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. 2020 Nov 15;22(11):1226–1232. [Article in Chinese] doi: 10.7499/j.issn.1008-8830.2005115

小胶质细胞焦亡在缺氧缺血性脑损伤中的作用

Role of microglial pyroptosis in hypoxic-ischemic brain damage

谭 兰兰 1,2, 李 梅 2, 冯 晨希 2, 徐 利晓 2, 丁 欣 1,3, 孙 斌 1,3, 李 根 2, 冯 星 1,2,3,*
PMCID: PMC7666390  PMID: 33172560

Abstract

目的

初步探讨小胶质细胞焦亡在缺氧缺血性脑损伤中的作用。

方法

建立体外培养大鼠小胶质细胞系氧糖剥夺再灌注（OGD/R）模型，用Western blot法检测OGD/R后0、1、3、6、12及24 h焦亡相关蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-l（caspase-1）、白细胞介素-1β（IL-1β）、Gasdermin D蛋白N端（GSDMD-N）的表达情况。用慢病毒构建的沉默Gasdermin D（GSDMD）序列转染小胶质细胞，使用免疫荧光和Western blot法检测GSDMD转染效率。将小胶质细胞系分为正常对照组、阴性对照组、LV-sh_GSDMD组（慢病毒沉默GSDMD），使用CCK-8和LDH试剂盒检测沉默GSDMD对OGD/R后24 h小胶质细胞活性和毒性的影响；通过Western blot法检测沉默GSDMD对OGD/R后24 h小胶质细胞中caspase-1、GSDMD-N、IL-1β含量变化的影响。

结果

在OGD/R后0 h起小胶质细胞内焦亡相关蛋白caspase-1、GSDMD-N、IL-1β的表达水平即较OGD/R前发生了上调，并且在24 h达到高峰（P < 0.05）。成功地构建慢病毒沉默GSDMD转染小胶质细胞模型。OGD/R后24 h，与正常对照组相比，沉默GSDMD可提高细胞活性和降低细胞毒性（P < 0.05），降低小胶质细胞内caspase-1、GSDMD-N、IL-1β蛋白水平（P < 0.05）。

结论

慢病毒沉默细胞焦亡关键底物蛋白GSDMD可减轻缺氧缺血性脑损伤，提示小胶质细胞焦亡加重缺氧缺血性脑损伤。

Keywords: 缺氧缺血性脑损伤, 细胞焦亡, 氧糖剥夺再灌注, 大鼠小胶质细胞

缺氧缺血性脑病(hypoxic-ischemic encephalo-pathy, HIE)常导致新生儿死亡或严重的、不可逆的神经功能缺损[1-2]。迄今为止，HIE的治疗仍以支持疗法及亚低温疗法等为主，但其疗效有待提高。因此，进一步明确HIE的发病机制，有助于寻找HIE新的治疗方法。

缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage, HIBD)是HIE的病理过程，常导致大量神经元死亡，从而不可避免地引发炎症，这种炎症主要由小胶质细胞介导，小胶质细胞是中枢神经系统中唯一的固有免疫细胞[3]。脑损伤后，小胶质细胞是发生反应最早的细胞，并且常导致不利后果，如激活星形胶质细胞形成胶质疤痕[4]。目前，研究发现小胶质细胞介导的炎症反应在HIBD、脑中风和创伤性脑损伤中扮演着重要角色[5-8]。

焦亡(pyroptosis)是近年来新发现的一种与炎症反应相关的细胞程序性死亡方式[9-10]。相较于其他细胞死亡类型具有明显的特殊性，从形态学上讲，焦亡兼具坏死和凋亡的双重特征，同时伴随炎症反应。焦亡在早期表现出染色质浓缩、DNA片段化及TUNEL染色阳性等凋亡的特征；随后细胞的细胞膜上会形成众多1~2 nm大小的孔隙，使细胞膜失去完整性，呈坏死样表现；最终细胞肿胀和膜破裂并释放大量细胞内容物，引发级联放大的瀑布式炎症反应[11]。NOD样受体热蛋白结构域3(NOD-like receptor pyrin domain containing 3，NLRP-3)/半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(caspase-1)/Gasdermin D(GSDMD)轴构成经典焦亡通路。研究发现，GSDMD是细胞焦亡的直接效应器，在被上游因素激动后，Gasdermin D蛋白N端(GSDMD-N)结构域从其C端结构域释放出来，靶向结合脂质膜，并且聚合成一个中空的环状低聚物，形成非选择性孔道致细胞肿胀，从而诱导细胞焦亡的发生，引发局部乃至全身的炎症反应[12]。最新研究发现，小胶质细胞焦亡在HIBD的病理生理学中扮演着重要的角色[13]。

因此，本研究拟通过体外实验初步探讨小胶质细胞焦亡在HIBD中的作用。

1. 材料与方法

1.1. 实验细胞及分组

大鼠小胶质细胞系购于上海酶联生物科技有限公司细胞库。(1)将培养好的大鼠小胶质细胞系根据处理方式的不同，分为正常对照组和氧糖剥夺再灌注组(OGD/R组)，OGD/R组再分为0、1、3、6、12、24 h组。(2)慢病毒转染大鼠小胶质细胞系，分为正常对照组和慢病毒转染组，慢病毒转染组再分为阴性对照组(慢病毒空载)、LV-sh_GSDMD 1组(慢病毒沉默GSDMD序列1)、LV-sh_GSDMD 2组(慢病毒沉默GSDMD序列2)、LV-sh_GSDMD 3组(慢病毒沉默GSDMD序列3)。(3)将培养好的大鼠小胶质细胞系根据处理方式的不同，分为正常培养组和OGD/R 24 h组，两组分别再分为正常对照组、阴性对照组、LV-sh_GSDMD组。

1.2. 主要试剂

O2(浓度 < 1%)+CO2(浓度5%)+N2(浓度95%)混合气体(苏州市金宏气体有限公司)；DMEM/HIGH GLUCOSE培养基、不含葡萄糖的厄尔平衡盐缓冲溶液(EBSS)(Gibco，美国)；胎牛血清(Biological Industries，以色列)；青霉素-链霉素溶液(上海碧云天生物技术有限公司)；兔抗caspase-1、GSDMD、IL-1β(Abcam，英国)；鼠抗β-actin抗体(杭州联科生物技术股份有限公司)；慢病毒空载、慢病毒沉默GSDMD序列1、GSDMD序列2及GSDMD序列3(上海吉凯基因化学技术有限公司)；CCK-8试剂盒(日本同仁化学科技研究所)；LDH试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.3. 大鼠小胶质细胞系的培养

大鼠小胶质细胞系的培养基是89% DMEM/HIGH GLUCOSE+10%胎牛血清+1%青霉素-链霉素溶液，于37℃、饱和湿度5%CO2孵箱中培养。

1.4. 构建大鼠小胶质细胞系OGD/R模型

细胞种板培养，待细胞丰度达到80%，吸出原有培养基，用1×PBS清洗2次后，更换为EBSS后放入细胞缺氧舱(O2浓度 < 1%，CO2浓度5%，N2浓度95%)中2 h后取出，立即换成原培养基(89% DMEM/HIGH GLUCOSE+10%胎牛血清+1%青霉素-链霉素溶液)[13]。将上述操作全部完成的时间点设定为0 h，并且另外设定1、3、6、12及24 h，共6个时间点，培养箱继续培养至相应时间点进行收样检测。正常对照组不进行OGD/R处理。实验独立重复3次。

1.5. Western blot法检测蛋白表达

将每个样品在蛋白裂解缓冲液中进行溶解和匀浆，并提取总蛋白。将收集好的待检测的样品使用蛋白试剂盒调成相同浓度，然后按照比例向其中加入5×蛋白上样缓冲液并且在涡旋震荡器上混匀，置于沸水浴中(100℃)煮沸使蛋白充分变性10 min。使用微量加样器将各组样品及marker按顺序进行上样。上样完成后连接电源进行电泳，先用60 V电压，当蛋白进入至浓缩胶和分离胶的交界处时改为90 V电压继续电泳，当marker移动至快接近分离胶底端时停止电泳。将分离胶取下来，转膜前自下而上按照黑板-三张滤纸-分离胶-PVDF膜-三张滤纸-白板的顺序进行叠放，PVDF膜预先用甲醇浸泡预处理1 min以打开孔径，叠放完成后放入置有碎冰的转移槽缓冲液中，以230 mA、60 min恒流进行转膜，操作结束后取出PVDF膜。取出的膜置于5%脱脂牛奶中常温摇床封闭2 h，封闭结束后，使用1× TBST漂洗3次，每次10 min，加入caspase-1(1 : 1 000)、GSDMD(1 : 1 000)、IL-1β(1 : 1 000)、GSDMD-N(1 : 1 000)、β-actin(1 : 10 000)一抗，摇床上常温摇1 h后置于4℃摇床过夜。次日弃去一抗溶液，使用1× TBST漂洗3次，每次10 min；之后分别加入鼠二抗β-actin(1 : 5 000)，其余均为兔二抗(1 : 5 000)，并且置于摇床上摇1 h；弃去二抗溶液，使用1× TBST洗膜3次，每次10 min。使用ECL显影液试剂盒和蛋白显影仪进行显影，所获得的图像的灰度值分析采用Image J软件进行。

1.6. 慢病毒转染大鼠小胶质细胞系

将细胞接种于24孔板中，待细胞丰度至80%时进行慢病毒转染实验。将冻存于-80℃冰箱中的慢病毒取出后置于冰上融化，使用离心机稍微离心使病毒液完全沉于离心管底部。根据预实验中已确认的感染复数(MOI)值(MOI=100)及病毒滴度(9×108/mL)计算慢病毒使用量并且将其稀释到无血清培养基中[慢病毒的使用量=(MOI×细胞数目)/病毒滴度]，吸取病毒液(慢病毒沉默GSDMD序列1、GSDMD序列2、GSDMD序列3或慢病毒空载)并将其分别加入各组细胞中，将细胞放入37℃ CO2培养箱中培养，感染约12 h，更换新鲜的培养基。72 h后利用免疫荧光和Western blot以判断转染效率，带绿色荧光的是转染上的目的细胞，转染效率在90%以上，提示可用于后续实验。实验独立重复3次。

1.7. CCK-8法检测细胞活力

将大鼠小胶质细胞系以1×104细胞/孔的密度接种在96孔板上，并且每孔的培养基为100 μL。经过OGD/R后24 h，吸出培养基，将每个孔中的培养基换成100 μL培养基+10 μL CCK-8，并且于37℃ CO2培养箱中孵育2 h，2 h后取出，使用96孔板酶标仪在450 nm处测量样品的吸光度(OD)。实验独立重复3次。

1.8. LDH试剂盒法检测细胞LDH漏出率

将大鼠小胶质细胞系以1×104细胞/孔的密度接种在96孔板上，并且每孔的培养基为100 μL。经过OGD/R后24 h，从每孔中收集50 μL上清液，并且按照LDH试剂盒操作步骤进行加样操作，混匀后室温放置5 min，使用酶标仪在450 nm处测定各样品OD值，计算LDH漏出率。实验独立重复3次。

1.9. 统计学分析

采用GraphPad Prism 5统计软件对数据进行统计学分析。计量资料采用均数±标准差(x±s)表示，OGD/R前后比较采用配对t检验；多组间比较用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

2. 结果

2.1. OGD/R处理后的大鼠小胶质细胞系内焦亡相关蛋白caspase-1、GSDMD-N、IL-1β水平的时程变化

Western blot结果显示，OGD/R处理后0 h起小胶质细胞内焦亡相关蛋白caspase-1、GSDMD-N、IL-1β的表达水平即发生了上调，并且在24 h这个时间点达到高峰(表 1，图 1)。结果提示，OGD/R后小胶质细胞内激活了焦亡相关蛋白表达。

表 1.

OGD/R后小胶质细胞中caspase-1、GSDMD-N、IL-1β的表达变化  (n=3，x±s)

组别 caspase-1 GSDMD-N IL-1β
注：[caspase-1]半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1；[GSDMD-N] Gasdermin D蛋白N端；[IL-1β]白细胞介素-1β。a示与正常对照组比较，P < 0.05。
正常对照组 0.261±0.009 0.503±0.004 0.797±0.059
OGD/R组
  0 h 0.394±0.034a 0.616±0.033a 1.072±0.026a
  1 h 0.476±0.056a 0.601±0.001a 0.644±0.037a
  3 h 0.344±0.016 0.226±0.003a 0.918±0.072
  6 h 0.434±0.036a 0.251±0.004a 0.648±0.062a
  12 h 0.336±0.037 0.421±0.006 0.728±0.016
  24 h 0.756±0.062a 0.755±0.023a 1.366±0.019a
F值 49.48 466.50 94.98
P值 < 0.0001 < 0.0001 < 0.0001
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图 1.

图 1

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Western blot法检测各时间点小胶质细胞中caspase-1、GSDMD-N和IL-1β表达电泳图

2.2. 慢病毒沉默GSDMD转染大鼠小胶质细胞系

用慢病毒构建带有绿色荧光的沉默GSDMD序列(LV-sh_GSDMD-GFP)转染小胶质细胞，72 h后利用荧光显微镜观察。免疫荧光结果显示，LV-sh_GSDMD 1组、LV-sh_GSDMD 2组和LV-sh_GSDMD 3组均有效地转染小胶质细胞(图 2)。为进一步验证LV-sh_GSDMD的干扰效率，采用Western blot检测结果显示，正常对照组、阴性对照组、LV-sh_GSDMD 1组、LV-sh_GSDMD 2组和LV-sh_GSDMD 3组的GSDMD蛋白表达量分别为0.852±0.013、0.846±0.009、0.137±0.002、0.828±0.013、0.844±0.015，各组比较差异有统计学意义(F=2 302，P < 0.0001)。与正常对照组相比，LV-sh_GSDMD 1组降低了GSDMD蛋白表达量(P < 0.001)(图 3)。提示LV-sh_GSDMD 1组转染小胶质细胞成功，且对GSDMD蛋白表达的干扰效率最高，可用于后续实验。

图 2.

慢病毒沉默GSDMD转染小胶质细胞荧光图(×100)

慢病毒构建带有绿色荧光的沉默GSDMD序列1(LV-sh_GSDMD 1)、序列2(LV-sh_GSDMD 2)、序列3(LV-sh_GSDMD 3)均成功转染进入小胶质细胞内。

图 2

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图 3.

Western blot法检测各组细胞中GSDMD表达电泳图

结果提示GSDMD序列1(LV-sh_GSDMD 1)对GSDMD蛋白表达的干扰效率最高。

图 3

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2.3. LV-sh_GSDMD对OGD/R后的大鼠小胶质细胞系活性的影响

实验结果显示，在正常培养条件下，正常对照组、阴性对照组、LV-sh_GSDMD组小胶质细胞活性比较差异无统计学意义(P > 0.05)。OGD/R 24 h时，与正常对照组相比，LV-sh_GSDMD组细胞活性升高(P < 0.05)，阴性对照组差异无统计学意义(P > 0.05)。OGD/R处理小胶质细胞后24 h，正常对照组和阴性对照组小胶质细胞活性均较正常培养时降低(P < 0.05)。结果提示，LV-sh_GSDMD可提高OGD/R后小胶质细胞活性。见表 2。

表 2.

各组细胞活性比较  (n=3，x±s)

组别 正常培养 OGD/R 24 h t值 P值
注：a示与正常对照组比较，P < 0.05。
正常对照组 1.42±0.04 0.69±0.03 24.420 < 0.001
阴性对照组 1.43±0.06 0.72±0.11 9.663 < 0.001
LV-sh_GSDMD组 1.32±0.20 1.11±0.15a 1.371 0.242
F值 0.712 14.030
P值 0.528 0.006
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2.4. LV-sh_GSDMD对OGD/R后的大鼠小胶质细胞毒性的影响

通过检测小胶质细胞LDH漏出率反映细胞毒性，细胞LDH漏出率越高，细胞毒性越强。实验结果显示，在正常培养条件下，正常对照组、阴性对照组和LV-sh_GSDMD组的细胞毒性比较差异无统计学意义(P > 0.05)。OGD/R 24 h时，与正常对照组相比，LV-sh_GSDMD组细胞毒性降低(P < 0.05)，阴性对照组差异无统计学意义(P > 0.05)。OGD/R处理小胶质细胞后24 h，正常对照组和阴性对照组细胞毒性均较正常培养时升高(P < 0.05)。结果提示，LV-sh_GSDMD可降低OGD/R后小胶质细胞毒性。见表 3。

表 3.

各组LDH漏出率情况比较  (n=3，x±s)

组别 正常培养 OGD/R 24 h t值 P值
注：a示与正常对照组比较，P < 0.05。
正常对照组 0.34±0.12 1.28±0.13 9.091 < 0.001
阴性对照组 0.42±0.08 1.21±0.06 13.710 < 0.001
LV-sh_GSDMD组 0.56±0.04 0.72±0.15a 1.776 0.150
F值 4.698 19.070
P值 0.059 0.002
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2.5. LV-sh_GSDMD对OGD/R后24 h的大鼠小胶质细胞系内焦亡相关蛋白GSDMD-N、caspase-1、IL-1β水平的影响

Western blot结果显示，在正常培养条件下，正常对照组、阴性对照组和LV-sh_GSDMD组小胶质细胞内caspase-1、IL-1β蛋白水平比较差异无统计学意义(P > 0.05)，LV-sh_GSDMD组GSDMD-N蛋白水平低于正常对照组(P < 0.05)。OGD/R 24 h时，与正常对照组相比，LV-sh_GSDMD组小胶质细胞内caspase-1、IL-1β、GSDMD-N蛋白水平降低(P < 0.05)，阴性对照组上述指标差异无统计学意义(P > 0.05)。OGD/R处理小胶质细胞后24 h，正常对照组和阴性对照组小胶质细胞内caspase-1、IL-1β、GSDMD-N蛋白水平均较正常培养时升高(P < 0.05)。结果提示，LV-sh_GSDMD可降低OGD/R后24 h小胶质细胞内caspase-1、IL-1β、GSDMD-N蛋白水平。见表 4，图 4。

表 4.

各组细胞焦亡相关蛋白水平比较  (n=3，x±s)

组别 GSDMD-N caspase-1 IL-1β
正常培养 OGD/R 24 h t值 P值 正常培养 OGD/R 24 h t值 P值 正常培养 OGD/R 24 h t值 P值
注：[GSDMD-N] Gasdermin D蛋白N端；[caspase-1]半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1；[IL-1β]白细胞介素-1β。a示与正常对照组比较，P < 0.05。
正常对照组 1.14±0.06 1.96±0.24 5.789 0.004 0.060±0.022 0.365±0.026 15.520 < 0.001 0.244±0.054 0.608±0.082 6.380 0.003
阴性对照组 1.03±0.17 1.91±0.10 7.613 0.002 0.059±0.018 0.375±0.028 16.710 < 0.001 0.279±0.040 0.625±0.125 4.564 0.010
LV-sh_GSDMD组 0.27±0.12a 0.26±0.08a 0.197 0.854 0.070±0.011 0.148±0.022a 5.453 0.006 0.282±0.042 0.129±0.017a 5.927 0.004
F值 42.490 115.700 0.362 77.150 0.642 31.400
P值 < 0.001 < 0.001 0.711 < 0.001 0.559 < 0.001
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图 4.

图 4

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Western blot法检测慢病毒沉默GSDMD转染小胶质细胞OGD/R模型建立后24 h焦亡相关蛋白GSDMD-N、caspase-1、IL-1β表达电泳图

3. 讨论

迄今为止，HIE仍然缺乏有效的治疗手段。针对HIE导致的严重后遗症的预防仍是临床工作中难以攻克的难题。理论上，针对急性缺血细胞损伤的神经保护剂可以保护脑细胞，提高对HIBD的耐受性，从目前的研究结果看，在动物实验中具有疗效的药物，在临床试验中往往以失败告终。因此，发现HIE新的发病机制，对于HIE的治疗有重要的意义。本研究采用OGD/R模型模拟了体内缺氧缺血情况，观察小胶质细胞焦亡在HIBD中的作用。

近年来研究发现，细胞焦亡是一种由炎症性caspase诱发的细胞程序性死亡方式[14]。在分子水平上，细胞焦亡主要包括caspase-1依赖的经典途径和涉及caspase-4/5/11的非经典途径[15]。NLRP-3/caspase-1炎性小体作为经典途径细胞焦亡通路的核心，目前已被研究得比较清楚[16]。在识别病原体及内源性危险信号后，NLRP-3主要通过胞内的钾离子外流、溶酶体裂解及活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)释放等途径活化，随后通过与凋亡相关点样蛋白及pro-caspase-1结合从而组装成NLRP-3/caspase-1炎性小体。caspase-1的激活如何触发焦亡？有研究发现[12]，GSDMD可作为caspase-1激活细胞焦亡的关键性底物。GSDMD大约有480个氨基酸，分为N端结构域和C端结构域，二者由一长环连接。激活caspase-1可有效地切割GSDMD连接环位点。GSDMD在被上游因素激动后，使其活性N端结构域自C端结构域上释放出来，靶向结合脂质膜，并聚合成一个中空的环状低聚物，形成非选择性孔道，最终导致细胞肿胀，释放出大量成熟的IL-1β、IL-18促炎因子，从而诱发细胞焦亡[12, 17]。

细胞焦亡一般发生在巨噬细胞中，但也可发生在小胶质细胞中[18-19]。细胞焦亡可参与多种疾病的进展，在HIBD过程中扮演了重要角色，例如炎性小体与HIBD有着密切的联系，其可通过多种途径增加促炎因子IL-1β、IL-18前体的生成及分泌，并通过caspase-1的多样化效应，诱导脑缺血神经胶质细胞的焦亡[20]。

在本研究中，首先通过对大鼠小胶质细胞系OGD/R模型制备后各时间点焦亡相关蛋白GSDMD-N、caspase-1、IL-1β表达情况进行观察，发现在OGD/R模型制备完成后的0 h即有GSDMD-N、caspase-1、IL-1β表达升高，并且在24 h时间点达到高峰。提示小胶质细胞焦亡参与了HIBD的病理生理过程。随后利用慢病毒沉默GSDMD转染大鼠小胶质细胞系并且进行OGD/R实验，发现沉默GSDMD的大鼠小胶质细胞系在OGD/R损伤后，其细胞中焦亡相关蛋白GSDMD-N、caspase-1、IL-1β的表达水平发生了下调，伴有CCK-8检测发现细胞活性升高，以及LDH检测发现细胞毒性降低。这些结果提示，小胶质细胞焦亡加重HIBD。但是具体分子机制需有待进一步验证，后续我们也将进行进一步地研究。

Biographies

谭兰兰, 女, 硕士研究生

Feng X, Email: xing_feng66@suda.edu.cn

Funding Statement

江苏省研究生科研与实践创新计划项目（KYCX19_1998）；国家自然科学基金（81771625）；苏州市小儿内科临床医学中心项目（Szzx201504）

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Articles from Chinese Journal of Contemporary Pediatrics are provided here courtesy of Xiangya Hospital, Central South University

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