仿生策略用于口腔颌面部骨再生与牙种植的研究进展

Abstract

Oromaxillofacial hard tissue defects is still a difficult problem in clinical treatment. Regeneration of oromaxillofacial hard tissue based on tissue engineering technology has a good clinical application prospect. The functional modification of scaffolds is one of key factors that influence the outcome of tissue regeneration. The biomimetic design of biomaterials through simulating the natural structure and composition of oromaxillofacial hard tissue has gradually become a research hotspot due to its advantages of simplicity and efficiency. In this article, the biomimetic modification of biomaterials for oromaxillofacial hard tissue regeneration is reviewed, expecting to provide a new idea for the treatment of oromaxillofacial hard tissue defect.

肿瘤术后、外伤、牙周病、先天畸形是导致口腔颌面部缺损的主要原因[1]，严重影响人的身心健康。如何有效保存和功能性修复口腔颌面部骨和牙等硬组织一直是临床治疗的重点和难题。近年来，再生医学及先进制造技术的发展使组织工程技术取得了长足的进步，基于组织工程技术的颌面部硬组织的再生治疗具有良好的临床应用前景。目前已有大量研究着眼于生物材料和干细胞投递方式的功能化改性以提高骨组织再生的速度及质量，其中，通过模拟生物的天然结构及成分进行仿生设计的策略通常简洁而高效，逐渐成为研究热点[2]。为有效行使承重、咀嚼、保护等重要功能，骨与牙进化出了独特的组织结构，其基质成分也与其他器官迥异，具有高度矿化的特征。研究者通过模拟硬组织的微纳结构、组成成分等对修复材料进行改性，在治疗颌骨缺损、种植区骨量不足、牙槽骨吸收等领域取得了较大进展[3]。本文围绕仿生策略用于口腔颌面部骨再生与牙种植的基础与临床研究，分别从仿硬组织微纳结构改性、仿硬组织离子成分改性和仿生细胞膜片等三个方面的研究进展进行综述，以期为硬组织缺损和缺失的治疗提供新思路。

1. 仿硬组织微纳结构改性用于牙种植的研究进展

仿生微纳结构改性指模拟天然组织的微米级或纳米级结构，为细胞提供类似天然组织的微环境，具有一定的尺寸和表面效应，促进组织再生修复。口腔硬组织，以骨组织为例，具有独特的微纳结构，微米尺度上骨组织由致密的皮质骨和疏松多孔的松质骨组成，纳米尺度上则是由胶原纤维多级矿化形成。利用天然骨组织结构特点指导种植体表面从宏观到微观多尺度仿生设计，从而模拟体内骨组织发育物理信号诱导干细胞或前成骨细胞的成骨分化，有望提高种植体周围骨再生及种植体骨结合效果。常见骨组织微米结构特征包括粗糙表面、取向排列、沟槽结构等[4]，主要是源于骨组织非均一矿化的细胞外基质、胶原纤维的取向排列以及破骨细胞在骨组织表面形成的吸收坑。纳米尺度上，骨组织细胞外基质中胶原纤维表面散落着片状或者棒状的羟磷灰石纳米晶体，片状纳米晶体宽15~30 nm，长30~50 nm，釉质中的棒状纳米晶体厚25~100 nm，长100 nm到数微米之间[5]。模拟天然羟磷灰石纳米晶体，合成尺寸和形状可控的纳米晶体，被认为是生物复合材料生物矿化和发挥成骨诱导功能的重要先决条件。尽管目前微纳结构诱导细胞成骨分化机制尚不明晰，但通过模拟天然骨组织微结构仍实现了较好的骨再生修复效果。

仿骨组织粗糙表面设计简单、操作方便，目前临床上最常采用的是喷砂、酸蚀技术。通过对种植体表面进行处理，形成喷砂凹陷和酸蚀坑等微米结构，来模拟骨组织表面凹凸不平的粗糙结构，可有效改善口腔种植体骨结合效果。如Khang等[6]进行的早期多中心临床研究，对97例患者植入了432枚纯钛种植体（247枚双酸蚀处理，185枚机加工处理），在3年时间内36枚种植体（12枚双酸蚀处理，24枚机加工处理）失败，双酸蚀处理组的种植体-骨整合成功率达95%，显著高于机加工处理的87%。

多级微纳形貌构建通过综合使用碱热处理、等离子喷涂等技术，可在微米孔洞结构上进一步修饰出纳米棒、纳米花等结构，从而形成纳米—微米多级复合结构。相较于仿骨组织粗糙表面设计形成的单一微米级结构，多级微纳结构更接近于天然骨表面，显示出更加优异的成骨诱导性能，如Zhang等[7]通过等离子喷涂技术，在钛种植体表面制备了具有多级复合结构的掺锶锌黄长石涂层，相较于微米级的羟磷灰石涂层对照组，微纳复合结构显著增强了种植体表面的细胞黏附及体内的骨结合效果。骨质疏松等疾病是导致种植体骨结合不良的重要因素，而对种植体进行表面改性，特别是构建多级微纳形貌可有效提升骨结合效果，如Liu等[8]在骨质疏松绵羊上进行的研究证明，经过酸蚀、磁控溅射综合处理构建的微纳复合形貌提升干细胞附着、矿化的能力要显著强于单一微米或纳米形貌，而体内实验进一步证明了微纳复合形貌组具有最强的骨结合强度，这提示，对于患有骨质疏松等疾病的患者，采用多级形貌构建来进行种植体功能化改性可望获得更好的治疗效果。

2. 仿硬组织离子成分改性用于口腔硬组织再生的研究进展

微纳尺度上模拟组织天然结构改性支架的仿生策略可有效促进硬组织再生，在此基础上进一步分析组织的构成元素，模拟硬组织基质成分对支架进行改性，在局部构建有利于细胞增殖分化的微环境的仿生策略亦是组织工程领域的热点。骨与牙作为高度矿化的组织，含有包括钙（Ca）、镁（Mg）、锶（Sr）、锌（Zn）、氟（F）在内的多种生物活性离子[9]–[10]。研究发现，这些生物活性离子不仅是维持硬组织结构必不可少的成分，还参与骨再生中多个环节的调控，包括细胞成骨向分化、血管新生以及免疫调节。生物活性离子的这些生物学效应展现出良好的骨再生应用潜能，且价格低廉，为支架材料改性提供了更多的手段[11]。

诱导种子细胞与宿主细胞成骨、成牙向分化是口腔硬组织再生的关键。Sr、Mg、Zn、钴（Co）、铜（Cu）、硅（Si）等离子皆被报道具有促进骨再生的效应[12]–[15]，此外Sr、Mg还可具有成牙诱导功能[16]–[17]。如Mg在体外可浓度依赖性地促干细胞成骨分化[18]，而Zhang等[19]进一步在体内探究了Mg诱导成骨的机制，研究发现，镁合金降解产生的Mg可促进背根神经节释放神经降钙素基因相关多肽（calcitonin gene-related polypeptide，CGRP），CGRP与骨膜干细胞结合后可诱导干细胞成骨向分化。Lin等[20]则从发育角度给出了Mg促进成骨的可能机制，该研究发现镁转运蛋白-1（magnesium transporter 1，MagT1）在小鼠胚胎软骨内成骨过程中高表达，从而以MagT1为桥梁将Mg与骨发育联系在一起，并以MagT1的表达为指导优选了Mg模拟骨发育微环境的最适浓度，构建了含Mg干细胞3D培养系统，在体内取得了显著的血管化骨再生效果。以生物活性离子的成骨诱导能力为基础，复合功能化基团修饰材料，有望赋予骨再生支架新功能。如Wang等[21]通过在成骨性能优良的生物活性玻璃（bioactive glass，BG）表面固定含二硫化钼（MoS₂）的聚乳酸-羟基乙酸共聚物[poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA]功能性薄膜，制备出抗肿瘤/骨修复一体化修复材料。PLGA膜内释放的MoS₂具有良好的光热抗肿瘤效应，而BG释放出的Si、Ca等活性离子可发挥成骨诱导效应。在肿瘤切除后植入该支架，可在进行骨修复的同时通过外界激光强度来控制局部温度，灼烧剩余或复发的癌细胞，达到抗肿瘤与骨修复的协同一体化治疗。

成血管过程与成骨过程相耦合，如何诱导支架快速血管化是决定再生效果的重要因素。Mg、Cu、Sr、Co等离子具有一定的诱导血管生成能力[22]–[23]，如Sr可刺激干细胞分泌成血管诱导因子血小板衍生生长因子（platelet derived growth factor，PDGF）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等募集内皮细胞来促进血管化[24]，Mg可促进内皮细胞增殖、分泌一氧化氮，促进干细胞分泌VEGF加速血管化进程[11]。值得注意的是，上述离子还具有骨诱导效应，在支架中添加这些离子有利于协同成骨与成血管效应，达到血管化骨再生的目的。如Tang等[25]利用Mg在体内降解产生氢气这一特性，将Mg粉作为致孔剂，整合入水凝胶中构建了体内原位致孔体系。产气形成的孔隙有利血管与组织的长入，同时局部降解产生的Mg构建了成骨及成血管诱导微环境，综合提高再生效果。

支架植入体内后，由于手术创伤、支架生物相容性、局部感染等因素将诱导宿主的免疫反应，进而影响局部的再生效果，如牙周炎将显著影响牙种植治疗的成功率，因此改性支架材料，使其能调节宿主免疫细胞功能，对维持稳定的成骨微环境具有重要意义。Si、Mg、Zn、Sr等离子皆被证明具有免疫调节效应，如Mg可通过抑制Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）通路来降低促炎因子的释放，Sr可拮抗转录因子核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）的促炎效应，Zn可通过调节TLR-4通路促进抗炎因子白细胞介素（interleukin，IL）-10的分泌，减少炎症因子IL-1β、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α的产生。将生物活性离子作为涂层修饰种植体表面[26]，或接枝到胶原纤维上[27]，在取得骨诱导效应的同时，还能调控免疫细胞，如巨噬细胞的极化，平衡促炎-抑炎反应，取得更为明显的骨再生效果。但离子的免疫调节效应多存在剂量依赖性，如何优化离子负载和释放的浓度以使效应最大化是应用中的难题[28]。

使用离子成分改性的策略来提升种植体骨结合的临床转化研究亦取得新进展。学者们[29]–[30]开展了种植体早期负重性能的多中心前瞻性研究，研究共纳入了45例年龄在20~75岁的患者，种植一期手术后6~8周即完成上部修复，并早期负重；1年的随访发现，经过氟离子联合微纳结构改性后，种植体成功率达到100%，且早期边缘骨水平不降反增，平均增长（0.08±0.41）mm；负重3年后，种植体成功率仍为100%，边缘骨水平平均增长（0.23±0.48）mm，这对于提高种植体的成功率和延长咀嚼功能负载作用时间意义重大。

3. 仿生细胞膜片用于口腔硬组织再生的研究进展

除了对组织结构/成分进行仿生改性支架，还可对细胞外基质环境进行模拟。细胞外基质是天然的细胞三维培养模型，构建出仿细胞外基质成分的支架对干细胞进行投递，有利于维持细胞特性，提高细胞投递效率。细胞膜片技术是通过物理的方法将扩增融合的细胞从培养皿底壁分离，获得膜片状细胞结构的一种技术[31]–[33]。运用该技术收集到的细胞保留了体外培养过程中分泌的胞外基质、细胞-基质连接以及细胞间连接等结构[32],[34]–[35]，无须缝合就能较紧密地附着于其他细胞膜片、器官组织、生物材料表面，且靶细胞被外基质固定很少流失，因此有利于细胞投递。目前细胞膜片这一仿生结构已广泛应用于包括关节软骨、角膜、食管、心脏、牙周组织等各种组织器官修复研究中。

在口腔硬组织再生方面，Yang等[36]将人牙囊细胞膜片与经过处理的牙本质支架复合，构建牙根样组织，并发现细胞膜片在牙本质引导下形成牙髓和牙周样结构。Tsumanuma等[37]将β-磷酸三钙/胶原材料分别与牙周膜细胞膜片、骨髓间充质干细胞膜片和牙骨膜细胞复合后用于牙周再生修复。Vaquette等[38]将牙周膜细胞膜片与支架复合，发现其新生骨与周围骨组织整合良好。Zhou等[39]报道将骨髓间充质干细胞膜片包裹块状磷酸三钙/聚己酸内酯复合材料，植入裸鼠背部皮下后，形成了具有一定抗压强度的新生骨。更进一步地，Shan等[40]利用经过成骨诱导的狗骨髓间充质干细胞膜片复合聚乳酸-羟基乙酸支架，修复犬下颌骨局部缺损，取得了理想的效果。细胞膜片技术的临床转化方面也有新的突破。近期，Xuan等[41]进行了干细胞用于牙髓再生的临床研究，研究共纳入了40例牙外伤患者，其中30例患者被随机分配至试验组，将接受干细胞移植，而对照组患者将接受传统的根尖诱导成形术；试验组患者的脱落乳牙牙髓干细胞被提取后，在体外培养形成细胞聚合体，并植入了外伤牙髓腔中；随访1年后发现，试验组患牙根管内完成功能性牙髓再生，牙根增长和根尖孔闭合情况皆优于对照组。

为了更好地在体外构建组织、器官，Ito等[42]–[44]利用磁操作可“远程控制”的主要优点，用磁性纳米颗粒对细胞进行标记后，可以通过施加外部磁场来操纵细胞和控制细胞功能，使细胞可受磁场作用沉积，形成细胞膜片，目前已应用于皮肤、肝脏和肌肉组织工程中组织样结构的制备。为了提高细胞膜片在组织再生应用中的效率，Zhang等[45]制备了一种新型氧化石墨烯包裹的四氧化三铁磁性纳米颗粒，利用这一颗粒氧化石墨烯外壳结合蛋白质的特性，提出了一种全新的生长因子复合细胞膜片概念，通过制备的新型磁性纳米颗粒，首次实现了体外生长因子与干细胞复合微组织的磁场精确控制构建，该策略明显提高了传统细胞膜片技术在体内的组织再生效果，为复杂组织例如骨-软骨复合体缺损的再生提供了新的思路。

虽然利用仿生策略提升骨再生与牙种植治疗效果的研究成果不断，但仍面临诸多挑战：目前对口腔硬组织，特别是骨组织的微纳结构已有较为全面的认识，但结构的仿生设计仍停留于单纯的形貌模仿，对其分子调控机制尚缺乏深入了解；使用离子成分改性支架时，如何优选离子浓度以达到最佳的再生效果，此外离子成分对硬组织发育和代谢的调控机制仍然不明；仿生组织构建时，如何解决构建的大块组织的血供以防止细胞坏死凋亡等。随着组织工程与再生医学的发展，上述挑战在不远的将来有望解决，借助3D打印等先进制造技术，更多的仿生功能材料将进入转化用于临床，为口腔硬组织缺损的再生治疗提供新的选择和可能。

专家简介

蒋欣泉，主任医师、教授、博士生导师。现为上海交通大学口腔医学院执行院长、口腔医学系主任，上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔修复科主任，上海口腔医学先进技术与材料工程技术研究中心主任。系国家杰出青年基金获得者，国家自然科学基金创新群体项目负责人，“十三五”国家重点研发计划首席科学家，享国务院特殊津贴。上海交通大学特聘教授，澳大利亚悉尼大学（工程与信息技术学院）名誉教授。目前担任国际口腔修复学会副主席，国际牙医师学院院士，国务院学位委员会第八届学科评议组成员，中华口腔医学会第五届理事会理事、口腔修复学专业委员会副主任委员、口腔生物医学专业委员会副主任委员、口腔医学科研管理专业委员会候任主任委员，中国生物材料学会理事、骨修复材料与器械分会口腔及颅颌面生物材料及应用专业委员会主任委员，中国生物医学工程学会组织工程与再生医学分会候任主任委员。

Funding Statement

[基金项目] 国家自然科学基金创新研究群体（81921002）；国家重点研发计划（2016YFC1102900）；国家自然科学基金重点国际（地区）合作研究项目（81620108006）

Supported by: Innovation Research Group of National Natural Science Foundation of China (81921002); The National Key Research and Development Program of China (2016YFC1102900); Key International (Regional) Cooperative Research Projects of National Natural Science Foundation of China (81620108006).