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. 2020 Aug 22;52(5):952–958. [Article in Chinese] doi: 10.19723/j.issn.1671-167X.2020.05.027

猪小肠黏膜下层海绵的制备及促成骨作用

Preparation and osteogenic effect study of small intestinal submucosa sponge

王 梅 1,*, 李 博文 1,*, 王 思雯 2, 刘 玉华 1,*
PMCID: PMC7653438  PMID: 33047736

Abstract

目的

制备并通过体外实验评价一种新型猪小肠黏膜下层(small intestinal submucosa, SIS)海绵的基本性能，建立动物模型评价其体内促成骨能力。

方法

采用冷冻干燥法制备SIS海绵，通过环境扫描电镜观察微观结构和孔径大小，比重法检测孔隙率和吸水率，万能力学试验机测试其机械性能，细胞增殖-毒性检测评估其生物相容性。通过建立比格犬动物模型评价其体内促成骨作用，将3只比格犬前磨牙拔牙窝共计18个位点随机分为3组，放置SIS海绵作为SIS海绵组、放置Bio-Oss骨粉并覆盖Bio-Gide膜作为阳性对照组，不做处理作为空白对照组，术后分别于4周和12周取材行微计算机断层扫描技术(micro computed tomography, Micro-CT)检测，采用单因素方差分析法对数据进行统计学分析，以评估SIS海绵的促成骨效果。

结果

SIS海绵的平均孔径为(194.90±30.39) μm，孔隙率为92.31%±0.24%，吸水率为771.50%±40.90%，压缩弹性模量为(2.20±0.19) kPa。细胞增殖-毒性检测结果显示SIS海绵不会影响人骨髓间充质干细胞的早期增殖，Micro-CT结果显示术后4周时SIS海绵组骨体积分数(bone volume fraction, BV/TV, 52.81%±3.21%)和阳性对照组(58.30%±9.36%)显著高于空白对照组(38.65%±4.80%，P < 0.05)，SIS海绵组骨密度[bone mineralized density, BMD, (887.09±61.02) mg/cm3]、阳性对照组[(952.05±132.78) mg/cm3]和空白对照组[(879.29±74.27) mg/cm3]差异无统计学意义(P >0.05)；术后12周时SIS海绵组BV/TV(47.89%±3.59%)显著低于阳性对照组(60.57%±6.56%, P < 0.05)，与空白对照组(42.99%±2.54%)差异无统计学(P >0.05)，SIS海绵组BMD[(1047±89.95) mg/cm3]和阳性对照组[(1101.37±98.85) mg/cm3]显著高于空白对照组[(890.36±79.79) mg/cm3, P < 0.05]。

结论

SIS海绵具有良好的理化性能和生物相容性，在犬拔牙窝成骨早期(4周)能提高新生BV/TV，在犬拔牙窝成骨后期(12周)可提高新生BMD，具有潜在促成骨应用前景。

Keywords: 猪小肠黏膜下层海绵, 骨组织工程, 促成骨

牙周病、牙髓病和创伤等原因常导致牙齿无法保留，牙齿拔除后可能出现出血、感染、成骨效果不佳等问题，剩余牙槽骨的吸收为种植和美学修复带来了困难和挑战[1-2]。拔牙窝内填充骨替代材料等方法可一定程度减少拔牙后牙槽骨吸收，临床常用骨粉填充并覆盖可吸收生物膜引导骨组织再生，但骨粉等材料存在降解周期长，成骨过程中骨粉残余等缺点[3]。如何简便且有效地减少牙槽骨吸收并促进拔牙窝愈合，仍是亟待解决的问题。骨组织工程为骨缺损修复提供了新的治疗策略，支架在其中发挥为细胞提供微环境和场所、调控新骨生成等重要作用，寻找理想的支架材料成为近年来研究的热点[4-5]。细胞外基质(extracellular matrix, ECM)能够提供最接近于体内细胞生长的微环境，其中脱细胞猪小肠黏膜下层(small intestinal submucosa, SIS)作为一种来源广泛的天然ECM，其生物相容性良好，且具有生物活性，已被广泛应用于皮肤、心血管等软组织的修复[6-7]。近年来已有学者证实了SIS的内源性促成骨作用，并探索了将SIS重塑为海绵的成骨潜力，为其应用于骨缺损修复提供可能性[8-10]，但将SIS海绵应用于拔牙窝骨缺损修复效果仍需进一步研究证实。

本研究拟通过制备SIS海绵，经体外实验检测其微观结构、孔径大小、孔隙率、吸水率、机械性能及细胞毒性, 并建立比格犬前磨牙拔牙窝骨缺损模型，微计算机断层扫描技术(micro computed tomography, Micro-CT)分析评估SIS海绵的促成骨效果，为SIS海绵在骨缺损修复中的应用提供实验依据。

1. 资料与方法

1.1. 主要材料与试剂

实验中主要的材料与试剂包括新鲜脱细胞猪小肠黏膜下层(北京大清生物技术股份有限公司，中国)、Bio-Oss可吸收生物膜(Geistlich公司，瑞士)、Bio-Gide可吸收生物膜(Geistlich公司，瑞士)、培养基(Gibco公司，美国)、胎牛血清(Gibco公司，美国)、青霉素(Sigma公司，美国)、链霉素(Sigma公司，美国)、胰蛋白酶(Gibco公司，美国)、细胞增殖-毒性检测试剂盒(cell counting kit-8, CCK-8, 同仁化学研究所，日本)、生理盐水、乙酸等。

1.2. 主要仪器与设备

实验中主要使用的仪器与设备包括冷冻研磨仪(SPEX公司，美国)、磁力搅拌机(北京金北德工贸有限公司，中国)、精密电子天平(Mettler Toledo公司，瑞士)、万能力学试验机(Instron公司，美国)、环境扫描电镜(FEI公司，荷兰)、冻干机(Labconco公司，美国)、细胞培养箱(Thermo公司，美国)、光学显微镜(Olympus公司，日本)、Micro-CT(Siemens公司，美国)。

1.3. SIS海绵的制备

将采用机械-化学联合法制备的新鲜脱细胞湿态SIS置于冷冻研磨仪中研磨成粉末，再将SIS粉末溶于含有0.1%(质量分数)胃蛋白酶和3%(体积分数)乙酸的水溶液中，配制成浓度为40 g /L的SIS溶液，并于磁力搅拌器下搅拌48 h，将此溶液倒入硅胶模具(1 cm×1 cm×1 cm)中，于冻干机中冻干24 h(-80 ℃、1.62 MPa)，完成SIS海绵制备，消毒备用。

1.4. SIS海绵基本性能检测

1.4.1. 环境扫描电镜观察

采用环境扫描电镜观察SIS海绵的微观结构，工作电压为15 kV。通过微观形貌图像分析孔隙分布，运用Image J软件对图像进行处理，并统计分析SIS海绵的孔径。

1.4.2. 孔隙率测试

将SIS海绵(n=3)称重(ms)，精确至0.000 1 g，在10 mL比重瓶倒满蒸馏水后称重(m1)，将SIS海绵浸入蒸馏水中，超声波震荡一段时间，向瓶中加蒸馏水直至充满，称重(m2)。取出吸满蒸馏水的SIS海绵，称剩余的蒸馏水与比重瓶的质量(m3)，每个SIS海绵测量5次取平均值。孔隙率计算公式:P=(m2-m3-ms)/(m1-m3)×100%。

1.4.3. 吸水率测试

将SIS海绵(n=3)称重(n1)，精确至0.000 1 g，浸入室温下的蒸馏水中，待SIS海绵充分吸水后，将其夹出水面，待液滴自然滴落后称重(n2)，计算吸收水分的质量与SIS海绵质量之比，每个SIS海绵测量5次取平均值，吸水率计算公式W=(n2-n1)/n1×100%。

1.4.4. 机械强度测试

将SIS海绵(n=5)置于万能力学试验机上固定，进行压缩试验，加载速率为0.05 mm/s，加载量和压缩位移传入计算机并对数据进行处理，根据应力-应变曲线的斜率计算压缩弹性模量。

1.5. SIS海绵细胞毒性检测

将SIS海绵于37 ℃环境中在培养基中浸泡72 h制备浸提液，收集浸提液并用0.22 μm的滤器进行过滤除菌。分离、培养人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells, hBMSCs)，传代至第4代，以3×103个/孔的密度接种于96孔板，SIS海绵组的培养液为含10%(体积分数)胎牛血清、100 U / mL青霉素和100 mg / mL链霉素的浸提液，空白对照组为含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 g / L链霉素的正常培养基。分别于1、3、5、7 d加入10 μL CCK-8液，37 ℃孵育2 h后于酶标仪的450 nm波长处测定各孔的光密度值(D)，并进行统计学分析，实验重复3次。

1.6. 犬拔牙窝动物实验

1.6.1. 实验动物

3只健康成年比格犬，体质量10~12 kg(北京市昌扬西山养殖场提供，军事科学院实验动物室饲养)。实验动物入住至少7 d后开始实验操作，正常饮食。本实验经北京大学生物医学伦理委员会批准(批准号: LA2018293)。

1.6.2. 实验分组

实验选用3只比格犬，拔除下颌第一前磨牙(单根牙)和上、下颌第二前磨牙(双根牙)的远中根，共计18个拔牙窝位点，随机平均分为3组，每个拔牙窝行以下处理:放置SIS海绵作为SIS海绵组，放置Bio-Oss骨粉并覆盖Bio-Gide膜作为阳性对照组，不做处理作为空白对照组。手术观察时间点为4周和12周，每个时间点每组样本量为3个。

1.6.3. 手术方法

将实验犬称重，采用3%(质量分数)戊巴比妥钠按体质量1 mL/kg经犬后肢静脉注射行全身麻醉。手术过程如图 1所示，常规备皮、消毒，图 1A示术前犬前磨牙形态，将第一前磨牙直接拔除，采用分根法拔除第二前磨牙远中根，具体方法如下:持续生理盐水冷却降温下，采用牙科涡轮机将第二前磨牙分根，近中根开髓(图 1B)，根管治疗后行树脂充填，将远中根拔除(图 1C)。按分组处理后缝合关闭创口(图 1D)。术后肌肉注射青霉素预防感染，80万U/d，肌肉注射3 d，口腔冲洗护理2周。

图1.

动物实验手术过程

Operation process

A, preoperation; B, pulp opening; C, extraction; D, suture.

图1

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1.6.4. 大体标本观察

术后观察实验犬的饮食、活动以及手术区的愈合情况，植入材料后1周术区软组织反应，有无出血、肿胀、伤口撕裂等现象。分别于4及12周时将犬处死，截取下颌骨前磨牙区及其周围2 cm范围的全层骨组织，并肉眼观察各拔牙窝愈合情况。

1.6.5. Micro-CT检测

将截取的犬下颌骨前磨牙区域标本行Micro-CT检测，检查系统为SIEMENS INVEON软件，检测参数为:电压为80 kV，电流为500 μA，曝光时间1 500 ms，有效体素8.89 μm，每0.6°扫描一张，360°旋转扫描，得到相应的图像，并对图像进行分析得到骨体积分数(bone volume fraction, BV/TV)、骨密度(bone mineralized density, BMD)两种骨形态定量指标。

1.7. 统计学分析

采用统计软件SPSS 23.0对实验数据进行统计学分析，计量资料以均数±标准差表示，采用单因素方差分析LSD统计数据，P < 0.05为差异有统计学意义。

2. 结果

2.1. SIS海绵大体观

SIS海绵整体呈白色，结构均匀一致，未见明显空腔和气泡等缺陷，受轻压力后可恢复原状(图 2)。

图2.

图2

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SIS海绵表面形貌

Physical appearance of SIS sponge

2.2. SIS海绵基本性能检测

用环境扫描电镜分别于300倍(图 3A)和500倍(图 3B)观察SIS海绵的微观形貌，结果显示内部呈现互相交织的网络结构，形成大量较均匀的相互连通的三维孔隙，孔径较为一致。

图3.

SIS海绵环境扫描电镜观察

Scanning electron microscope results of SIS sponge

A, ×300; B, ×500.

图3

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用Image J软件分析测量SIS海绵平均孔径为(194.90±30.39) μm，比重法测定其孔隙率为92.31%±0.24%，吸水率为771.50%±40.90%，万能力学试验机测试压缩弹性模量为(2.20±0.19) kPa。

2.3. SIS海绵细胞毒性检测

在细胞培养的第1、3、5、7天时，获取不同时间点细胞增殖情况并绘制增殖曲线，结果如图 4所示，SIS海绵组和空白对照组之间光密度值差异无统计学意义(P>0.05)。

图4.

SIS海绵对hBMSCs增殖的影响

Effect of SIS sponge on proliferation of hBMSCs

SIS, small intestinal submucoma.

图4

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2.4. 犬拔牙窝动物实验结果

术后1周拔牙窝愈合中，未见明显出血及炎症反应；术后4周及12周拔牙窝愈合情况良好，未见明显炎症反应。

Micro-CT检测结果示术后4周各组拔牙窝内可见新生骨小梁，可识别与周围正常骨质分界，术后12周各组拔牙窝新生骨充满整个拔牙窝骨缺损区，与周围正常骨质界限不清，阳性对照组仍可见高密度骨粉残余。图 5示术后4周拔牙窝新生骨CT截图，分别于从冠状面、水平面、矢状面观察SIS海绵组(图 5A、5B、5C)、阳性对照组(图 5D、5E、5F)和空白对照组(图 5G、5H、5I)新生骨的形态与体积分布。图 6示术后12周拔牙窝新生骨CT截图，分别于从冠状面、水平面、矢状面观察SIS海绵组(图 6A、6B、6C)、阳性对照组(图 6D、6E、6F)和空白对照组(图 6G、6H、6I)新生骨的形态与体积分布。

图5.

术后4周拔牙窝新生骨冠状面、水平面、矢状面的Micro-CT扫描形态

Micro-CT images at 4 weeks after operation

A, B, C, SIS sponge group; D, E, F, positive control group; G, H, I, control group.

图5

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图6.

术后12周拔牙窝新生骨冠状面、水平面、矢状面的Micro-CT扫描形态

Micro-CT images at 12 weeks after operation

A, B, C, SIS sponge group; D, E, F, positive control group; G, H, I, control group.

图6

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根据CT值确定新生骨组织范围，定量分析骨形态指标，主要包括缺损区BV/TV及BMD。术后4周，SIS海绵组、阳性对照组、空白对照组BV/TV分别为52.81%±3.21%、58.30%±9.36%、38.65%±4.80%、BMD分别为(887.09±61.02) mg/cm3、(952.05±132.78) mg/cm3、(879.29±74.27) mg/cm3，分析表明SIS海绵组和阳性对照组BV/TV显著高于空白对照组(P < 0.05)，各组BMD差异无统计学(P>0.05)。术后12周，SIS海绵组、阳性对照组、空白对照组BV/TV分别为47.89%±3.59%、60.57%±6.56%、42.99%±2.54%，BMD分别为(1047±89.95) mg/cm3、(1101.37±98.85) mg/cm3、(890.36±79.79) mg/cm3，结果显示阳性对照组BV/TV显著高于SIS海绵组和空白对照组(P < 0.05)，SIS海绵组和阳性对照组BMD显著高于空白对照组(P < 0.05)。

3. 讨论

ECM具有低抗原性、生物相容性好、可降解性等理想支架应具备的性质，多项研究报道ECM支架在不同骨缺损模型中未见明显炎症反应，并可加速成骨、血管再生和矿化进程[11-12]。SIS是一种来源广泛的ECM材料，主要成分为Ⅰ型和Ⅲ型胶原，还含有纤维粘连蛋白、糖胺聚糖和多种生长因子等成分[13-14]。有学者尝试将这种在促成骨方面具有一定成分优势的ECM材料制成三维海绵，并探究其促成骨作用[15-16]。本实验选用新鲜脱细胞SIS，通过冷冻干燥法制备成SIS海绵，经CCK-8法检测显示其无细胞毒性，具有良好的生物相容性，为进一步将其应用于体内提供实验依据。

孔隙率和孔径是支架材料的重要指标，理想的孔隙率和孔径可允许血管长入和新骨形成，发挥骨引导的作用[17]。骨再生效果随孔径大小而有所差异，研究表明孔径高于100 μm时才能允许新生血管和新生骨组织长入，理想孔隙率应达到80%以上，才适合新生血管的生成，以促进骨再生[18-19]。本实验制备的SIS制备海绵平均孔径为(194.90±30.39) μm，孔隙率为92.31%±0.24%，与以往文献中理想孔径和孔隙率较为一致，在结构上具有促成骨的潜力[15, 20]，但实验中为方便研磨，选用了湿态脱细胞SIS，且研磨为粉末后易吸水潮湿，如何精确筛选最佳浓度的SIS海绵仍需深入研究。

本研究建立了犬拔牙窝骨缺损模型，通过与临床常用骨填充材料和空白对照组相比较，进一步证实该SIS海绵促进骨缺损修复的能力。本研究表明在成骨早期(4周)SIS海绵可达到阳性对照组的效果，与空白对照组相比能够提高新生BV/TV，其原因可能为SIS海绵在成骨早期可为成骨细胞提供生长空间并允许营养分子扩散，这与文献报道中SIS具有显著促成骨效果相一致[16, 21]。而在成骨晚期(12周)SIS海绵新生BV/TV低于阳性对照组，可能与材料缺乏无机成骨成分、降解时间为6~8周、在成骨后期可能降解未能与成骨时间相匹配有关[22-23]。BMD是反映新生骨矿化程度的一个指标，本实验结果显示在成骨晚期(12周)SIS海绵BMD高于空白对照，这可能是由于SIS海绵能够释放生长因子，改善骨缺损区微环境，优化成骨效果[16]。本实验结果数值与Kim等[24]研究相似，比Wang等[25]研究结果略高，这可能是由于受分析方法影响，组织学的方法将会提供更直接的证据。本研究的结论也提示我们，需进一步寻找更有效的方法来提升SIS海绵的性能以提高促成骨能力。

综上所述，本研究中制备的SIS海绵具有良好的理化性能和生物相容性，在犬拔牙窝动物模型中，SIS海绵能提高成骨早期(4周)新生BV/TV，提高成骨后期(12周)新生BMD, 因此，SIS海绵有望成为一种兼具活性成分和适宜结构的新型支架材料。

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