抗菌肽GH12对龋相关三菌种生物膜形貌及菌种构成的影响

Abstract

Objective

To evaluate the effects of antimicrobial peptide GH12 designed de novo on the structure, morphology, and composition of a cariogenic three-species biofilm.

Methods

The cariogenic three-species biofilm consisted of the cariogenic Streptococcus mutans (S. mutans) and commensal bacteria Streptococcus sanguinis (S. sanguinis) and Streptococcus gordonii (S. gordonii). The biofilm was treated using GH12 (2, 4, and 8 mg·L⁻¹), and untreated biofilm was used as the control. Changes in the morphology and structure of the three-species biofilm were evaluated through crystal violet staining, scanning electron microscopy (SEM), and fluorescent in situ hybridization (FISH). Moreover, S. mutans in the biofilm was selectively cultured, and its colony-forming units were counted.

Results

The biomass and density of the cariogenic three-species biofilm treated with GH12 decreased compared with those of the control. The number of S. mutans decreased gradually and eventually became undetectable, whereas the number of S. gordonii and S. sanguinis increased and became predominant in the biofilm.

Conclusion

GH12 can reduce the number of S. mutans within the cariogenic three-species biofilm, destroys its integrity, and consequently makes the biofilm easy to remove.

龋病是在牙菌斑、宿主、食物、时间等四联因素影响下，牙体硬组织发生的慢性进行性破坏的疾病。牙菌斑是三维结构的细菌群落，包括微生物、多糖、蛋白质和DNA[1]，构成牙菌斑的微生物包括致龋菌和共生菌，其群落内部有着复杂的共生和竞争关系。其中变异链球菌（Streptococcus mutans，S. mutans）是公认的主要致龋菌之一，其毒力因子包括产酸性、耐酸性以及维持生物膜结构稳定的能力[2]。血链球菌（Streptococcus sanguinis，S. sanguinis）和格氏链球菌（Streptococcus gordonii，S. gordonii）因产碱和产生H₂O₂等原因拮抗S. mutans[3]，一般与龋发生率降低密切相关[4]–[5]。因此，抑制牙菌斑内S. mutans的生长，减少S. mutans生物量和占比，破坏生物膜的结构与形貌的完整性是降低其致龋性的有效途径。

抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs）拥有快速杀菌作用和多种杀菌机制，能够有效地抑制浮游菌生长和生物膜形成，并且已经有研究[6]证实其与口腔健康密切相关。目前，已经有大量关于天然或合成AMPs对致龋菌效果的研究[7]–[9]。本课题组在前期自主设计并且成功合成了一种抗菌肽GH12，已经证实GH12无明显细胞毒性，在唾液中能够保持良好的稳定性，且具有优越的抗菌性能[10]–[11]，抑制S. mutans的多种毒力因子，减少胞外多糖（extracellular polysaccharides，EPS）合成，抑制生物膜形成[12]，还能清除已形成的S. mutans生物膜[10]。

然而，这些研究仅仅关注了GH12对S. mutans的浮游菌和单菌种生物膜的作用，尚需要进一步研究GH12能否对多菌种生物膜内部的S. mutans发挥杀伤作用，并由此改变生物膜的形貌及菌种构成，使得生物膜向更易清除的方向转化。综上，本研究拟通过结晶紫染色、扫描电镜（scanning electron microscopy，SEM）和荧光原位杂交（fluorescent in situ hybridization，FISH）的方法探究GH12能否改变龋相关三菌种生物膜的形貌及菌种构成，并通过选择性计数法探究GH12能否降低S. mutans的比例。

1. 材料和方法

1.1. 多肽合成和试剂

多肽GH12的序列为谷氨酸-亮氨酸-亮氨酸-色氨酸-组氨酸-亮氨酸-亮氨酸-组氨酸-组氨酸-亮氨酸-亮氨酸-组氨酸。GH12由吉尔生化有限公司（中国）进行合成、鉴别并纯化至98%，溶解于无菌去离子水中，冷冻于−20 °C。除特别说明外，所有试剂均购自美国Sigma-Aldrich公司。

1.2. 细菌与生物膜培养

S. mutans ATCC 700610，S. gordonii ATCC 35105以及S. sanguinis JCM 5708由四川大学口腔疾病研究国家重点实验室提供。在培养生物膜前，挑取具有典型形态的单菌落接种于脑心浸液（brain-heart infusion broth，BHI）培养基中，在37 °C厌氧环境（85%N₂，10%H₂和5%CO₂）下增菌24 h。

龋相关三菌种生物膜模型的建立方法如前所述[13]。3种细菌悬浊液1∶1∶1加入BHIS（含1%蔗糖的BHI）培养基中，构成混合菌液备用。将1 mL混合菌液与不同浓度梯度的GH12溶液加入24孔板内，调整细菌终浓度均为1×10⁶ CFU·mL⁻¹，GH12终浓度分别为2、4、8 mg·L⁻¹，对照组不含GH12。将24孔板置于37 °C厌氧环境下培养24 h及48 h。每24 h更换一次培养基。

1.3. 生物膜形成抑制实验

将1 mL混合菌液与不同浓度梯度的GH12溶液加入24孔板内，24 h及48 h后，吸去上清，PBS缓冲液漂洗去除浮游菌，甲醇固定15 min，0.1%结晶紫染色5 min，去除多余染料后，使用无水乙醇重溶结晶紫，测595 nm处的光密度（optical density，OD）值[10]。

1.4. SEM观察

PBS缓冲液洗涤生物膜，2.5%戊二醛固定2 h，乙醇梯度脱水（35%、50%、75%、90%、100%，各30 min）[14]。临界点干燥，喷金镀膜，在SEM下观察生物膜。

1.5. FISH

FISH荧光探针见表1[13],[15]。将培养24 h和48 h生物膜的玻片置于4%多聚甲醛中过夜，无菌水漂洗后在46 °C下干燥。加入0.5 mL含有30 mg·mL⁻¹溶菌酶的裂解缓冲液（50 mmol·L⁻¹乙二胺四乙酸，100 mmol·L⁻¹ Tris-HCl，pH 8.0）。37 °C孵育20 min后，漂洗样本，依次用50%、80%和100%浓度的乙醇连续脱水3 min。在46 °C下干燥10 min后，样本在50 µL、pH 8.0的含有2 nmol·L⁻¹特异探针的杂交缓冲液（20 mmol·L⁻¹ Tris-HCl，0.9 mol·L⁻¹ NaCl，20%甲酰胺，0.01%十二烷基硫酸钠）中46 °C下避光孵育90 min。48 °C下用pH 8.0的预热洗涤缓冲液（20 mmol·L⁻¹ Tris-HCl，5 mmol·L⁻¹乙二胺四乙酸，215 mmol·L⁻¹ NaCl，0.01%十二烷基硫酸钠）将样本润洗15 min，再用无核酸酶水漂洗。激光共聚焦扫描显微镜（confocal laser scanning microscope，CLSM）采用× 100油镜对生物膜进行观察。

表 1. FISH特异性荧光探针.

Tab 1 Specific fluorescent probes used in FISH

探针	序列（5′-3′）
S. mutans	Alexa Fluor 488-5′-ACTCCAGACTTTCCTGAC-3′
S. sanguinis	Alexa Fluor 594-5′-GCATACTAGGTTAAGCCACAGCC-3′
S. gordonii	DEA-5′-ACTGTGCGTTCTACTTGC-3′

1.6. S. mutans的选择性计数

PBS润洗后，用1 mL PBS缓冲液收集入生物膜EP管中，超声振荡分散均匀，10倍梯度稀释后，分别接种至BHI琼脂平板及轻型唾液链球菌-杆菌肽琼脂（mitis salivarius with bacitracin agar，MSB）平板内。37 °C厌氧培养48 h后，进行菌落计数及菌落形成单位（colony-forming units，CFU）计算。根据CFU计数计算出MSB平板上生长的菌落数与BHI平板上菌落数的比值，即为S. mutans在龋相关三菌种生物膜中的比例。

1.7. 统计学分析

采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，采用单因素方差分析（ANOVA）和Tukey HSD试验比较组间差异。显著性水平α为0.05。

2. 结果

2.1. 结晶紫染色结果

结晶紫染色结果见图1。GH12处理后24 h，生物膜OD值明显降低，说明生物膜形成量下降。48 h生物膜在GH12处理后，OD值同样呈下降趋势，但需要更高浓度GH12（4、8 mg·L⁻¹）处理，形成量才有明显变化。

图 1. GH12处理后龋相关三菌种生物膜的结晶紫染色结果.

Fig 1 Crystal violet staining of cariogenic three-species biofilm treated by GH12

左：24 h；右：48 h。*P<0.05。

2.2. SEM观察结果

SEM观察显示，对照组24 h生物膜层次多，密度高，结构紧凑；经不同浓度GH12处理后的生物膜立体形貌崩解，密度逐渐变低，结构越发松散；8 mg·L⁻¹ GH12处理后不能形成生物膜。48 h生物膜结构和形貌变化趋势与24 h生物膜基本相同，但变化更加明显（图2）。

图 2. GH12处理后龋相关三菌种生物膜SEM图像.

Fig 2 SEM images of cariogenic three-species biofilm after GH12 treatment

第1行：SEM × 5 000；第2行：SEM × 20 000；第3行：SEM × 5 000；第4行：SEM × 20 000。

2.3. FISH

为进一步观察GH12对龋相关三菌种生物膜形貌及菌种构成的影响，采用FISH对其进行了研究。如图3、4所示，与24 h生物膜相比，48 h生物膜的生物量更多，密度更高，结构更紧凑。与对照组相比，经4 mg·L⁻¹和8 mg·L⁻¹ GH12处理的生物膜失去了典型的三维立体结构，并且密度更小，更加疏松。在菌种构成的定性分析方面，随着GH12浓度的增加，在24 h生物膜中，S. mutans的数量逐渐减少，而S. sanguinis和S. gordonii却保持着相当的生物量。当GH12浓度为8 mg·L⁻¹时，生物膜中的S. mutans几乎被完全消除，S. sanguinis含量也有所降低，S. gordonii成为主要菌种构成（图3）。在48 h生物膜中，S. mutans数量同样呈下降趋势，其余两种细菌比例也逐渐上升。由此可知，龋相关三菌种生物膜的菌种构成发生了变化，GH12对S. mutans有明显选择抑制作用，继而S. sanguinis和S. gordonii逐渐占据主导地位（图4）。

图 3. GH12处理24 h后龋相关三菌种生物膜FISH图像 CLSM × 100.

Fig 3 FISH images of 24 h cariogenic three-species biofilm after GH12 treatment CLSM × 100

图 4. GH12处理48 h后龋相关三菌种生物膜FISH图像 CLSM × 100.

Fig 4 FISH images of 48 h cariogenic three-species biofilm after GH12 treatment CLSM × 100

2.4. CFU计数

S. mutans的选择性计数可以定量比较S. mutans所占比例的变化。随着培养时间的延长，对照组生物膜中S. mutans的占比也略有下降，不同浓度的GH12可不同程度地降低S. mutans的占比（表2）。经GH12处理，24 h生物膜中的S. mutans生物量和占比都随着GH12的浓度增加显著减少；经8 mg·L⁻¹ GH12处理后，S. mutans无法检出。48 h生物膜表现出相同的变化趋势，只是变化程度更剧烈。

表 2. 龋相关三菌种生物膜内S. mutans活菌计数及S. mutans活菌占比.

Tab 2 CFU count and proportion of live S. mutans in cariogenic three-species biofilm

分组	24 h		48 h
	S. mutans计数/(×105 CFU·mL−1)	S. mutans占比/%	S. mutans计数/(×105 CFU·mL−1)	S. mutans占比/%
对照组	120.93±5.51a1	15.49±1.66a2	80.69±3.68a3	13.69±1.47a4
2 mg·L−1 GH12	36.44±1.66b1	6.08±0.65b2	20.68±0.94b3	4.21±0.45b4
4 mg·L−1 GH12	3.07±0.14c1	0.53±0.06c2	2.08±0.09c3	0.44±0.05c4
8 mg·L−1 GH12	未检出	-	未检出	-

注：不同字母表示差异有统计学意义（P<0.05）。

n = 6, x±s

3. 讨论

随着对致龋菌和共生菌之间动态平衡了解的逐渐深入，调节牙菌斑的形成，抑制致龋菌的生长是生态防龋策略的要求之一[16]。S. mutans产生的EPS为细菌提供了吸附位点，并作为支撑细菌空间分布的基质[17]，有助于细菌的黏附以及生物膜的形成与结构完整性。完整的生物膜为产酸耐酸细菌提供了安全的避难所，确保持续的局部酸性生产，使pH降低进而导致牙面脱矿[18]。因此破坏生物膜的完整性可降低生物膜的致龋能力。

本研究中，结晶紫染色提示GH12处理后龋相关三菌种生物膜形成量下降，完整性明显降低。48 h生物膜虽然形成量高于24 h，但同样呈下降趋势。然而随着培养时间延长，2 mg·L⁻¹ GH12处理后的48 h生物膜与对照组差异无统计学意义，前期实验发现2 mg·L⁻¹ GH12仅能抑制部分S. mutans毒力因子和相关基因与该现象有关[12]。

生物膜形貌和结构的变化来源于其菌种构成的变化。FISH和S. mutans选择性计数的结果均显示GH12处理后的龋相关三菌种生物膜中S. mutans占比明显降低。GH12对S. mutans有显著抑制作用，但对S. sanguinis和S. gordonii的抑菌作用较弱，后者细菌数量和比例保持了相当高的水平。因此，GH12可通过选择性抑制生物膜中S. mutans的生长，进而改变其菌种构成，降低其致龋性。值得注意的是，8 mg·L⁻¹ GH12处理后，生物膜中的S. gordonii占绝对的种群优势。前期研究发现S. sanguinis对GH12的敏感性高于S. gordonii[10]，而且S. gordonii在定植位点的种间竞争中占有优势，甚至可轻微抑制S. sanguinis[19]。因此，在S. mutans被GH12全面抑制或清除的微生态中，S. gordonii的竞争力比S. sanguinis更强，故占据了种群优势。

本研究采用培养法计算生物膜中S. mutans的占比，其基础是改良MSB培养基的选择性培养特性。改良MSB培养基是一种分离S. mutans最佳的选择性培养基，能抑制远缘链球菌的生长，S. mutans在该培养基上形成有鉴别意义的深蓝色“霜玻璃”样菌落[20]。培养法仅计数活菌数量，因此可以比较真实地反映生物膜中存活的S. mutans。然而FISH观察发现48 h三菌种生物膜绿色染色更致密。FISH利用荧光寡核酸探针，靶向结合细菌的16s rRNA[21]，死活菌均可被探针标记，因此反映的是生物膜中各菌的总生物量。随着培养时间延长，胞外基质会累积，死活菌的代谢更久，因此48 h生物膜染色实验的总量均会高于24 h。实时定量聚合酶链反应（real-time quantitative polymerase chain reaction，qPCR）也可估算生物膜中S. mutans的含量，这种方法需要首先提取细菌的DNA作为模板，使用qPCR获得各种模板扩增至特定荧光值所需的循环数（Ct值），再通过Ct值与CFU的标准曲线获得各菌种的数目[22]。与FISH类似，qPCR由于无差别提取生物膜中存在的所有DNA，包括死亡细菌的DNA，所以在描述生物膜中存活的S. mutans的比例上可能存在一定偏差。

综上所述，本研究证实了抗菌肽GH12能改变龋相关三菌种生物膜的结构和形貌，并有效降低生物膜中S. mutans的占比，调控生物膜的种群关系。但还需要对GH12对天然牙菌斑的调控和防龋效果等进行进一步的研究，为GH12投入临床防龋提供更丰富的实验依据。

Funding Statement

[基金项目] 国家自然科学基金面上项目（81771062）；四川省青年科技创新研究团队项目（2020JDTD0014）

Supported by: The National Natural Science Foundation (81771062); Sichuan Province Youth Science and Technology Innovation Research Team Project (2020JDTD0014).