Abstract
目的
探讨染色质解旋酶DNA结合蛋白（CHD1L）影响舌鳞状细胞癌侵袭和转移的分子机制，为临床抑制舌鳞状细胞癌的侵袭和转移提供新的靶点。
方法
运用Ualcan网站分析CHD1L在正常上皮组织和原发性头颈鳞状细胞癌组织中的表达情况，分析有无淋巴结转移对头颈鳞状细胞癌组织中CHD1L表达情况的影响；通过GEPIA网站分析CHD1L在头颈鳞状细胞癌中的表达与生存率的关系；蛋白质印迹法检测人舌鳞状细胞癌细胞CAL27和人正常皮肤细胞HaCaT中CHD1L蛋白的表达水平；用RNA干扰质粒敲低人舌鳞状细胞癌细胞CAL27中的CHD1L后，将细胞分别命名为SiCHD1L/CAL27及Scr/CAL27；蛋白质印迹法检测CHD1L在每组细胞中的表达情况；EdU增殖实验检测每组细胞增殖能力的改变；伤口愈合实验检测每组细胞迁移能力的改变；蛋白质印迹法检测上皮间质转化（EMT）标志物上皮钙黏着蛋白和波形蛋白的表达水平。
结果
Ualcan数据库显示：CHD1L在原发头颈鳞状细胞癌组织中表达高于正常上皮组织中的表达，在出现淋巴结转移的头颈鳞状细胞癌组织中表达更高。GEPIA网站分析显示：CHD1L表达量高的头颈鳞状细胞癌患者总生存率较表达量低的患者明显降低。蛋白质印迹结果显示：人舌鳞状细胞癌细胞CAL27中CHD1L表达高于人正常皮肤细胞HaCaT中CHD1L的表达，敲低CHD1L以后CAL27细胞中CHD1L的表达量明显低于Scr/CAL27组细胞。EdU增殖实验结果显示：SiCHD1L/CAL27组细胞增殖能力明显降低。伤口愈合实验显示：SiCHD1L/CAL27组迁移能力降低，SiCHD1L/CAL27组细胞上皮钙黏着蛋白表达量增加而波形蛋白表达量降低。
结论
CHD1L促进舌鳞状细胞癌细胞的EMT，促进舌鳞状细胞癌细胞的增殖、迁移侵袭能力。
Keywords: 舌鳞状细胞癌, 染色质解旋酶DNA结合蛋白, 上皮间质转化, 增殖, 侵袭
Abstract
Objective
A study was conducted to investigate the molecular mechanism of chromodomain helicase/ATPase DNA binding protein 1-like gene (CHD1L) influencing the invasion and metastasis of tongue squamous cell carcinoma and to provide a new target for clinical inhibition of invasion and metastasis of tongue squamous cell carcinoma.
Methods
Ualcan website was used to analyze the expression of CHD1L in normal epithelial tissue and primary head and neck squamous cell carcinoma and to analyze the effect of lymph node metastasis on the expression of CHD1L in tissues with head and neck squamous cell carcinoma. The relationship between CHD1L expression and the survival rate of patients with head and neck squamous cell carcinoma was tested by the GEPIA website. Western blot was used to quantify the levels of CHD1L protein in human tongue squamous cell carcinoma CAL27 and immortalized human skin keratinocyte cell HaCaT. After knocking down CAL27 in human tongue squamous cell carcinoma cells with an RNA interference plasmid, the cells were designated as SiCHD1L/CAL27 and Scr/CAL27. Western blot was utilized to detect the expression of CHD1L in each group of cells. The change in CAL27 cell proliferation ability was tested by EdU proliferation test after CHD1L knockdown. The change of cell migration ability of each group cells was tested through the wound healing assay. Western blot was used to detect epithelial-mesenchymal transition (EMT) marker E-cadherin and Vimentin protein expression levels.
Results
Ualcan database showed that the expression of CHD1L in primary head and neck squamous cell carcinoma tissues was higher than in normal epithelial tissues and in head and neck squamous cell carcinoma tissues with lymph node metastasis. GEPIA website analysis showed that the overall survival rate of patients with head and neck squamous cell carcinoma with high expression of CHD1L was significantly lower than that of patients with low expression. Western blot results showed that CHD1L expression in human tongue squamous carcinoma cells CAL27 was higher than that of human normal skin cells HaCaT. CHD1L expression in SiCHD1L/CAL27 cells was much lower than that in Scr/CAL27 cells. Results of EdU proliferation experiments showed the significant reduction in the cell proliferation ability of the SiCHD1L/CAL27 cells. Results of the wound healing experiments showed the reduction in the migration capacity of the SiCHD1L/CAL27 cells. The expression of E-cadherin increased, whereas that of Vimentin decreased, in SiCHD1L/CAL27 cells.
Conclusion
CHD1L promoted the EMT, proliferation, migration, and invasion ability of tongue squamous cell carcinoma cells.
Keywords: tongue squamous cell carcinoma, chromodomain helicase/ATPase DNA gene, epithelial-mesenchymal transition, proliferation, invasion
舌鳞状细胞癌是口腔鳞状细胞癌最常见的类型[1]，其发展速度较快，相较于其他类型口腔鳞状细胞癌更具有侵袭性[2]，舌鳞状细胞癌可引起语言功能障碍、妨碍咀嚼、吞咽困难等口腔症状[3]。而且舌部血运丰富，活动频繁，这些特殊的解剖结构使得癌症转移率高于其他类型的口腔鳞状细胞癌[4]。
据报道[5]，早期患者预后良好，但是如果发生隐匿性转移，患者死于疾病的风险将增加5倍，5年生存率由85.5%下降至48.5%。Wang等[6]的研究表明，口腔鳞状细胞癌的复发率为32.7%，只有31.8%的复发患者可以存活5年，而在没有复发的患者中，79.9%可以存活5年。因此明确舌鳞状细胞癌的侵袭转移机制，可为临床上抑制舌鳞状细胞癌的侵袭转移提供新的靶点和实验依据。
肝癌细胞中分离出来的染色质解旋酶DNA结合蛋白（chromodomain helicase/ATPase DNA binding protein 1-like gene，CHD1L），属于氟化亚锡2家族的亚家族[7]。该家族蛋白主要参与细胞核活动，调节转录，维持染色体完整性和DNA修复[8]。CHD1L在肝癌、食管鳞状细胞癌和小细胞肺癌中表达异常，并且与肿瘤进展和预后具有显著相关性[9]–[11]。本课题组前期实验[12]证明，CHD1L在乳腺癌发生发展中具有促进作用，但是CHD1L在舌鳞状细胞癌的表达及作用机制尚未明确阐述，因此本研究旨在探索CHD1L在舌鳞状细胞癌侵袭和转移的作用，有望为临床抑制舌鳞状细胞癌侵袭转移提供新的思路。
1. 材料和方法
1.1. 材料
Lipofectamine 2000脂质体转染试剂、BeyoClick™EdU细胞增殖试剂盒（上海市碧云天生物技术有限公司）；β肌动蛋白单克隆抗体、兔抗人CHD1L、上皮钙黏着蛋白和波形蛋白单克隆抗体（Abcam公司，英国）；人正常皮肤细胞HaCaT由潍坊医学院医学研究实验中心保存，人舌鳞状细胞癌CAL27细胞由上海市口腔颌面部肿瘤组织样本及生物信息数据库专业技术服务平台赠送。
1.2. 方法
1.2.1. 运用数据库检索CHD1L在头颈鳞状细胞癌中的表达和与头颈鳞状细胞癌患者预后的关系
舌鳞状细胞癌是头颈鳞状细胞癌主要亚型之一[13]，因数据库未对头颈鳞状细胞癌详细分组，因此拟通过检索CHD1L在头颈鳞状细胞癌的表达来评估CHD1L在舌鳞状细胞癌的表达。Ualcan数据库数据源于TCGA数据库，是一个包括31种癌症、数千个肿瘤样本的基因数据。以“CHD1L”和“Head and Neck squamous cell carcinoma（HNSC）”为关键词在Ualcan数据库（http://ualcan.path.uab.edu/analysis.html）检索CHD1L在HNSC组织和正常组织的表达以及按淋巴结转移数量分组后各组中的相对表达情况。通过GEPIA数据库（http://gepia.cancer-pku.cn/index.html）中检索头颈鳞状细胞癌患者CHD1L的表达与患者生存的关系。
1.2.2. 细胞培养
人舌鳞状细胞癌细胞CAL27和人正常皮肤细胞HaCaT用含10%胎牛血清的高糖型Dulbecco改良的Eagle培养基（Dulbecco's modified eagle medium，DMEM），于37 °C、5%CO2培养箱中培养。CHD1L质粒转染方法参照文献[14]，将CHD1L敲除质粒和敲除对照质粒分别转染进入人舌鳞状细胞癌细胞CAL27。将转染后细胞命名如下：1）SiCHD1L/CAL27组：转入CHD1L敲除质粒；2）Scr/CAL27组：转入CHD1L敲除对照质粒。
1.2.3. 蛋白质印迹检测
为检测人正常皮肤细胞HaCaT、人舌鳞状细胞癌细胞CAL27以及Scr/CAL-27组细胞和SiCHD1L/CAL27组细胞中CHD1L的表达情况，使用裂解液将各组细胞裂解，提取总蛋白。上样，进行十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE），随后参照蛋白标记切取蛋白β肌动蛋白、CHD1L、上皮钙黏着蛋白和波形蛋白对应的条带，转移至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上。封闭，清洗，敷对应的一抗，4 °C过夜。再次清洗后敷二抗，曝光。一抗抗体配制比例分别为CHD1L（1∶1 000）；上皮钙黏着蛋白（1∶1 000）；波形蛋白（1∶1 000）；β肌动蛋白（1∶1 000）。
1.2.4. EdU增殖实验
为了分析CHD1L对舌鳞癌细胞CAL27增殖能力的影响，使用带有Alexa Fluor 594的BeyoClick™EdU细胞增殖试剂盒进行EdU染色。首先用磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffered saline，PBS）轻轻冲洗细胞，然后加入新鲜的常规培养基，再加10 µL EdU工作液与培养液混匀。将细胞在37 °C、5% CO2下孵育2 h。温育后，再次用PBS清洗细胞以除去培养基和游离的EdU探针。然后室温下于4%多聚甲醛中固定15 min，PBS清洗3次。室温下用含0.3% Triton X-100的PBS孵育15 min。PBS清洗1~2次，加入200 µL的点击反应缓冲液、CuSO4、Azide 594和点击反应添加剂溶解液的混合物，孵育30 min，同时避光保存。PBS清洗玻片，30 °C避光条件下Hoechst 33342染色10 min，吸出染色剂，PBS再次洗涤后，激光共聚焦显微镜拍照。每组实验重复3次。
1.2.5. 伤口愈合实验
为检测CHD1L对人舌鳞癌细胞CAL27迁移能力的影响，实验将Scr/CAL27和SiCHD1L/CAL27细胞悬液分别接种至六孔板中，并在完全培养基中生长至80%左右，用10 µL的枪头沿直尺在六孔板中央划条直线，PBS洗涤几次，含1%胎牛血清的培养液继续培养。在光学显微镜下拍摄照片，记录愈合过程。
1.3. 统计学分析
所有实验数据均用SPSS 20.0统计学软件进行处理，各组样本间采用独立样本t检验，认为P<0.05差异具有统计学意义。
2. 结果
2.1. 数据库检测结果
通过Ualcan网站分析TCGA数据库中CHD1L在头颈鳞状细胞癌组织和正常上皮组织的差异表达情况，结果与正常上皮组织相比，CHD1L在头颈鳞状细胞癌组织中表达升高（P<0.000 1，图1A），且淋巴结转移数量>9个的头颈鳞状细胞癌患者的CHD1L的表达量高于淋巴结转移数量≤3个的患者（P<0.05，图1B），结果表明：CHD1L在头颈鳞状细胞癌中起着癌基因的作用，并且与淋巴结转移有关。GEPIA数据库的分析结果表明：高表达组的总生存率明显低于低CHD1L表达组（P=0.017，图1C）。由此可见，CHD1L在头颈鳞状细胞癌发生发展中起着重要作用而且与患者预后相关。
图 1. CHD1L在头颈鳞状细胞癌组织中的表达及与患者生存分析.
Fig 1 Expression of CHD1L in squamous cell carcinoma of the head and neck and its survival analysis
A：Ualcan数据库中CHD1L在正常上皮组织和头颈鳞状细胞癌组织中的表达情况；B：Ualcan数据库中CHD1L在不同淋巴结转移数量的头颈鳞状细胞癌组织中的表达情况；C：GEPIA数据库中CHD1L的表达与头颈鳞状细胞癌患者生存情况的分析图。
2.2. 蛋白质印迹检测CHD1L的表达结果
蛋白质印迹检测结果显示：人舌鳞状细胞癌细胞CAL27中CHD1L的表达量明显比在人正常皮肤细胞HaCaT中的表达量高（P<0.05，图2左），CHD1L在SiCHD1L/CAL27组细胞中的表达明显低于Scr/CAL27组细胞中的表达（P<0.05，图2右）。
图 2. CHD1L在各组细胞中的表达.
Fig 2 Expression of CHD1L in indicated cells
左：CHD1L在人舌鳞状细胞癌细胞CAL27和人正常皮肤细胞HaCaT中的表达情况；右：CHD1L在Scr/CAL27细胞和SiCHD1L/CAL27细胞中的表达情况；上：蛋白质印迹检测图像；下：CHD1L蛋白的相对表达量。*P<0.05。
2.3. EdU增殖实验结果
在激光共聚焦显微镜观察下，EdU阳性细胞表现为红色，Hoechst 33342染色细胞核呈蓝色。EdU增殖实验检测的结果显示：SiCHD1L/CAL27组EdU阳性的细胞百分比明显低于Scr/CAL27组，这表明在CHD1L敲除后，舌鳞状细胞癌CAL27细胞的增殖能力明显受到了一定的抑制（P<0.05，
图3）。
图 3. CHD1L对Scr/CAL27和SiCHD1L/CAL27增殖能力的影响.
Fig 3 Effect of CHD1L on the proliferation ability of Scr/CAL27 and SiCHD1L/CAL27 cells
左：Scr/CAL27细胞和SiCHD1L/CAL27细胞的共聚焦显微镜图像；右：Scr/CAL27细胞和SiCHD1L/CAL27细胞的增殖情况。*P<0.05。
2.4. 伤口愈合实验结果
通过对比同一视野下0 h和24 h的细胞照片发现，CHD1L低表达使人舌鳞状细胞癌细胞CAL27的迁移能力明显减弱（P<0.05，图4），这提示，CHD1L在人舌鳞状细胞癌细胞CAL27的迁移中发挥了促癌作用。
图 4. CHD1L对Scr/CAL27和SiCHD1L/CAL27迁移能力的影响.
Fig 4 Effect of CHD1L on the migration ability of Scr/CAL27 and SiCHD1L/CAL27 cells
左：Scr/CAL27细胞和SiCHD1L/CAL27细胞的伤口愈合实验图像；右：Scr/CAL27细胞和SiCHD1L/CAL27细胞的相对迁移率。*P<0.05。
2.5. 蛋白质印迹检测EMT相关蛋白的表达结果
蛋白质印迹检测结果显示：SiCHD1L/CAL27细胞的上皮钙黏着蛋白表达量明显高于Scr/CAL27细胞，而波形蛋白表达量低于Scr/CAL27细胞（P<0.05，图5）。这表明，CHD1L通过促进人舌鳞状细胞癌细胞CAL27的EMT进而使肿瘤细胞获得侵袭性。
图 5. EMT相关蛋白在Scr/CAL27和SiCHD1L/CAL27的表达情况.
Fig 5 Expression of EMT related proteins in Scr/CAL27 and SiCHD1L/CAL27 cells
左：上皮钙黏着蛋白和波形蛋白的蛋白质印迹图像；右：上皮钙黏着蛋白和波形蛋白的相对表达量。*P<0.05。
3. 讨论
舌鳞状细胞癌是口腔颌面部高发肿瘤之一，约50%左右患者可以生存5年，但是TNM-Ⅳ期患者仅15%的患者可生存5年[15]。据报道[16]–[17]，侵袭性及高转移是肿瘤致死的主要原因，所以明确舌鳞状细胞癌的侵袭和转移机制有助于临床舌鳞状细胞癌的诊治。本课题组前期研究发现，CHD1L对乳腺癌进展具有明显促进作用，为了解CHD1L对舌鳞状细胞癌发生发展的影响，本实验首先通过生物信息学技术，明确了CHD1L在头颈鳞状细胞癌的表达情况及其对患者预后的影响。通过分析TCGA数据库信息发现，CHD1L在头颈鳞状细胞癌中的表达比在正常上皮组织内高，且CHD1L的表达与淋巴结转移有关，该结果表明CHD1L可能对头颈鳞状细胞癌的侵袭转移有促进作用。通过分析GEPIA数据信息显示，CHD1L的高表达可引起患者不良预后。
为了解CHD1L在人舌鳞状细胞癌细胞CAL27中的表达情况，进一步进行了蛋白质印迹实验，发现CHD1L在人舌鳞状细胞癌细胞CAL27中表达比在人正常皮肤细胞HaCaT中表达量高，这与生物信息学结果的趋势相符。为进一步了解CHD1L对人舌鳞状细胞癌细胞CAL27侵袭转移的影响，实验运用常规的RNA干扰方法，敲除了人舌鳞状细胞癌细胞CAL27中CHD1L的表达，检测了CHD1L对人舌鳞状细胞癌细胞CAL27增殖和迁移能力的影响，结果显示CHD1L表达降低后，人舌鳞状细胞癌细胞CAL27的增殖能力和迁移能力明显降低，这表明CHD1L可以增加舌鳞状细胞癌细胞的增殖和迁移能力。
EMT使细胞之间失去细胞接触，进而获得迁移能力，控制癌症的侵袭和转移[18]。Lyons等[19]通过将不同荧光标记的EMT细胞和非EMT细胞混合，进行小鼠皮下注射，发现原发肿瘤的侵袭特点仅与源自EMT细胞的肿瘤侵袭性一致，且EMT细胞协助了非EMT细胞侵入血管。波形蛋白、锌指转录因子2和上皮钙黏着蛋白等蛋白既是EMT激活因子又是EMT特征性标志物，常通过检测这些标志物的变化来反映EMT过程[16]。有研究[20]证实，相较于癌前病变和正常上皮来说，皮肤鳞状细胞癌细胞膜上的上皮钙黏着蛋白表达量明显上调。此外还有研究[21]显示，波形蛋白和β-连环蛋白等蛋白在转移性皮肤鳞状细胞癌内表达上调，而上皮钙黏着蛋白下调。Wang等[22]发现，舌鳞状细胞癌中存在EMT，并且对舌鳞状细胞癌细胞的侵袭转移具有促进作用。CHD1L最早被发现于肝癌细胞，与肿瘤的进展和患者预后具有明显相关性[23]–[24]。本课题组前期实验[12]表明，微小RNA-504靶向调控CHD1L的表达，进而能够抑制乳腺癌细胞的侵袭。Chen等[23]通过动物实验则发现，CHD1L通过增加细胞运动并通过鸟嘌呤核苷酸交换因子基因介导的Cdc42，激活诱导丝状伪足形成和EMT，来促进肿瘤细胞的迁移、侵袭和转移，并且他们还在人肝癌组织侵袭性前端发现了CHD1L表达量的增加。本实验结果显示，敲低CHD1L表达后，人舌鳞状细胞癌细胞CAL27的EMT相关蛋白上皮钙黏着蛋白表达量增高和波形蛋白表达量降低，这表明CHD1L可以促进舌鳞状细胞癌细胞的EMT。
综上所述，本研究结果表明CHD1L在舌鳞状细胞癌细胞中特异性高表达，并且能够促进舌鳞状细胞癌细胞EMT，进而提高肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力。因此，CHD1L在影响舌鳞状细胞癌侵袭转移方面起着重要的促进作用。此研究有望为临床抑制舌鳞状细胞癌的增殖、侵袭转移提供新的思路。
Funding Statement
[基金项目] 国家自然科学基金青年科学基金（81702932）
Supported by: Youth Program of National Natural Science Foundation of China (81702932).
Footnotes
利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。
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