替莫唑胺诱导的小鼠胶质瘤耐药动物模型的建立

Abstract

Objective

To establish a mouse model bearing orthotopic temozolomide (TMZ)-resistant glioma that mimics the development of drug resistance in gliomas in vivo.

Methods

Seventy-eight adult C57BL/6 mice were randomly divided into 6 groups (n=13), including 3 TMZ induced groups with low, medium and high doses (5, 25, and 50 mg/kg, respectively) and 3 control groups. In each group, 5 mice were used for evaluating tumor size, 5 for observing survival, and 3 for collecting tumor tissues for primary cell culture. In low-dose TMZ induced group, 3 mice bearing orthotopic murine glioma GL261 cell xenografts received intraperitoneal injections of 5 mg/kg TMZ for 5 days followed by a 10-day washout period before collecting glioma tissues. Tumor cell suspensions were prepared and injected in the mice in the medium-dose group, which were treated with the same protocol but with an increased TMZ dose, and the tumor cells harvested from 3 mice were injected in the high-dose group. The mice bearing GL261 cell xenografts in the 3 control groups received no treatment or were injected with medium- or high-dose TMZ. Cell colony forming assay was used to assess TMZ resistance of each generation of the tumor cells; CCK8 assay was used to determine drug resistance index of the cells.

Results

The mouse models bearing TMZresistant glioma was successfully established. The cells from the high-dose induced group showed a significantly higher colony-forming rate than those from the high-dose control group (P < 0.05), and had a drug resistance 4.25 times higher than that of the cells from untreated control group. High-dose TMZ significantly reduced the tumor volume in the control group (P < 0.05) but not in the high-dose induced group (P < 0.01). The survival time of the tumor-bearing mice was significantly shortened in the high-dose induced group (P=0.0018).

Conclusion

Progressive increase of TMZ doses in mice bearing orthotopic gliomas can effectively induce TMZ resistance of the gliomas.

胶质母细胞瘤（GBM）作为中枢神经系统最常见的原发性恶性肿瘤^[1-2]，患者预后极差，其总体生存期为14.6月，5年生存率仅为5%^[1]。目前GBM的标准治疗方案主要采用手术切除，术后放疗联合替莫唑胺（TMZ）辅助化疗（Stupp方案）^[2]的综合治疗方式。尽管对GBM患者采取了最佳治疗，但绝大多数患者在用药一年内出现耐药，极大影响治疗效果^[3-4]。因此，TMZ耐药已成为改善GBM疗效的重要难题。建立胶质瘤TMZ耐药动物模型为研究胶质瘤细胞TMZ耐药机制提供重要工具，对于阐述胶质瘤细胞TMZ耐药的体内外分子机制，从而提高胶质瘤综合治疗的敏感性，改善患者总体生存时间具有重要意义。

目前国内外诱导胶质瘤细胞TMZ耐药株多采用体外适度递增药物浓度逐步诱导，但却存在诱导时间长、与体内耐药差异较大，耐药性难以长期维持等缺点。曲乐等^[5]通过皮下成瘤裸鼠体内连续传代技术成功建立舒尼替尼耐药肾癌细胞系，解决了肾癌体外耐药细胞系的类似问题。国外Kitange等^[6]为避免体外耐药株因长期培养造成与遗传背景不符，尝试使用患者胶质瘤标本对裸鼠行颅内原位成瘤，并通过体内连续传代技术持续大剂量TMZ诱导胶质瘤细胞耐药。尽管上述耐药模型构建方法十分成熟，但因荷瘤载体免疫功能缺陷而无法反应胶质瘤与机体免疫微环境之间相互关系，并不能满足肿瘤免疫与肿瘤微环境相关的耐药机制研究。因此，本研究采用C57BL/6小鼠原位胶质瘤模型，通过体内逐代适度递增药物剂量刺激小鼠原位肿瘤产生TMZ耐药，从而构建出小鼠胶质瘤TMZ耐药模型。利用已产生耐药的细胞可继续用于接种小鼠，使用大剂量TMZ可长期维持其耐药性。此模型可准确还原胶质瘤细胞在体内产生TMZ耐药的过程，对于阐明胶质瘤TMZ耐药的分子机制具有重要作用，从而为胶质瘤化疗、预测提供新的靶点。

1. 材料和方法

1.1. 细胞培养

小鼠胶质瘤GL261细胞系购于美国ATCC细胞库，常规使用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基，分选后得到的小鼠胶质瘤细胞含10%胎牛血清的DMEM/F12高糖培养基，铺于培养皿中，置于37 ℃、5% CO₂的恒温培养箱中培养。待细胞生长超过80%时传代。

1.2. 小鼠原位成瘤

取生长良好的GL261细胞，弃去原培养基，PBS漂洗2次。用胰蛋白酶（0.25%，含EDTA）约1 mL消化细胞，DMEM完全培养基终止消化后离心去除上清，加入PBS重悬洗涤细胞，计数后离心，再加入适量PBS重悬以调整细胞浓度，放于冰砖中备用。小鼠用1%戊巴比妥钠按50 mg/kg腹腔注射，待小鼠麻醉后剃去头顶毛发，通过耳杆和上齿固定板固定于立体定向仪上，消毒铺巾后切开头顶皮肤，暴露前囟，取其后方3 mm，左侧距中线2 mm处钻孔。使用10 μL微量进样器吸取5 μL细胞悬液（含5×10⁵细胞）固定于立体定向仪且对准钻孔处，缓慢垂直进针3 mm，退针0.5 mm，缓慢注入细胞悬液，每注射1 μL暂停1 min。注射完毕后暂停3 min再缓慢拔针，以骨蜡封闭骨窗，逐层缝合关颅。

1.3. 耐药模型诱导

购买成年C57BL/6小鼠78只于动物房继续饲养1周。随机将小鼠分为6组（13只/组）：诱导组共3组（小剂量、中剂量和大剂量诱导组），对照组共3组（不给药组、中剂量和大剂量对照组）。每组中5只磁共振评估肿瘤大小，5只观察小鼠生存，3只取肿瘤行原代培养。培养GL261胶质瘤细胞系对诱导组1和对照1、2、3组小鼠进行原位成瘤。成瘤7 d后对诱导组1使用小剂量TMZ（5 mg/kg）诱导5 d后停药10 d（图 1A），再将诱导组1小鼠取瘤制备单细胞悬液，经流式分选得到胶质瘤细胞后继续培养，用于接种诱导组2。接种7 d后给予中剂量TMZ（25 mg/kg）处理诱导组2荷瘤鼠，同法取瘤、分选、培养并接种于诱导组3，大剂量TMZ（50 mg/kg）处理诱导组3荷瘤鼠（图 1B）。通过体内传代法逐代适度递增药物剂量诱导耐药，建立小鼠胶质瘤TMZ耐药模型。对照组1使用不含TMZ的溶剂对照处理，对照组2、3分别给予中、大剂量（25、50 mg/kg）TMZ。本研究涉及使用实验动物，经医院实验动物管理与动物福利伦理委员会审批，认为符合要求。

1.

胶质瘤小鼠诱导TMZ耐药示意图

Schematic diagram of induction of TMZ resistance of glioma in the mice. A: Timeline of induction of TMZ resistance in glioma mice. B: Inducted of TMZ resistance in glioma-bearing mice.

1.4. 流式细胞术

通过腹腔注射过量1%戊巴比妥钠溶液处死动物，75%酒精中浸泡10 min，钝性分离获取移植瘤标本。使用眼科剪修剪标本后足量PBS溶液清洗组织块数次，加入少量DMEM基础培养基湿润组织块，用细针头反复碾磨，直至磨成1 mm³碎块。加入少许Ⅰ型、Ⅳ型胶原酶混合消化液后，37 ℃消化20~25 min。加入约2倍体积的DMEM完全培养基终止消化。经200目过滤网过滤，离心收集细胞，少量DMEM基础培养基重悬细胞后加入3倍体积的红细胞裂解液，温和并充分翻转离心管混匀，静置5 min。再经400目过滤网过滤，离心去除上清，使用DMEM基础培养基离心洗涤3次，缓冲液重悬。细胞计数后，根据细胞量，每1×10⁶细胞给予1 μL抗小鼠CD16/32阻断抗体，4 ℃孵育10 min。封闭成功后每1×10⁶细胞加入1 μL的小鼠GFAP-Alexa Fluor^Ⓡ 488抗体4 ℃孵育10 min。采用流式细胞仪分选出小鼠胶质瘤细胞，得到的小鼠胶质瘤细胞用DMEM/F12完全培养基培养。

1.5. CCK-8

取生长状态良好的GL261细胞与诱导组3的小鼠胶质瘤细胞，弃去原培养基，PBS漂洗2次。用胰蛋白酶（0.25%，含EDTA）约1 mL消化细胞，DMEM完全培养基终止消化后离心去除上清，加入PBS重悬洗涤细胞，计数后离心，DMEM完全培养基稀释制成适当密度的细胞悬液，向96孔细胞培养板每小孔中加入100 μL完全培养基约含2000个细胞，预留空白孔并设置6~8个复孔。待细胞贴壁24 h，不同浓度TMZ处理后，向待测小孔与空白孔加入100 μL完全培养基与10 μL CCK8试剂，，置于细胞培养箱中孵育2 h，采用多功能酶标仪检查待测孔450 nm吸光度值（A_{450 nm}），并绘制细胞增值曲线，每组重复检测3次。

1.6. 平板克隆

取生长良好的的小鼠胶质瘤细胞，弃原培养基，PBS漂洗2次，0.25%胰蛋白酶消化，DMEM完全培养基重悬细胞备用。计数细胞后，梯度倍数稀释后以每孔200个细胞的密度接种于六孔细胞培养板中，并加入2 mL培养液，混匀使细胞分散均匀。置培养箱中静置培养10~14 d，期间2~3 d换液并经常观察，当六孔板中出现明显可见的克隆时，终止培养。弃去原培养基，用PBS轻轻漂洗2次。加入4%多聚甲醛固定细胞10 min，弃固定液加适量1%结晶紫染色。随后用PBS缓缓洗去多余染料，置于室温干燥。将六孔细胞培养板置于显微镜下计数细胞克隆数，计算克隆形成率并绘制成图。

1.7. 统计学分析

应用SPSS22.0进行数据分析，定量资料以均数±标准差表示，两组之间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用方差分析，生存资料比较采用Kaplan-Meier生存分析，检验水准α=0.05。

2. 结果

2.1. 小鼠移植瘤中GFAP+细胞流式分选及鉴定

取小鼠胶质瘤组织制备单细胞悬液，使用抗小鼠GFAP-Alexa Fluor^Ⓡ 488抗体行流式细胞术分选胶质瘤细胞，阳性细胞率约占58.3%（图 2C）。分选前原代细胞（图 2A）培养发现其形态各异，经流式分选后细胞形态均一（图 2B），呈现胞体较小偏圆，伪足较多偏短的细胞形态。经细胞免疫荧光证实，分选后细胞均为GFAP阳性胶质瘤细胞（图 2D）。

2.

小鼠移植瘤中GFAP+细胞流式分选及鉴定

Flow cytometric sorting and identification of transplanted tumor GFAP+ cells. A: Primary cells before flow cytometry (Original magnification: ×200); B: Primary cells after flow cytometry (×200); C: Proportion of GFAP+cells by flow cytometry; D: GFAP immunofluorescence after flow cytometry (×200).

2.2. 集落形成与CCK-8实验检测TMZ毒性作用

细胞集落法结果表明，对比中等剂量对照组和诱导组，小鼠胶质瘤细胞集落相对率无明显差异；而大剂量诱导组细胞集落相对率明显高于大剂量对照组（P < 0.05，图 3A），表明耐药小鼠模型胶质瘤细胞具有相对明显的耐药性。以TMZ的浓度为横坐标，肿瘤细胞存活率为纵坐标，绘制剂量-存活率曲线（图 3B），算出半数抑制浓度（IC₅₀），未给药对照组肿瘤细胞IC值为894 μmol/L，大剂量诱导给药组肿瘤细胞IC值为3799 μmol/L，经过5月建立的耐药小鼠胶质瘤细胞耐药指数（RI）约4.25，即对TMZ产生了4.25倍的耐药性。

3.

集落形成与CCK-8实验检测TMZ毒性作用

Colony formation and CCK-8 experiment to detect TMZ cytotoxicity in the glioma cells. A: Relative colony rate of the tumor cells from mice treated with different doses of TMZ. B: Dose-response curve of TMZ of the tumor cells in different treatment groups, ^**P < 0.01.

2.3. 耐药动物与正常用药动物成瘤大小比较

磁共振观察诱导耐药后小鼠的成瘤情况。使用RadiAnt DICOM软件计算肿瘤体积[（长径×短径×层数×层厚）/2]。大剂量对照组（35.16±3.22 mm³）（图 4A）与未给药对照组（44.45±3.17 mm³）（图 4B）相比较提示，大剂量TMZ治疗能明显缩小小鼠胶质瘤体积（P < 0.05），而大剂量诱导组小鼠胶质瘤体积（60.16±2.84 mm³）（图 4C）大于大剂量对照组小鼠原位胶质瘤体积（P < 0.001，图 4D），胶质瘤细胞因产生耐药导致肿瘤体积无明显减小。

4.

耐药动物与正常动物成瘤大小比较

Comparison of tumor volume between drug-resistant and control mice. A: Control group without TMZ treatment. B: Control group with high-dose TMZtreatment. C: Inducted group with high-dose TMZ treatment. D: Comparison of tumor volume among different groups; ^**P < 0.01 vs control group, ^***P < 0.001.

2.4. 耐药动物与正常用药动物生存比较

以小鼠出现偏瘫、癫痫、弓背、活动明显减少为生存终点^[7]，绘制Kaplan-Meier生存曲线（图 5），结果显示不同处理组荷瘤鼠平均生存期具有显著差异（P < 0.001）。对不同处理组荷瘤鼠生存时间进行两两比较，结果显示，与大剂量对照组相比，大剂量诱导组荷瘤鼠生存期明显缩短（P=0.0018）。与中等剂量对照组比较提示，中等剂量诱导组荷瘤鼠生存期较短，但无统计学差异（P=0.1676）。

5.

耐药动物与正常用药动物生存比较

Survival of the mice bearing drug-resistant glioma and control mice, ^**P < 0.01.

3. 讨论

胶质母细胞瘤是颅内最常见最具侵袭性的中枢神经系统肿瘤^[8]。目前以替莫唑胺（TMZ）为基础的辅助和同步放化疗方案是临床治疗GBM的标准治疗方案，但近年来大量与GBM综合治疗相关的临床试验均提示GBM表现出强烈的TMZ耐药，严重地制约其疗效^[4]。因此阐明GBM细胞耐药机制，将对新药的开发、优化临床化疗方案及改善患者生存状态等具有重大意义，而建立胶质瘤TMZ耐药动物模型并研究其生物学性质为这类研究提供了重要的实验工具和基础。

与大多数肿瘤一样^[9-11]，目前构建人脑胶质瘤TMZ耐药细胞株（如：U87MG、U251、SKMG-1等）^[12-14]大多采用体外适度递增药物浓度进行刺激诱导。体外构建的胶质瘤TMZ耐药细胞系耗时较长，且难以长期维持其耐药性。另外其虽能在体外表现出对TMZ耐药的部分表型，但是胶质瘤细胞产生TMZ耐药的过程中包含肿瘤微环境^[15-17]、免疫应答^[18-20]及肠道菌群^[21-22]等体内因素，因此体外诱导耐药细胞系与体内耐药过程相差较大。通过建立胶质瘤TMZ耐药动物模型，能更好地模拟胶质瘤细胞在体内产生TMZ耐药的过程。国内外通过TMZ诱导建立的胶质瘤耐药动物模型较少，国外Kitange等^[6]使用短期培养的患者胶质瘤细胞对裸鼠行颅内原位成瘤，并通过体内连续传代技术持续大剂量TMZ诱导胶质瘤细胞耐药。此种模型采用免疫剥夺的裸鼠，并未综合考虑到GBM产生TMZ耐药的过程中免疫应答的调控。张健等^[23]通过体外诱导C6细胞系TMZ耐药，再接种至大鼠颅内构建出大鼠胶质瘤耐药模型。此模型虽采用具有免疫功能的大鼠，但肿瘤细胞在体外产生耐药过程中并无免疫应答、肠道菌群等综合因素的参与。且另有研究表明，GL261胶质瘤细胞C57BL/6小鼠模型在组织病理学上更接近人脑胶质瘤，而且具有稳定，成瘤率高，周期短，可重复性好的优点^[24-25]，所以上述模型仍具有一定局限性。

为解决上述问题，笔者通过原位成瘤小鼠逐代递增药物剂量诱导胶质瘤细胞耐药，构建出C57BL/6小鼠胶质瘤TMZ耐药模型。结果显示模型小鼠较未给药对照组产生了约4.25倍耐药性，较给药对照组肿瘤细胞可形成约1.5倍的细胞集落，经治疗后因肿瘤耐药致体积无明显减小且生存时间更短。由此说明本文构建的小鼠胶质瘤TMZ耐药模型具有稳定的耐药性。与体外分步诱导法相比，本模型耗时更短，且耐药胶质瘤细胞可继续接种C57BL/6小鼠，大剂量TMZ可长期维持其耐药性。张健等^[23]诱导的大鼠耐药模型结果显示耐药大鼠肿瘤体积与生存与正常组无显著差异，本模型小鼠肿瘤体积与生存的明显差异说明体内连续传代法构建耐药小鼠更能准确反应体内胶质瘤细胞产生TMZ耐药的过程。因此本研究构建出的C57BL/6小鼠胶质瘤TMZ耐药模型更符合胶质瘤细胞产生TMZ耐药的病理生理过程，也能够作为临床前模型更为稳定地模拟临床GBM患者发生TMZ耐药。而且通过基因工程改造模型小鼠，使小鼠诱发颅内肿瘤后，采用体内连续传代技术能更好地观察肿瘤的发生发展与耐药的产生，为阐明胶质瘤TMZ耐药的分子机制提供了重要的实验工具。

制定有效的治疗方案现成为改善胶质瘤疗效的主要挑战^[26-27]，而构建出可以模拟临床胶质瘤耐药的可靠稳定的临床前模型对于研究分子靶向药物至关重要^[28-29]。在朝着个性化医学发展的过程中，通过可靠稳定的临床前模型模拟患者在治疗之前，期间和之后以及采用不同治疗组合的疗效反应，将更好地了解应在每个时间点何时和采用何种疗法以诱导肿瘤死亡。尽管细胞培养模型对于癌症治疗的研究很有价值，但是在临床环境中，这些模型不能完全准确地预测肿瘤对细胞毒性药物或其他生物制剂的反应^[30]。在此模型的基础上，后续我们将详细探讨小鼠耐药模型的耐药机制，通过基因工程改造小鼠使该模型成为多种神经肿瘤学研究的宝贵工具。

Biography

施林勇，在读硕士研究生，E-mail: 627366437@qq.com

Funding Statement

国家自然科学基金(81772656, 81972355)

Supported by National National Science Foundation of China (81772656, 81972355)