Er:YAG激光-氟化钠联合法与亚甲基蓝-光动力疗法防龋效果及安全性的比较

Abstract

目的

比较Er:YAG激光-氟化钠联合法与亚甲基蓝-光动力疗法（MB-PDT）的防龋效果及安全性。

方法

建立28只大鼠龋齿模型，随机分成7组：不同功率密度的光动力疗法（PDT）组、激光+氟化钠联合组、激光组、氟化钠组和0.9%生理盐水组。分光光度法检测变异链球菌生长抑制情况；激光荧光诊断仪（LF）检测龋损脱矿程度；组织病理观察牙髓及颊黏膜损伤状况。

结果

PDT组与激光+氟化钠联合组光密度值明显低于其他处理组（P<0.05）；不同处理方法均可使LF值上升，出现不同程度的脱矿；组织病理学观察，70 mw·cm⁻²的联合组和Er:YAG激光组存在牙髓及颊黏膜损伤。

结论

相同参数下，联合组与PDT均有良好的杀菌效果，但PDT不良反应少、损伤小，是一种高效且安全的防龋手段。

龋病是导致牙齿缺失的重要原因，变异链球菌为其主要致龋菌。氟离子可通过抑制细菌生长，促进病变组织再矿化，影响微生物代谢活动等方面[1]，达到龋齿预防的目的[2]，至今仍是临床最常用的防龋方法之一。前期部分研究[3]显示，激光联合氟化物可有效提高防龋效果，但摄入过量氟化物存在诸多不良影响的风险。而光动力疗法（photodynamic therapy，PDT）因其自身的高效杀菌性和不耐药性，在临床诊疗中得到普遍认可。为寻找更加高效、安全的龋病预防方法，本实验选用Er:YAG激光-氟化钠联合法和亚甲基蓝-光动力疗法（methylene blue-photodynamic therapy，MB-PDT）两种不同的防龋方法，从杀菌率和安全性两方面进行比较。

1. 材料和方法

1.1. 主要材料和仪器

变异链球菌UA159国际标准菌株（Streptococcus mutans，首都医科大学口腔医学院研究所），半导体激光器（630 nm，Fotona公司，斯洛文尼亚），口腔激光治疗系统（M021-3AF/3，Fotona公司，斯洛文尼亚），激光荧光诊断仪（DIAGNO-dent，Kavo公司，德国），Wistar大鼠（北京大学医学部实验动物科学部）。

1.2. 方法

1.2.1. 模型建立与分组

选用28只出生后21 d断奶的同窝别、同鼠龄的Wistar大鼠，于22~24 d喂以含有广谱抗生素（青霉素和链霉素）的蒸馏水；25~27 d在口腔内接种变异链球菌（每次100 µL，菌液浓度1×10⁸ CFU·mL⁻¹），同时喂养致龋饲料Keyes2000^#和菌液饮用水；28 d随机抽检变异链球菌菌落数符合致龋要求（>10⁸ CFU·mL⁻¹），停止接种。29 d根据不同功率密度随机分成7组，分别为35 mw·cm⁻² MB-PDT组（A组）、70 mw·cm⁻² MB-PDT 组（B组）、35 mw·cm⁻² Er:YAG激光+2%氟化钠组（C组）、70 mw·cm⁻² Er:YAG激光+2%氟化钠组（D组）、70 mw·cm⁻² Er:YAG激光组（E组）、2%氟化钠组（F组）、0.9%生理盐水组（G组，作为空白对照组），每组4只大鼠，每只取上下颌最后2颗磨牙共8颗，每组样本32颗。

A、B组在大鼠磨牙咬合面涂布光敏剂亚甲基蓝（methylene blue，MB）孵育5 min后使用半导体激光照射；E组使用Er:YAG激光进行照射；F组在牙齿面贴放浸有2%氟化钠的定量滤纸4 min；C、D组则是Er:YAG激光照射完毕再使用定量滤纸进行氟处理。处理前用100 g·L⁻¹水合氯醛麻醉（0.003 mL·g⁻¹）各组大鼠，每周按上述方法处理大鼠1次，连续处理4周，直至实验结束处死大鼠。

1.2.2. 细菌浓度检测

用消毒棉拭子按同一方向分别擦拭各实验组大鼠咬合面一圈，放入到5 mL的离心管里，充分振荡混匀培养液（3 000 r·min⁻¹×2 min），取3 mL于分光光度计下测各组菌悬液在540 nm处光密度（optical density，OD）值。

1.2.3. 激光荧光诊断仪（laser-induced fluorescence diagnostic，LF）处理

分组处理前，检测各组样本初始LF值。实验结束，将各组样本置于矿液中进行脱矿处理12 d后，记录终末LF值。具体测量方法为：将大鼠磨牙咬合面进行十字交叉式划分，寻找4个测量点，反复测定3次后取平均值作为该样本LF值。

1.2.4. 牙髓组织病理观察

样本分组固定，经过脱钙、包埋、切片、苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色、封固后，运用光学显微镜观察牙髓组织，依照Ardian等[4]制定的标准进行评分，具体如下。0：牙髓组织无明显变化；1：部分血管扩张、充血，成牙本质细胞层排列紊乱；2：成牙本质细胞层坏死；3：牙髓组织凝固性坏死。

1.2.5. 颊黏膜组织病理观察

切取大鼠颊黏膜组织，经过冲洗、固定、脱水、透明、包埋、切片、烘烤、HE染色后在光学显微镜下观察。

1.3. 统计分析

采用SPSS 22.0软件对数据进行分析，采用单因素方差分析（ANOVA）对各组数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差表示，LSD法进行两两之间的比较，检验水准α=0.05。

2. 结果

2.1. 不同处理方式对变异链球菌生长的影响

A~G组的OD值分别为0.25±0.02、0.15±0.01、0.28±0.02、0.17±0.01、0.35±0.02、0.33±0.01、0.63±0.03。与G组相比，A~F组的OD值均有显著下降，说明细菌生长受到不同程度的抑制；其中B、D组的OD值降低最显著，即功率密度为70 mw·cm⁻²时的抑菌效果最显著，但2组间差异无统计学意义（P>0.05）。

2.2. LF的检测结果

各组LF的检测结果见表1。通过LF值反映，各组均有不同程度的脱矿。其中G组LF增加值最大，差异有统计学意义（P<0.05），虽然C、D组增加值最低，但差异无明显统计学意义（P>0.05）。

表 1. 各组LF的检测结果.

Tab 1 Examination results of LF in each group

组别	初始值	终末值	增加量
A组	3.56±0.67	13.47±3.16	9.91±2.46*
B组	3.85±0.56	13.36±3.75	9.51±2.77*
C组	3.71±0.73	11.18±4.91	7.47±2.79*
D组	3.88±0.66	11.19±3.21	7.31±1.96*
E组	3.76±0.62	12.25±4.02	8.49±1.88*
F组	3.73±0.58	15.51±4.19	11.78±2.21*
G组	3.79±0.61	24.19±4.31	20.42±3.12

注：*与G组相比差异有统计学意义，P<0.05。

n=32

2.3. 牙髓组织病理观察结果

通过牙髓组织反应评分可见，C、D、E组的评分与其他各组相比明显升高，且差异有统计学意义（表2）。各组牙髓的组织病理表现结果见图1。F组和G组牙髓组织反应为0级表现；A、B、C组偶见1级表现，毛细血管充血、扩张；D组牙髓反应有时可达到2级，局部渗出、细胞空泡变性，成牙本质细胞和成纤维细胞增生；E组毛细血管的扩张、充血深达牙髓深部，伴有炎细胞浸润。

表 2. 牙髓组织反应评分比较.

Tab 2 Comparisons of pulp tissue response scores

组别	0分	1分	2分	3分
A组	32	0	0	0
B组	30	2	0	0
C组*	25	5	2	0
D组*	23	6	3	0
E组*	22	6	3	1
F组	32	0	0	0
G组	32	0	0	0

注：*与其他各组相比差异有统计学意义，P<0.05。

图 1. 各组牙髓组织病理观察 HE × 100.

Fig 1 Pathological observation of pulp tissue in each group HE × 100

A~G：分别为A~G组。

2.4. 颊黏膜组织病理观察结果

各组颊黏膜组织病理观察结果见图2。A、B、G组的大鼠颊黏膜组织病理观察基本正常；F组中颊黏膜仅可见炎症细胞浸润，其余未见明显变化；C、D组颊黏膜上皮层呈现不同程度的萎缩、变薄，其他未见显著改变；E组可见炎症细胞聚集，黏膜下层血管减少，固有层有大范围粉红色物质沉积。

图 2. 颊黏膜组织病理观察 HE × 200.

Fig 2 Histopathological observation of buccal mucosa HE × 200

A~G：分别为A~G组。

3. 讨论

龋病是诸多全身疾病的重要诱因。目前的防龋研究工作主要从以下三方面开展：一是破坏致龋菌生物膜，降低致龋能力；二是减少脱矿，促进再矿化[5]；三是基因层面研究免疫防龋。本实验选择比较Er:YAG激光联合氟化物和PDT两种防龋措施，通过对变异链球菌生长、代谢的影响，对牙髓、牙周组织的损伤情况，为临床提供更为高效、安全防龋方法。

PDT利用光激发光敏剂产生活性氧（active oxygen，ROS），选择性杀伤细胞和组织，从而治愈疾病。因其具有作用范围广、安全性能高、不易耐受等独特的优势，在口腔医学领域内得到越来越多的关注[6]，前期体外实验结果证明，PDT可显著抑制变异链球菌生长。本实验选择MB-PDT进行防龋动物实验，与体外实验相比，动物模型可更好地模拟体内环境，提高实验的准确性。

氟化物因其具有破坏细菌代谢，减少产酸[7]，提升抗酸能力[8]，促进再矿化等诸多优势，而成为目前临床应用最广的防龋材料[9]，其中氟化钠的安全性和有效性已经美国食品药物管理局认证。虽然氟化物能在一定程度上预防龋病产生，但仍有不少研究[10]显示，如过量摄入氟元素可导致氟牙症、氟中毒等不良影响。因此，有学者提出氟化物与激光联合应用，达到提升氟利用率，减少使用频次，从而减少不良反应的目的。Er:YAG激光是口腔临床工作中常用的激光，具有精准、杀菌、刺激组织愈合生长的能力[11]。因而本实验选用Er:YAG激光+2%氟化钠进行防龋研究。

本实验结果显示：与G组相比，其余各组变异链球菌的生长和代谢均受到不同程度的抑制，且B、D组的OD值降低最显著，证明两种防龋方法均有良好的杀菌作用。通过LF检查，C、D组的LF增加值最少，即脱矿最轻，表明Er:YAG激光对氟化钠可产生协同作用，其原理可能为：一是激光促进氟磷灰石形成[2]；二是促进局部氟库形成[12]；三是激光促进氟化物吸收，提升抗酸能力。

牙髓组织遭到外界激惹，可表现为轻微的血液充盈，及时去除刺激，炎症反应可迅速缓解，恢复正常状态[13]。但当刺激较强烈或持续时间较长时，激光热量可导致牙髓血流减慢，形成血栓，甚至发生坏死。通过观察本实验中牙髓组织病理结果，A、B组无明显牙髓组织反应，PDT是一种冷光诱导的生物化学作用，调整适当的能量参数，不会对照射区组织产生热损伤；但C、D、E组均出现了不同程度变化，尤其是当功率密度增加到70 mw·cm⁻²时，牙髓免疫炎性反应剧烈，表现为深达牙髓深部的血管扩张、充血并伴有炎细胞浸润，对牙髓组织伤害性较大。

通过颊黏膜的组织病理观察，PDT组未见明显变化，因携带正电荷的光敏剂，可穿透细胞膜迅速进入细胞深层，PDT对病变区进行选择性杀伤，但不损伤正常组织；由于口腔黏膜在涂布氟化钠的过程中，会受到氟化钠的直接刺激引起损害[14]，但由于本实验使用的氟化钠浓度较低，且作用时间较短，因而除了部分炎症细胞浸润外，未见到其他明显的损伤。本研究使用波长为2 940 nm Er:YAG激光，与牙体组织的3 000 nm吸收峰值相近，可有效减少热损伤，但当Er:YAG激光功率达到一定剂量后，E组仍可见大量的炎症细胞，出现黏膜下层血管减少，固有层大范围粉红色物质沉积。

综上所述，虽然Er:YAG激光联合氟化钠疗法与PDT均有良好的杀菌效果，但PDT对于牙髓、牙周组织刺激较小，炎性反应较轻，应用安全，且不会发生氟化物中毒等不良反应，因此PDT在龋病预防中的优势较Er:YAG激光联合氟化钠疗法更显著。今后应严格掌握PDT的使用参数，更好将PDT应用于临床龋病预防工作中。

Funding Statement

[基金项目] 烟台市重点研发计划（卫生项目）（2016WS055）

Supported by: Key Research and Development Plan (Health Projects) in Yantai City (2016WS055).