牙龈卟啉单胞菌双组分信号转导系统的研究进展

Abstract

牙龈卟啉单胞菌被认为是主要的牙周致病菌之一，与慢性牙周炎发生发展密切相关。面对复杂的口腔环境，牙龈卟啉单胞菌必须及时感知环境变化并作出反应，双组分信号转导系统在其中具有重要作用。双组分信号转导系统通常由组氨酸激酶和反应调节蛋白组成，通过控制蛋白的磷酸化状态调节信号传导。近年来，有关牙龈卟啉单胞菌的双组分信号转导系统陆续被报道。本文就牙龈卟啉单胞菌的双组分系统的组成和功能进行综述。

牙龈卟啉单胞菌作为导致慢性牙周炎的主要病原菌，与心血管疾病、糖尿病、阿尔兹海默症等全身系统性疾病密切相关[1]。面对宿主及口腔内如pH、温度、渗透压、氧化应激、营养物质、抗生素等复杂的生存环境，牙龈卟啉单胞菌需要灵敏地感知其变化并快速作出调整才能得以生存，并发挥毒力作用。这种适应能力一定程度上依靠细菌的双组分信号转导系统（two-component signal transduction system，TCS）[2]。TCS使细菌能够感知、响应和适应各种环境变化。TCS可调节细菌入侵、生物膜形成、趋化作用、脂多糖合成和抗生素耐受等多种与细菌致病性相关的基因的表达[3]–[6]。此外，TCS亦可调节细菌自身生长、分裂、代谢等多方面活动[7]。

近年来，有关牙龈卟啉单胞菌TCS的研究逐渐被报道，本文拟对当前关于牙龈卟啉单胞菌的TCS的研究进行综述[8]–[10]。

1. TCS及其在牙龈卟啉单胞菌中的概况

TCS广泛存在于多种生物体内，但在革兰阴性菌中最为常见。一种细菌可拥有多种不同类型的TCS，其结构不尽相同，随感受的刺激信号和作用的目标基因不同而有所变化。不同细菌内TCS的数目也有所不同，其数值与基因组的大小和所处生态位的多样性有关[11]–[12]。

结构上，典型的TCS通常包括一个组氨酸激酶（histidine kinase，HK）和反应调节蛋白（response regulator protein，RR）。HK通常是含有组氨酸磷酸转移结构域和腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）结合结构域的同型二聚体，主要由胞外感应器、跨膜区、胞内连接区、激酶结构域和ATP结合区组成。其中，激酶结构域即二聚和组氨酸磷酸转移酶（dimerization and histidine phosphotransfer，DHp）结构域[13]。DHp结构域含有一个保守组氨酸残基，可接受和传递磷酸基团[14]。RR则含有一个接受结构域和一个效应结构域，接受结构域含有一个保守的天冬氨酸残基，可接受来自HK的磷酸基团。亦有约50%的RR仅有一个结构域，同时发挥接受磷酸基团和调节下游分子的作用[15]。

除了上述典型HK外，还有一种含有一个起磷酸转移作用的接收结构域的混合型HK[14]。部分混合型HK还含有一个组氨酸磷酸转移酶结构域。另外，部分RR亦含有HK结构域，称之为混合型RR[16]–[17]。通常，编码感应蛋白HK的基因和编码其同源RR以及其它辅助成分的基因同属一个操纵子。但是仍有部分HK或RR编码基因单独存在，缺少其相对应的RR或者HK编码基因。这类单独存在的HK或者RR被称为“孤儿”组件[16]。

功能上，细菌HK通过其位于胞外的N端感应结构域在检测到细胞外环境的特定变化后，其ATP结构域结合ATP，并将其磷酸基团传递至DHp结构域中保守的组氨酸残基实现自身磷酸化反应。然后，同源RR催化磷酸基团转移至RR的接收结构域上的天冬氨酸残基。这通常会触发构象变化激活RR的效应结构域，进而激活（或抑制）靶基因的表达来产生相应的细胞反应[14]。另外，部分RR亦可直接结合RNA或者蛋白质，甚至通过自身的酶活性发挥作用[7]。激活的RR则可通过HK的磷酸酶活性、自身去磷酸化作用或者磷酸酶辅助的去磷酸化作用回到基态水平[7]。反应调节蛋白的总体磷酸化水平最终控制其活性。

在龈下菌斑内，牙龈卟啉单胞菌不仅需要面对复杂多变的环境，还要应对包括宿主的免疫防御体系，以及生物膜中其他微生物产生的代谢物等的挑战。依此推定牙龈卟啉单胞菌的各个双组分信号转导系统在其生存和发挥毒力中的具有重要调控作用。目前研究已知，牙龈卟啉单胞菌的ATCC33277菌株含有5对完整的TCS和2种“孤儿”成分，W83菌株则含有4对完整TCS和4种“孤儿”成分[8]–[10]。相对于其他革兰阴性细菌，牙龈卟啉单胞菌的TCS数量相对较少，一方面，这可能与其专性厌氧的严苛生存条件有关，有相对局限的特定定植部位；另一方面也可能与细菌进化相关，预示着其不同双组分信号转导系统相互之间以及与其他系统之间可能存在着复杂的交互调控作用，牙龈卟啉单胞菌通过组成简单但高效的信号转导系统来调节基因表达以应对特定的挑战。接下来，笔者将对目前研究较多的牙龈卟啉单胞菌TCS，即FimS/FimR、HaeS/HaeR、PorX/PorY、GppX、RprY系统的组成和功能进行阐述。

2. FimS/FimR

FimS/FimR TCS在ATCC33277和W83菌株中分别由PGN_0904/PGN_0903和PG1432/PG1431编码。作为牙龈卟啉单胞菌中研究最为深入的TCS，其组氨酸激酶FimS和反应调节蛋白FimR最早由Hayashi等[18]在转位子诱导的菌毛缺陷变异株中发现。FimS和FimR的基因位于不同的操纵子，预示着他们可能与其他HK或RR存在着交叉调控作用，以增加其对复杂的环境变化的适应性。Lo等[19]研究发现，抑制基因fimS的表达导致牙龈卟啉单胞菌的10%的基因表达变化。而相比之下，Nishikawa等[20]发现fimR基因缺陷菌株仅影响7种基因的表达。这表明FimS和FimR之间不是简单的线性关系，而与其他系统或分子存在着复杂的交互作用。

Nishikawa等[21]通过比较ATCC33277菌株以及天然的菌毛缺陷株W83发现，天然菌毛缺陷株W83中的FimS 缺乏激酶结构域，因而不能结合ATP发挥磷酸化作用。所以该菌株内虽然有fimA基因，但却没有fimA转录物或FimA蛋白。在ATCC33277菌株中，FimS/FimR TCS可影响牙龈卟啉单胞菌菌毛和生物膜的形成[19]–[22]。牙龈卟啉单胞菌表面主要有2种不同的菌毛[23]–[24]。长菌毛由fimA基因编码的蛋白亚基FimA组成，短菌毛由一大小为67 kg·mol⁻¹蛋白Mfa1构成。2种菌毛均为细菌生物膜形成所必须，且都与致病性密切相关[25]。一方面，FimS/FimR TCS与FimA的功能密切相关，fimS/fimR基因表达缺陷将导致fim基因簇和FimA等蛋白表达量显著下降[18],[21]。而通过质粒转染技术向fimR基因缺陷变异株中引入fimR基因，则可恢复FimR和FimA蛋白和细菌表面菌毛的表达[26]。

Nishikawa等[20]进一步探究了其作用的分子机制后发现，活化的FimR并不是直接结合到fimA基因的启动子，而是通过结合至fim基因簇中第一个基因fimX的启动子区域发挥作用，fimX才是FimR蛋白的目标基因，其产物还可反过来进一步调节包括fimA在内的fim基因簇的基因表达。另一方面，Wu等[22]的研究显示：mfa1基因表达也与FimS/FimR TCS的调节相关，但与长菌毛的调控不同的是，FimR直接与mfa1基因的启动子结合发挥作用。

3. HaeS/HaeR

HaeS/HaeR由PGN_0752/PGN0753（ATCC33277菌株）或PG0719/PG0720（W83菌株）编码。ATCC33277菌株的PGN_0752基因存在天然的缺失突变，相应的HK和RR的表达均显著降低，导致细菌的生长相对缓慢。

Mattos-Graner等[27]通过染色质免疫沉淀芯片技术初步确定HaeS/HaeR编码的TCS参与牙龈卟啉单胞菌铁/血红素获得相关基因的调控。含铁血红素是牙龈卟啉单胞菌生存的必需营养素之一，Scott等[28]检测到HaeR可结合并调节细菌与获取含铁血红素、转运离子等生物过程相关的基因，同时发现HaeR的生物学功能受含铁血红素浓度和目标基因的影响，可在不同条件下促进或抑制相关基因的表达。

当含铁血红素浓度升高时，HaeR与PGN_0704（ihtA）、PGN_0687（htrA）和PGN_0556（hmuS）三者上游非编码区域结合促进其转录，发挥正向调控作用，而对TonB依赖的受体、ABC转运蛋白和RgpA、Kpg的表达发挥负向调控作用[28]。由此可知，当含铁血红素浓度较低时，HaeS的胞质外结构域与血红素亲和力增强，促进与细菌获取血红素相关的酶和转运蛋白的生成，而当含铁血红素充足时，两者亲和力降低，以控制HaeR活性。

4. PorX/PorY

PorX/PorY的HK是PorY（ATCC33277：PGN_2001，W83：PG0052），而RR是PorX（ATCC33277：PGN_1019，W83：PG0928）。PorX/PorY TCS可通过影响Ⅸ型分泌系统（type Ⅸ secretion system，T9SS）的功能调节牙龈素等物质的分泌。T9SS是存在于纤维杆菌-绿菌-拟杆菌超门细菌中的一种革兰阴性菌蛋白质分泌系统，在蛋白质的跨细胞外膜分泌过程中发挥着重要作用[29]。T9SS被证明可促进牙龈卟啉单胞菌中的牙龈素和肽酰基精氨酸脱亚胺酶（peptidylarginine deiminase，PAD）的释放[30]–[31]。在牙龈卟啉单胞菌ATCC33277菌株中，通过蛋白组学研究等方法，研究者共鉴定出包括porX和porY在内的11种参与牙龈素和PAD胞膜转运的por基因[31]–[34]。其中，PorX和PorY组成的双组分系统可调节其他por基因的表达。Sato等[31]通过基因芯片分析表明，相比于野生型菌株，porX和porY基因变异株细菌中20种基因表达量下降了超过40%，其中包括与牙龈素分泌相关的porT、porK、porL、porM、porN、porP和sov等T9SS相关基因。Kadowaki等[35]进一步发现，在Mn²⁺存在条件下，PorY将磷酸基团转移至PorX，活化的PorX与胞质外功能sigma因子SigP直接作用，而后SigP与编码T9SS系统组分的基因的启动子结合，调节T9SS组分基因表达过程。另外，Vincent等[36]运用凝胶电泳迁移实验等发现，PorX并未与T9SS基因启动子结合直接调节T9SS基因表达，而是与T9SS跨膜复合体组分之一的PorL蛋白的胞质内的疏水结构域结合。因而PorX对T9SS中分子的调控作用有可能是间接调控。

5. GppX

牙龈卟啉单胞菌中存在一种混合型TCS，其组胺酸激酶和反应调节结构域共同存在于由961个氨基酸组成的GppX蛋白质（PGN_1768或PG1797）中。据推测，GppX蛋白含有一个嵌入胞膜的N端感应激酶结构域和一个含有螺旋-转角-螺旋模体的C端反应调节结构域[37]。Hasegawa等[37]最早发现，GppX与牙龈卟啉单胞菌牙龈素的成熟和定位以及色素生成有关，gppX基因变异株的rgpA、rgpB和kgp基因表达虽然在转录水平上与野生型菌株相当，但牙龈素的活性却相对较低，并且多位于培养基上清液中而非胞内，另外突变株的细菌菌落也缺乏特征性的色素沉着。James等[38]发现，GppX还可通过调节luxS基因表达来影响牙龈卟啉单胞菌对氯化血红素和矿物离子的摄取以及Kpg的表达，在gppX变异株中，luxS基因的表达量是野生型菌株的2倍以上，TonB连接的血红素结合蛋白Tlr和HmuR的基因表达则分别上调3倍和下降5倍左右。通过对luxS变异株RNA进行测序，Hirano等[39]证实了luxS对包括hmuR在内的57种基因的调控作用。然后，Hirano等[40]再次通过RNA测序的方法，发现gppX变异株共有53种基因上调，37种基因下调；研究人员进一步研究了GppX对基因PGN_0151的作用发现，GppX可直接结合到与PGN_0151共同转录的基因PGN_0152的启动子上促进二者转录，且GppX-PGN_0151调节子和细菌的生物膜形成密切相关，与野生型细菌相比，gppX和PGN_0151变异株形成生物膜的能力均明显下降。

6. RprY

在脆弱拟杆菌和其他拟杆菌门菌如中间普雷沃菌和福赛斯坦纳菌中，rprY和其同源HK基因rprX相邻。但与其他细菌中不同的是，牙龈卟啉单胞菌中的RprY是一种“孤儿”RR，缺乏一般TCS中的同源HK，由PGN_1186（ATCC 33277）或者PG1089（W83）基因编码。最近Li等[41]研究发现，牙龈卟啉单胞菌为弥补RprX的缺失，通过乙酰化作用来调节RprY的活性，而乙酰化的RprY结合目标DNA的能力也因此发生变化。

Duran-Pinedo等[42]通过比较rprY变异株和野生型牙龈卟啉单胞菌的基因表达发现，RprY主要参与细菌两方面活动的调节：转运功能和氧化应激；Na⁺转运还原型辅酶Ⅰ-泛醌氧化还原酶（nicotinamide adenine dinucleotide:ubiquinone oxidoreductase，NQR）基因表达在野生型菌株中是变异株的4倍，而外排泵和氨基酸转运蛋白、过氧化物歧化酶等基因在变异株中则被激活。进一步Krishnan等[43]研究发现，rprY变异株在Na⁺缺乏的培养基中生长受到限制，同时Na⁺缺乏的环境可引起牙龈卟啉单胞菌产生较强的氧化应激，而RprY作为一种抑制分子，可通过与过氧化氢酶或热休克蛋白等分子伴侣的基因，如groES、clpB、dnaK等直接结合调节细菌氧化应激反应；该实验同时表明，RprY亦可结合至自身基因，发挥自我调节作用。关于RprY的其他研究[44]显示，RprY还可与编码NQR操纵子内第一个基因nqrA的启动子结合，参与牙龈卟啉单胞菌产能过程。并且Lewis等[45]发现，在亚硝酸盐刺激下，牙龈卟啉单胞菌的rprY基因表达也存在上调，提示RprY可能参与了牙龈卟啉单胞菌的更多生命活动。

7. 其他

ATCC33277菌株中还有2个完整的TCS系统PGN_0012/0013和PGN_0774/0775，目前鲜有研究对其进行报道，研究者[46]通过转座子高通量测序发现，PGN_0012的突变体在小鼠腹腔脓肿模型中表现出极低的适应性。对2个系统的功能基团进行搜索后发现，2组TCS都属于NtrC家族，该家族在其他革兰阴性菌中被报告与Ⅲ型分泌系统信号转导组分的调节相关[47]。目前关于该TCS的研究尚处于早期阶段，关于其调控作用仍需更多的研究来拓展。

8. 问题和展望

牙龈卟啉单胞菌在牙周炎和相关全身系统性疾病中的作用已得到公认，双组分信号转导系统在牙龈卟啉单胞菌的自身调控和致病性中扮演着极为重要的角色。目前国内外关于牙龈卟啉单胞菌的TCS的研究报道相对有限，导致学界对牙龈卟啉单胞菌的TCS的结构、功能和机制认识尚有不足。本综述可为牙龈卟啉单胞菌的相关研究提供更多思路，也能对临床预防和治疗工作有所启发。

Funding Statement

[基金项目] 国家自然科学基金面上项目（81771077）；四川省科技计划重点研发项目（2018SZ0161）

Supported by: The National Natural Science Foundation of China (81771077); Science and Technology Department of Sichuan Province (2018SZ0161).