殖速度和数量显著低于EO-mock组和EN组(P均 < 0.05，图 1B)；FCM法检测提示EO组中细胞处于S+G2分裂期状态ECs数量占总体的13.55%，显著低于EO-mock组(23.24%)和EN组(21.43%)(P均 < 0.05，图 1C和1D)。
图1.
CMTM5过表达抑制血管内皮细胞增殖能力
Overexpression of CMTM5 attenuated the proliferation of ECs in vitro
*P < 0.05, n≥3. A and B, cell counting and MTT assay revealed that overexpression of CMTM5 inhibited the proliferation of ECs; C and D, FCM assay showed the percentage of S+G2 phase cells was significantly lower than that in EN and EO-mock groups (P < 0.05). EN, non-infected endothelial cells; EO, CMTM5 overexpression endothelial cells; EO-mock, ad-mock infected endothelial cells.
CMTM5基因低表达对内皮细胞增殖能力影响研究发现(图 2)，连续培养内皮细胞至第4天，ES组细胞计数(233±20)显著高于ES-mock组(148±19)和EN组(146±18，P均 < 0.05，图 2A)；MTT实验结果提示ES组的ECs增殖速度和数量显著高于ES-mock组和EN组(P均 < 0.05，图 2B)；Brdu掺入实验显示ES组中Brdu掺入到细胞核中的数量高于ES-mock组和EN组(P均 < 0.05，图 2C和2D)；FCM分析结果提示ES组处于细胞S+G2分裂期ECs数量占总体的40.98%，显著高于ES-mock组(22.82%)和EN组(20.63%, P均 < 0.05，图 2E和2F)。
图2.
CMTM5低表达促进血管内皮细胞增殖能力
CMTM5 inhibition promoted the proliferation of ECs in vitro
*P < 0.05, n≥3. A and B, cell counting and MTT assay showed that CMTM5 suppression facilitated the growth of ECs; C and D, BrdU incorporation assay revealed the proliferation-promoting effect of CMTM5; E and F, using FCM assay, the percentage of S+G2 phase cells in ES group was significantly higher than that in EN and ES-mock group (P < 0.05). EN, non-infected endothelial cells; ES, CMTM5 suppression endothelial cells; ES-mock, lenti-mock infected endothelial cells.
2.4. CMTM5过表达抑制内皮细胞迁移能力
采用刮伤实验和Ttranswell实验检测CMTM5基因过表达对内皮细胞迁移能力影响。观察刮伤后24 h和48 h内皮细胞向中线迁移数量(图 3)，发现刮伤后48 h细胞迁移数量ES组ECs迁移细胞数(313±38)明显高于ES-mock对照组(220±30)和EN组(215±32，P均 < 0.05，n ≥3)，而EO组ECs迁移细胞数(181±26)显著低于EO-mock对照组(240±37)和EN组(P均 < 0.05，n ≥3)，可能ES组刮伤区域ECs横向迁移能力显著高于EO组(P均 < 0.05，n≥3)。
图3.
CMTM5基因对人血管内皮细胞横向迁移能力的影响
Effects of CMTM5 changes on the migration of ECs
* P < 0.05, n≥3. EN, non-infected endothelial cells; EO, CMTM5 overexpression endothelial cells; EO-mock, ad-mock infected endothelial cells; ES, CMTM5 suppression endothelial cells; ES-mock, lenti-mock infected endothelial cells.
培养内皮细胞6h后固定染色，倒置显微镜下观察Transwell小室膜上面的ECs向膜下面迁移的数量(图 4)，ES组ECs迁移数量(89±11)显著高于ES-mock(62±9)和EN组(59±7，P均 < 0.05，n≥3)；EO组ECs迁移数量(27±5)显著低于EO-mock(61±7)和EN组(P均 < 0.05，n≥3)。
图4.
Transwell实验-观察CMTM5对血管内皮细胞纵向迁移能力影响
Effects of CMTM5 on ECs migration
*P < 0.05, n≥3. EN, non-infected endothelial cells; EO, CMTM5 overexpression endothelial cells; EO-mock, ad-mock infected endothelial cells; ES, CMTM5 suppression endothelial cells; ES-mock, lenti-mock infected endothelial cells.
2.5. CMTM5过表达抑制内皮细胞迁移能力
PI3K、Akt的表达量在ES组、ES-mock组和EN组之间无明显变化，而p-Akt在ES组中的表达量高于EO-mock组和EN组，ES组中p-Akt的表达量与EO-mock组和EN组相比差异有统计学意义(P < 0.05, 图 5)，p-Akt在EO组中的表达量低于EO-mock组和EN组，EO组中p-Akt与EO-mock组和EN组相比差异具有统计学意义(P < 0.05)，表明磷酸化信号通路蛋白在ES组中的表达量显著高于EO组。
图5.
Western blot检测信号通路蛋白的表达
The effects of CMTM5 levels on the PI3K/Akt pathway proteins
*P < 0.05, n≥3. A and B, The protein levels of p-Akt in ES group was significantly higher than than in EN and ES-mock groups (P < 0.05);C and D, the protein levels of p-Akt in EO group were significantly lower than that in EN and EO-mock groups (P < 0.05). EN, non-infected endothelial cells; EO, CMTM5 overexpression endothelial cells; EO-mock, ad-mock infected endothelial cells; ES, CMTM5 suppression endothelial cells; ES-mock, lenti-mock infected endothelial cells.
3. 讨论
PCI术的开展让越来越多的CAD患者受益，但金属裸支架导致的高ISR发生率限制了介入手术给患者带来的获益，药物涂层支架的应用降低了金属裸支架术后ISR发生率，使得ISR发生率降低了10%左右[12]，但研究表明ISR发生率仍有3%~25%，以及同时存在的迟发支架内血栓的问题也困扰着介入医生们。
ECs的结构损伤以及功能障碍是ISR发生的始动环节，ECs损伤后释放炎症因子、黏附分子促进了炎症反应和血栓形成，协同平滑肌细胞增殖迁移参与血管重塑[13]。药物涂层支架的应用虽然能够延缓平滑肌细胞增生导致的再狭窄，但也延迟了支架覆盖血管部位的内皮化，并使正常ECs的功能受到影响。因此，在药物涂层的基础上，研发出能加快再内皮化进程的新的生物制剂是目前研究的焦点。
本研究发现低表达的CMTM5能够促进损伤ECs增殖和迁移的能力，促进损伤的ECs完整性的修复，使再内皮化的速度加快，维持了内皮细胞的完整性和稳态，从而减低ISR和迟发支架内血栓的形成。CMTM5基因编码的产物与血小板表面GPⅡb/Ⅲa整合素结合形成复合物，能够影响整合素依赖的细胞生物学功能[8]。同时，该基因也是重要的血管生成因子，与血管生成的生理学和病理学存在紧密的联系。在肿瘤细胞中该基因通过PI3K/Akt信号通路抑制肿瘤的生物学行为[14]。本研究结果提示CMTM5基因通过PI3K/Akt信号通路的活化参与了CMTM5基因调控ECs增殖和迁移的过程，此信号通路蛋白磷酸化的作用促进了ECs的增殖和迁移，解释了ES组ECs增殖和迁移的能力高于EO组，与该基因调控肿瘤细胞增殖和迁移的信号通路相似。以上几点共同解释了HAPR组患者ISR发生风险显著高于No-HAPR组的原因，因此，假设包被低表达CMTM5基因的病毒可被看成是新的生物学制剂，具有潜在的治疗价值，CMTM5基因的低表达有可能成为PCI术后防治心血管事件发生的有效药物。
综上所述，本研究在中国人群中探讨了阿司匹林反应性相关基因CMTM5与老年冠心病患者支架术后ISR的相关性，从内皮细胞完整性角度解释CMTM5基因与ISR的相关关系，从研究机制层面上探讨PI3K/Akt信号通路的活化参与了CMTM5基因调控ECs增殖和迁移的过程。
Funding Statement
中国铁路总公司科技研究开发计划课题(J2017Z608)、首都医科大学附属北京世纪坛医院院青年基金(2017-q27)和中心实验室开放课题(2019-KF28)
Supported by Foundation of Research and Development Plan of China Railway Corporation (J2017Z608), and Youth Foundation (2017-q27) and Open Research Funding (2019-KF28) of Central Laboratory of Beijing Shijitan Hospital Affiliated to the Capital Medical University
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