Abstract
目的
探究长链非编码RNA HIF1A-AS2诱导宫颈癌细胞的上皮间质转换和肿瘤干细胞样特性的机制。
方法
设计3种可以沉默HIF1A-AS2的shRNA转染caski细胞株，选出干扰效果最好的shRNA进行后续研究；将caski细胞分为：Control组、shRNA-NC组和Sh-HIF1A-AS2组；检测各组细胞活力、侵袭能力、上皮间质转换及相关蛋白表达情况、肿瘤细胞成球情况和干细胞标记物情况；
结果
各组细胞活性差异无统计学意义（P > 0.05）；干扰结果确认使用HIF1A-AS2-shRNA1为shRNA；相比Control组，shRNA-NC组所有指标均无显著改变（P > 0.05）；相比shRNA-NC组，Sh-HIF1A-AS2组单位面积侵袭细胞数目、Vimrntin和N-cadherin、细胞成球数目、成球细胞直径、ABCG2阳性细胞率、Nanog、OCT4、SOX2蛋白和mRNA相对表达均显著降低，E-cadherin相对表达显著升高（P < 0.05）。
结论
沉默长链非编码RNA HIF1A-AS2可以抑制宫颈癌细胞的增殖、侵袭及迁移能力。
Keywords: 宫颈癌, 长链非编码RNA HIF1A-AS2, 上皮间质转换, 肿瘤干细胞
Abstract
Objective
To explore the inhibitory effects of silencing long non-coding RNA (LncRNA) HIF1A-AS2 on epithelialmesenchymal transition (EMT) and tumor stem cell-like phenotype in cervical cancer cells.
Methods
We designed 3 shRNA constructs for silencing HIF1A-AS2 in CaSki cells, and the shRNA with the strongest interference effect was selected for subsequent experiment. CaSki cells were transfected with shRNA-NC or Sh-HIF1A-AS2, and the changes in cell viability, invasion ability, EMT, expressions of EMT-related proteins, formation of cell spheres and expressions of stem cell markers were detected.
Results
Transfection with shRNA-NC and Sh-HIF1A-AS2 did not significantly affected the viability of CaSki cells (P > 0.05). Compared with the cells transfected with shRNA-NC, the cells transfected with Sh- HIF1A-AS2 showed significantly reduced invasion ability, expressions of vimentin N-cadherin, and cell sphere formation ability. HIF1A-AS2 silencing obviously lowered the rate of ABCG2-positive cells, significantly reduced the mRNA and protein expressions of Nanog, OCT4, and SOX2, and strongly enhanced the expression of E-cadherin in CaSki cells (P < 0.05).
Conclusion
Silencing HIF1A-AS2 can inhibit proliferation, invasion and migration of cervical cancer cells in vitro.
Keywords: cervical cancer, long non-coding RNA HIF1A-AS2, epithelial-mesenchymal transition, tumor stem cell
宫颈癌（CC）是妇科最常见的恶性肿瘤之一[1]，研究数据显示全世界每年有约47万例宫颈癌宫颈癌新增病例。宫颈癌是也是导致女性死亡的主要疾病之一，目前每年世界各地宫颈癌死亡人数超过20万例[2-3]。尽管早期的宫颈癌有较好的预后，但仍有许多患者死于宫颈癌的转移和复发[4]。目前对宫颈癌的治疗主要以放疗化疗为主，主要使用的药物有：顺铂、白桦脂酸、阿帕替尼等[5-6]。由于宫颈癌肿瘤在女性宫颈中，使用化疗对患者身体伤害较大且化疗和放疗对女性生育有一定的影响，使用基因控制宫颈癌细胞的侵袭、迁移已成为的热门方法。长链非编码RNA（lnc RNA）在调控癌症的发展过程中发挥了重要作用[7]。缺氧诱导因子1α反义RNA2（HIF1A-AS2）是目前研究较多的一种与肿瘤密切相关的RNA，这种基因沉默后可以抑制肿瘤细胞增殖和侵袭，诱导细胞凋亡[8]。lncRNA-HIF1A-AS2可以抑制肝癌细胞的侵袭和迁移[9]。HIF1A-AS1可以通过自噬抑制胰腺癌细胞的增殖[10]。LncRNA HIFlA-AS2在结直肠癌中呈高表达且下调HIF1A-AS2表达可以抑制肝癌细胞的增殖和侵袭能力[11]。由此我们可以推测lncRNA-HIF1A-AS2对宫颈癌细胞的增殖、侵袭及迁移也存在抑制作用，同时对宫颈癌的凋亡也应该存在促进作用。但目前关于lncRNA-HIF1A-AS2对宫颈癌的研究较少，结论也尚不统一。本文旨在研究探究长链非编码RNA HIF1A-AS2诱导宫颈癌细胞的上皮间质转换和肿瘤干细胞样特性的机制，从而为宫颈癌患者的治疗提供一定的理论依据。
1. 材料和方法
1.1. 主要细胞
宫颈癌细胞株胞购自中国科学院细胞库。
1.2. 主要试剂与仪器
TRAIL（Pepro Tech）；孔板（Corning）；显微镜（Olympus）；RPMI 1640培养基、胎牛血清（Hyelone）；胰蛋白酶（Biosharp）；青霉素和链霉素（Solarbio）；Vimrntin抗体（货号：sc-373717）、E-cadherin抗体（货号：sc-393153）、N-cadherin抗体（货号：sc-59987）（Santa Cruz）；低温离心机（SANYO）；光学显微镜（同创仪器）；酶联免疫检测仪（诺亚威仪器仪表有限公司）；Transwell小室（Corning Coseter）；流式细胞仪（BD）；细胞培养箱（Forma）；蛋白电泳及转膜仪（Bio-Rad）。
1.3. 方法
1.3.1. 细胞培养、分组及活性检测
将宫颈癌细胞株培养于含10%FBS、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素RPMI 1640培养基中，保存在温度为37 ℃、CO2浓度为5%的培养箱内培养，将细胞并分为：Control组、shRNANC组和Sh-HIF1A-AS2组。shRNA-NC采用空转质粒转染，Sh-HIF1A-AS2组将HIF1A-AS2基因导入，取各组细胞接种于96孔板24 h，进行细胞活性检测。
1.3.2. RT-PCR检测HIF1A-AS2的水平[12]
配制预混液后取取96孔PCR反应板放置于托架上，每孔加入PCR预混液18 μL和c DNA工作液2 μL，在离心机中保持4 ℃，以3000 r/min离心5 min；将96孔板样品放入PCR仪中，设置反应条件进行反应，内参选择Actin，检测HIF1A-AS2的水平。其中引物序列如下：
HIF1A-AS2上游引物5'-TCTGTGGCTCAGTT宫颈癌TTTTGT-3'；下游引物：5'-ATGTAGGAAGTG宫颈癌AGAG宫颈癌-3'
Actin上游引物：5'-CTGGAACGGT-GAAGGTG ACA-3'；下游引物：5'-AAGGGACTT宫颈癌TGTAACAATGCA-3'。
1.3.3. Transwell检测细胞侵袭[13]
取宫颈癌细胞株在Transwell小室培养24 h后，调整细胞数目为1×105/mL并制成无FBS悬浮液，小室下层加入含血清的细胞培养液，恒温培养1 d后，随机选取视野使用显微镜观察细胞形态，同时统计细胞数量。
1.3.4. 显微观察上皮间质的形态转换[14]
将各组对数生长期人宫颈癌细胞以5×106/mL接种于6孔细胞培养板中，每孔2.0 mL，48 h后在400倍显微镜下观察细胞的形态学变化并拍照，实验重复2次。
1.3.5. Western blot检测蛋白表达水平[15]
将各组对数生长期人宫颈癌细胞，吸除培养皿中的培养基保存于灭菌离心管中。使用1200 r/min离心10 min后加入裂解液重悬细胞，放置与冰中裂解30 min，再次以1200 r/min离心10 min，加入200 μL的Loading Buffer缓冲液，100 ℃煮沸10 min；使用BCA法测定蛋白浓度后，使用SDS-PAGE电泳提取总蛋白，半干法将蛋白转移到PVDF膜后放入TBST溶液中缓慢摇动洗膜5 min，再将PVDF膜放入配制好的一抗液中孵育，室温下缓慢摇动30 min后放入4 ℃恒温箱中过夜。取出后使用TBST洗涤3遍后放入二抗反应液中室温孵育2 h；封闭液：二抗为2000:1；曝光后以Actin为内参蛋白，目的蛋白条带灰度值/内参条带灰度值为相对蛋白表达水平。
1.3.6. qPCR检测Nanog、OCT4、SOX2表达水平
配制预混液后取取96孔PCR反应板放置于托架上，每孔加入PCR预混液18 μL和c DNA工作液2 μL，在离心机中保持4 ℃，以3000 r/min离心5 min；将96孔板样品放入PCR仪中，设置反应条件进行反应，内参选择Actin，检测HIF1A-AS2的水平。其中引物序列如下：
Nanog上游引物5'-TCTGTGGCTCAGTT宫颈癌TTTTGT-3'；下游引物：5'-ATGTAGGAAGTG宫颈癌AGAG宫颈癌-3'
OCT4上游引物5'-G宫颈癌CTCATTTCA宫颈癌AGG宫颈癌-3'；下游引物：5'-GGGACT宫颈癌T宫颈癌GGGTTTTG-3'
SOX2上游引物5'-ATGT宫颈癌CAGCACTA宫颈癌AGAGC-3'；下游引物：GTGTGGATGGGATTG GTGTTCTC-3'
Actin上游引物：5'-CTGGAACGGTGAAGGTGACA-3'；下游引物：5'-AAGGGACTT宫颈癌TGTAACAATGCA-3'。
1.3.7. 显微观察肿瘤细胞成球情况
取各组人宫颈癌细胞接种于超低黏附6孔板悬浮培养细胞，接种细胞密度为105/mL。每3 d补充培养液1.0 mL。培养9 d，收集球形成细胞，分散成单细胞悬液并再悬浮于新鲜干细胞条件培养基中进行传代培养，分别检测培养9 d后每团细胞超过100个的成球细胞数目及成球细胞的成球直径大小。
1.3.8. 流式分选干细胞标记物ABCG2阳性细胞数
取各组人宫颈癌细胞使用PBS清洗，0.1%胶原酶消化分离出单核细胞，以4×104/mL的密度接种于培养皿中，加入DMEM培养液，在37 ℃、5%CO2培养箱内培养4 d后使用0.25%胰蛋白酶消化，制备成单细胞悬液，离心5 min，去上清，加入含4%FBS的PBS，加入ABCG2抗体，使用流式细胞仪进行细胞分选，选出ABCG2阳性细胞并统计。
1.4. 统计学方法
本研究数据分析和作图采用的软件为SPSS 22.0和GraphPad Prism5，方差分析使用单因素方差分析，若P < 0.05则表明差异有统计学意义，本研究所有检验均为双侧检验。
2. 结果
2.1. RT-PCR检测HIF1A-AS2表达结果及各组细胞活性检测结果
由RT-PCR检测HIF1A-AS2表达可以发现，相比Control组相比，shRNA-NC组HIF1A-AS2表达无显著变化（P > 0.05）；相比shRNA-NC组，HIF1A-AS2-shRNA1组、HIF1A-AS2-shRNA2组和HIF1A-AS2-shRNA3组的HIF1A-AS2表达均显著降低，差异有统计学意义（P < 0.05）；检测各组细胞活性发现，各组细胞活性差异无统计学意义（P > 0.05，图 1）。
1.
RT-PCR检测HIF1A-AS2的表达结果
Expression of HIF1A-AS2 detected by RT-PCR in CaSki cells after transfection with different HIF1A-AS2 shRNA constructs. A: Expression of HIF1A-AS2 (*P < 0.05 vs sh-RNA-NC). B: Cells viability in each group.
2.2. Transwell检测细胞侵袭结果
由Transwell检测细胞侵袭结果可以看出，相比Control组，shRNA-NC组单位面积侵袭细胞数目无显著改变（P > 0.05）；相比shRNA-NC组，Sh-HIF1A-AS2组单位面积侵袭细胞数目显著降低，差异有统计学意义（P < 0.05，图 2）。
2.
Transwell检测细胞侵袭结果
Results of Transwell assay for assessing changes in cell invasion ability of CaSki cells after HIF1A-AS2 silencing. A: Cells in Transwell chamber (Original magnification: ×400). B: Number of invading cells per unit area (*P < 0.05 vs sh-RNA-NC).
2.3. 显微观察上皮间质的形态转换结果
使用显微观察上皮间质的形态转换发现，Control组和sh-RNA组细胞呈梭形，细胞与细胞之间的间隙增宽，表现出间质细胞形态学特征；相比Control组，Sh-HIF1A-AS2组细胞与细胞之间的间隙减少间质细胞形态学特征减弱（图 3）。
3.
显微观察上皮间质的形态转换结果
Morphological observation of epithelial-mesenchymal transition (EMT) in CaSki cells after HIF1A-AS2 silencing (×400).
2.4. EMT标记蛋白检测结果
由蛋白质印记结果发现，相比Control组，shRNA-NC组Vimrntin蛋白相对表达、E-cadherin蛋白相对表达、N-cadherin蛋白相对表达均无显著改变（P > 0.05）；相比shRNA-NC组，Sh-HIF1A-AS2组Vimrntin蛋白相对表达、N-cadherin蛋白相对表达显著降低，E-cadherin蛋白相对表达显著升高，差异有统计学意义（P < 0.05，图 4）。
4.
EMT标记蛋白检测结果
Western blotting for detecting marker proteins of EMT in CaSki cells after HIF1A-AS2 silencing. A: Western blots. B: Relative expression levels of the proteins. *P < 0.05 vs sh-RNA-NC.
2.5. 肿瘤细胞成球情况观察结果
观察肿瘤细胞成球情况可以发现，相比Control组，shRNA-NC组细胞成球数目及成球细胞直径差别无统计学意义（P > 0.05）；相比shRNA-NC组，Sh-HIF1AAS2组细胞成球数目及成球细胞直径均显著降低（P < 0.05，图 5）。
5.
肿瘤细胞成球情况观察结果
Formation of tumor cell spheres of CaSki cells after HIF1A-AS2 silencing. A: Microscopic observation of tumor cell spheres in different groups (× 400). B: Number and diameter of the cell spheres. *P < 0.05 vs sh-RNA-NC.
2.6. 流式分选干细胞标记物ABCG2阳性细胞数
由流式分选干细胞标记物发现，相比Control组，shRNA-NC组ABCG2阳性细胞率改变无统计学意义（P > 0.05）；相比shRNA-NC组，Sh-HIF1A-AS2组ABCG2阳性细胞率显著降低（P < 0.05，图 6）。
6.
流式分选干细胞标记物ABCG2阳性细胞数
Flow cytometry for detecting the cells positive for the tumor stem cell marker ABCG2 in CaSki cells after HIF1A-AS2 silencing. A: Stem cell markers sorted by flow cytometry. B: Number of ABCG2-positive cells. *P < 0.05 vs sh-RNA-NC.
2.7. 干样标记物：Nanog、OCT4、SOX2蛋白的表达检测结果
由蛋白质印记检测干样标记物发现，相比Control组，shRNA-NC组Nanog蛋白相对表达、OCT4蛋白相对表达、SOX2蛋白相对表达均无显著改变（P > 0.05）；相比shRNA-NC组，Sh-HIF1A-AS2组Nanog蛋白相对表达、OCT4蛋白相对表达、SOX2蛋白相对表达均显著降低（P < 0.05，图 7）。
7.
干样标记物：Nanog、OCT4、SOX2蛋白的表达检测结果
Western blotting for detecting tumor stem cell markers Nanog, OCT4, and SOX2 in CaSki cells after HIF1A-AS2 silencing.A: Western blots of the proteins. B: Relative expression of each protein. *P < 0.05 vs sh-RNA-NC.
2.8. 干样标记物：Nanog、OCT4、SOX2 mRNA的表达检测结果
由蛋白质印记检测干样标记物发现，相比Control组，shRNA-NC组Nanog mRNA相对表达、OCT4 mRNA相对表达、SOX2 mRNA相对表达均改变无统计学意义（P > 0.05）；相比shRNA-NC组，Sh-HIF1A-AS2组Nanog mRNA相对表达、OCT4 mRNA相对表达、SOX2 mRNA相对表达均显著降低（P < 0.05，图 8）。
8.
干样标记物Nanog、OCT4、SOX2 mRNA的表达检测结果
RT-PCR for detecting mRNA expressions of tumor stem cell markers Nanog, OCT4, and SOX2 in CaSki cells after HIF1A-AS2 silencing. *P < 0.05 vs sh-RNA-NC.
3. 讨论
HIF1A-AS2是1999年Thrash-Bingham等首先在肾非透明细胞癌中发现的，这种RNA在非缺氧和缺氧环境下的癌细胞中均高表达，在胎儿和成年人正常组织中均有表达，但胎儿的表达水平较正常人高[16-17]。随着研究的深入发现，沉默HIF1A-AS2基因的表达对癌细胞有一定的抑制[18]。本研究种设计了三种shRNA干扰HIF1A-AS2的表达，RT-PCR检测HIF1A-AS2的水平，选出了最佳的进行后续的研究。
肿瘤的侵袭及迁移是重要的恶性生物学特征。细胞的侵袭和迁移受到上皮间质转化（EMT）的调节[19]。EMT是指上皮细胞能暂时丧失细胞极性获得间质细胞移动能力。肿瘤细胞能够通过细胞极性丧失，改变自身细胞形态与其他细胞分离[20-21]；同时通过下调细胞粘附因子E-钙粘蛋白（E-Cadherin）的表达[22]，将角蛋白细胞骨架变为波形细胞骨架，促进细胞穿透胞间连接，增强细胞的侵袭能力[23]。肿瘤细胞侵袭、迁移过程中，需要将肿瘤细胞外基质蛋白水解，肿瘤细胞跨越基底膜屏障进入循环系统，才能向远处转移[24]。本研究通过Transwell小室实验发现，相比shRNA-NC组，Sh-HIF1AAS2组单位面积侵袭细胞数目显著降低。同时通过蛋白质印记实验发现，相比shRNA-NC组，Sh-HIF1AAS2组Vimrntin蛋白相对表达、N-cadherin蛋白相对表达显著降低，E-cadherin蛋白相对表达显著升高。说明沉默HIF1A-AS2基因的表达可以通过抑制EMT过程相关蛋白的表达抑制宫颈癌的EMT过程，有效抑制宫颈癌细胞的增殖及迁移能力。这可能是因为沉默了HIF1A-AS2基因后抑制角蛋白细胞骨架变为波形细胞骨架，降低了肿瘤细胞穿透胞间连接能力，同时使得EMT过程受到了抑制，使得细胞的侵袭能力得到了抑制。HIF1A-AS2基因与肿瘤细胞有密切的关系[25]，与本研究得出的结论相一致。
ABCG2是称乳腺癌耐药蛋白乳腺癌细胞中克隆出并引起耐药的基因，是ABC转运体超家族成员[26]。ABCG 2阳性细胞具有自我更新和分化能力。本研究通过流式细胞仪分选得出，相比shRNA-NC组，ShHIF1A-AS2组ABCG2阳性细胞率显著降低，说明沉默HIF1A-AS2基因的表达可以降低ABCG2阳性细胞率，使得肿瘤细胞的自我更新和分化能力减弱，有效抑制肿瘤细胞的增殖。同时本研究也通过肿瘤细胞成球情况发现，相比shRNA-NC组，Sh-HIF1A-AS2组细胞成球数目及成球细胞直径均显著降低。说明沉默了HIF1AAS2基因可以有效抑制肿瘤的增殖。这可能是因为沉默了HIF1A-AS2基因后使得宫颈癌细胞的自我更新和分化能力降低，使得宫颈癌细胞的增殖受到了抑制。在宫颈癌中HIF1A-AS2基因呈高表达，降低其表达可以抑制宫颈癌的发展[27]，与本研究得出的结论相类似。
Nanog是重要的肿瘤干细胞标志性基因，在宫颈癌的发生及发展中该基因去除或失活可在体内外抑制肿瘤细胞的致瘤性[28]。OCT4也是重要的肿瘤干细胞标志性基因，这种基因对维持干细胞正常发生过程中的自我更新具有极其重要的作用[29]。除此之外Sox2也是识别和分选宫颈癌干细胞的分子表明标记，在干细胞形成过程中起着至关重要的作用[30]。本研究中通过蛋白质印记实验发现，相比shRNA-NC组，Sh-HIF1A-AS2组Nanog蛋白相对表达、OCT4蛋白相对表达、SOX2蛋白相对表达均显著降低。这可能是因为沉默了HIF1AAS2基因可以有效抑制肿瘤干细胞的形成，实现抑制宫颈癌的发展。宫颈癌干性基因OCT4、Sox2和Nanog的表达与宫颈癌的发展呈正相关，抑制其表达了一定程度抑制宫颈癌的发展[31]，与本研究得出的结论相一致。
综上所述，沉默长链非编码RNA HIF1A-AS2可以抑制宫颈癌细胞的增殖、侵袭及迁移能力，其作用机制可能与抑制上皮间质转换及调控宫颈癌干性基因的表达相关。
Funding Statement
江西省科技计划项目（20123BBG70189）
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