亲环蛋白A在口腔鳞状细胞癌组织中的表达及对细胞增殖和侵袭的影响

Abstract

Objective

To investigate the expression of cyclophilin A (CyPA) in oral squamous cell carcinoma (OSCC) and explore the effect of downregulating the expression of CyPA gene on the proliferation and invasion of SCC-25 cells.

Methods

A total of 77 cases of patients with OSCC were selected. The expression levels of CyPA proteins in OSCC and adjacent normal tissues were evaluated. SCC-25 cells were cultured and divided into the CyPA interference sequence group, negative control group, and blank group. The expression levels of CyPA mRNA and protein in cells were detected by using real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction and Western blot, respectively. Cell proliferation was detected by using methyl thiazolyl tetrazolium and plate colony formation assays. Cell invasion was detected by using Transwell assay.

Results

The positive expression rate of CyPA protein in OSCC tissues was 76.62%, which was higher than that in adjacent tissues (P<0.05). The positive expression rate of CyPA protein in TNM stage T₃+T₄, clinical stage Ⅲ+Ⅳ, moderately or poorly differentiated lymph node metastasis was increased (P<0.05). Compared with the negative control and blank groups, the CyPA interference sequence group had decreased relative expression levels of CyPA mRNA and protein (P<0.05); optical density va-lues of cells at 24, 48, 72, and 96 h (P<0.05); and number of cell colonies and invasive cells (P<0.05).

Conclusion

The CyPA protein is highly expressed in OSCC tissues, and the downregulation of CyPA gene expression in SCC-25 cells can reduce cell proliferation and inhibit cell invasion.

口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）作为头颈部常见的恶性肿瘤，病因多样、机制复杂，近年来发病率呈升高趋势[1]。虽然现有的临床治疗手段不断进步，但患者预后依然改善有限，5年总体生存率维持在50%[2]。研究[3]指出，早期淋巴结转移和复发是影响患者预后的主要因素。因此，深入研究影响OSCC转移及复发的相关机制或敏感基因，对指导患者诊疗及改善预后有重要价值。亲环蛋白A（cyclophilin A，CyPA）作为亲环素蛋白家族成员，与细胞装配、折叠、运输及免疫炎症调节等密切相关[4]，其可能发挥癌基因的作用而参与肿瘤发生，与肿瘤细胞转录、凋亡及侵袭转移等密切相关[5]。本研究分析了OSCC组织中CyPA蛋白表达，探讨其与临床指标的相关性，以及与OSCC细胞增殖和侵袭的关系。

1. 材料和方法

1.1. 临床资料

选取湖北省中西医结合医院口腔科2015年2月—2018年2月接受手术治疗且临床资料完整的OSCC患者77例，均为原发病例且术前未行放化疗，术后病理学检查证实为OSCC。其中，男性46例，女性31例，年龄34~76岁，平均年龄（57.6±11.3）岁。按照第七版美国癌症联合委员会和国际抗癌联盟TNM分期标准：T₁期19例，T₂期23例，T₃期21例，T₄期14例；临床分期：Ⅰ期17例，Ⅱ期15例，Ⅲ期27例，Ⅳ期18例；分化程度：中低分化42例，高分化35例；发生淋巴结转移36例。本研究通过医院伦理委员会批准，所有患者均知情同意。

1.2. 主要试剂和设备

免疫组化试剂盒及配套试剂（上海碧云天生物技术有限公司），兔抗人CyPA多克隆抗体（Abcam公司，美国），SCC-25细胞系（ATCC公司，美国），胰蛋白酶、胎牛血清和DMEM培养液（Gibco公司，美国），总RNA提取试剂（Trizol法）、Lipofectamine 2000转染试剂（Invitrogen公司，美国），逆转录和聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增试剂（大连宝生物工程有限公司），甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）液、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（Sigma公司，美国），Transwell小室（Corning公司，美国），实时荧光定量PCR仪（Roche公司，瑞士），凝胶电泳分析系统（Bio-Rad公司，美国）。CyPA干扰序列及阴性对照序列由上海吉玛制药技术有限公司设计合成，CyPA和内参引物由上海生工生物公司设计合成。

1.3. 方法

1.3.1. 免疫组化法检测OSCC和癌旁组织中CyPA蛋白表达

采用免疫组化SP法，取OSCC和癌旁组织石蜡标本，连续切片（厚度为4 µm），二甲苯脱蜡至水，PBS冲洗3次，加入3%过氧化氢反应15 min，PBS冲洗，置于枸缘酸钠缓冲液中高压高温行抗原修复，PBS冲洗3次，加入一抗兔抗人CyPA多克隆抗体（稀释比例1∶800），4 °C过夜孵育，PBS冲洗3次，加入二抗，室温下培养120 min，PBS冲洗3次，DAB显色，苏木精复染，脱水、透明、封片、观察。高倍镜下观察，随机取5个高倍视野，CyPA蛋白主要表达于细胞浆，根据染色强度和阳性细胞比例判定结果[6]，具体如下。1）染色强度：不着色、淡黄色、棕黄色和黄褐色分别赋予0、1、2和3分；2）阳性细胞比例：阳性细胞比例<5%、5%~25%、26%~50%、51%~75%、>75%分别赋予0、1、2、3和4分；3）将染色强度和阳性细胞比例得分相加，<1分为阴性（-），≥1分为阳性（+）。

1.3.2. 细胞培养及分组

用含10%胎牛血清的DMEM培养液培养SCC-25细胞，培养条件：37 °C、5%CO₂、饱和湿度。待细胞丰度达80%以上时，胰酶消化，传代。按Lipofectamine 2000转染试剂说明对对数生长期细胞进行分组转染。1）CyPA干扰序列组：转染CyPA小分子RNA干扰（siRNA）序列5′-GATCCGTGGTGACTTCACACGCCATAATTCAAGAGATTATGGCGTGTGAAGTCACCATTTTTTC-3′；2）阴性对照组：转染阴性对照序列5′-AAGAGAAAAAGCGAAGAGCCA-3′；3）空白组：仅加入无血清培养液。

1.3.3. 实时荧光定量PCR技术检测细胞中CyPA mRNA表达

转染后，各组培养48 h，加入胰酶及细胞裂解液，Trizol法提取总RNA，检测总RNA纯度，按逆转录试剂盒说明完成逆转录，使用实时荧光定量PCR仪对引物体系扩增，CyPA上游引物序列：5′-CCACCGTGTTCTTCGACATCACG-3′，下游引物序列：5′-GCTCCTCTTGCCATTCCTGA-CCC-3′；磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH）上游引物序列：5′-CGTCTTCACCACCATGGAGAAGGC-3′；下游引物序列：5′-AAGGCCATGCCAGTGAGCTTCCC-3′。PCR条件：94 °C 2 min，94 °C 30 s，57 °C 30 s，72 °C 30 s，连续循环38次，每个样品设6个复孔。采用2^−ΔΔCt法获得各组细胞中CyPA mRNA相对表达量[7]。

1.3.4. Western blot法检测细胞中CyPA蛋白表达

转染后，各组培养48 h，加入胰酶及细胞裂解液，提取总蛋白，按照BCA试剂盒说明检测蛋白浓度。取50 µg总蛋白行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gele-lectrophoresis，SDS-PAGE），电转至聚偏氟乙烯膜，脱脂奶粉封闭120 min，然后将一抗按1∶1 000稀释后加入，4 °C过夜孵育，加入二抗，室温反应60 min，加入发光试剂，以GAPDH为内参获得CyPA蛋白相对表达量。

1.3.5. 细胞增殖实验

1）MTT法：用胰酶对各转染组细胞消化，接种于96孔板，密度为每孔2×10⁴个，继续培养。分别于24、48、72和96 h时，向各孔加入MTT液20 µL，培养5 h，加入DMSO 200 µL，振荡均匀，置酶标仪于490 nm波长处检测其光密度（optical density，OD）值，用以反映细胞增殖能力[8]。2）平板集落形成实验：取各组转染培养24 h细胞，胰酶消化，离心重悬，接种于6孔板，密度为每孔1×10³个，尽量让细胞在板底分布均匀，培养箱中培养，出现克隆斑时，弃培养液，PBS冲洗1次，甲醛固定，结晶紫染色，晾干、拍照。

1.3.6. 细胞侵袭实验

用无血清DMEM培养液稀释Matrigel基质胶，将稀释液包被Transwell小室上室。用胰酶对各组转染后48 h细胞消化，离心，使用无血清培养液重悬（每毫升1×10⁶个），取200 µL细胞悬液，置于小室上室，将含10%胎牛血清的培养液600 µL加入下室，恒温培养24 h，取小室，弃培养液，PBS冲洗3次，多聚甲醛固定，1%结晶紫染色，用棉签将散落细胞轻轻除去，高倍镜下观察细胞穿膜情况。重复实验3次[9]–[10]。

1.4. 统计学方法

采用SPSS 21.0软件对实验结果进行分析，计数资料采用率值表示，两组资料间比较使用χ²检验，多组间比较采用单因素方差分析和LSD-t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2. 结果

2.1. CyPA蛋白在OSCC和癌旁组织中表达

CyPA蛋白在OSCC组织中阳性表达率为76.62%（59/77），癌旁组织中为29.87%（23/77），差异有统计学意义（χ²=33.805，P=0.000）（图1）。

图 1. OSCC和癌旁组织中CyPA蛋白的表达 免疫组化染色.

Fig 1 The expressions of CyPA protein in OSCC and adjacent tissues immunohistochemical staining

A：癌旁组织 × 100；B：癌旁组织 × 200；C：OSCC组织 × 100；D：OSCC组织 × 200。

2.2. CyPA蛋白在OSCC不同临床指标间表达差异

CyPA蛋白在不同性别和年龄间的表达差异无统计学意义（P>0.05），CyPA蛋白在T₃+T₄期、Ⅲ+Ⅳ期、中低分化和发生淋巴结转移组织中的阳性表达率升高，差异有统计学意义（P<0.05）

（表1）。

表 1. CyPA蛋白在OSCC不同临床指标间表达差异.

Tab 1 The differences of the expressions of CyPA protein among different clinical indicators of OSCC

指标		n	CyPA蛋白表达/n（%）		χ2值	P值
			阳性	阴性
性别	男性	46	36（78.26）	10（21.74）	0.171	0.679
	女性	31	23（74.19）	8（25.81）
年龄/岁	≥60	37	27（72.97）	10（27.03）	0.530	0.467
	<60	40	32（80.00）	8（20.00）
TNM分期	T1+T2期	42	28（66.67）	14（33.33）	5.114	0.024
	T3+T4期	35	31（88.57）	4（11.43）
临床分期	Ⅰ+Ⅱ期	32	19（59.38）	13（40.63）	9.095	0.003
	Ⅲ+Ⅳ期	45	40（88.89）	5（11.11）
分化程度	中低分化	42	38（90.48）	4（9.52）	9.899	0.002
	高分化	35	21（60.00）	14（40.00）
淋巴结转移	是	36	33（91.67）	3（8.33）	7.424	0.006
	否	41	27（65.85）	14（34.15）

2.3. 3组细胞中CyPA mRNA和蛋白表达

CyPA干扰序列组、阴性对照组和空白组细胞中CyPA mRNA相对表达量分别为0.21±0.10、1.03±0.07和1.02±0.04，差异有统计学意义（F=254.394，P<0.001）。阴性对照组和空白组细胞中CyPA mRNA相对表达量差异无统计学意义（P=0.754），CyPA干扰序列组细胞中CyPA mRNA相对表达量低于其他两组（P<0.05）（图2）。

图 2. 实时荧光定量PCR检测3组细胞中CyPA基因表达.

Fig 2 Real-time fluorescence quantitative PCR was used to detect the expressions of CyPA gene of cells in three groups

CyPA干扰序列组、阴性对照组和空白组细胞中CyPA蛋白相对表达量分别为0.38±0.09、0.76±0.08和0.86±0.11，差异有统计学意义（F=42.286，P<0.001）。阴性对照组和空白组细胞中CyPA蛋白相对表达量差异无统计学意义（P=0.079），CyPA干扰序列组细胞中CyPA蛋白相对表达量低于阴性对照组和空白组（P<0.05）（图3）。

图 3. Western blot法检测3组细胞中CyPA蛋白表达.

Fig 3 Western blot was used to detect the expressions of CyPA protein of cells in three groups

2.4. 3组细胞增殖能力

MTT实验结果显示，CyPA干扰序列组24、48、72和96 h细胞OD值低于阴性对照组和空白组（P<0.05），阴性对照组和空白组24、48、72和96 h细胞OD值差异无统计学意义（P=0.582、0.660、0.598、0.226），具体见表2。平板集落形成实验结果显示，CyPA干扰序列组、阴性对照组和空白组细胞集落数分别为（66.38±4.00）、（174.44±5.82）和（170.30±7.03）个，差异有统计学意义（F=679.742，P<0.001），CyPA干扰序列组细胞集落数低于阴性对照组和空白组，差异有统计学意义（P<0.05），阴性对照组和空白组细胞集落数差异无统计学意义（P=0.232）（图4）。

表 2. 3组细胞不同时点增殖能力比较.

Tab 2 Comparison on the proliferation ability of cells in the three groups at different time points

组别	24 h	48 h	72 h	96 h
CyPA干扰序列组	0.29±0.04ab	0.35±0.07ab	0.47±0.10ab	0.64±0.04ab
阴性对照组	0.42±0.06	0.59±0.05	0.69±0.03	0.87±0.06
空白组	0.40±0.07	0.60±0.03	0.72±0.07	0.83±0.07
F值	9.583	44.327	23.771	29.780
P值	0.002	<0.001	<0.001	<0.001

注：与空白组比较，^aP<0.05；与阴性对照组比较，^bP<0.05。

图 4. 平板集落形成实验检测3组细胞增殖能力.

Fig 4 Plate colony formation test was used to detect the proliferation ability of cells in three groups

左：CyPA干扰序列组；中：阴性对照组；右：空白组。

2.5. 3组细胞侵袭能力

Transwell实验结果显示，CyPA干扰序列组、阴性对照组和空白组侵袭细胞数分别为（81.14±8.81）、（117.61±5.57）和（122.59±6.27）个，差异有统计学意义（F=62.337，P=0.000），侵袭细胞数在阴性对照组和空白组差异无统计学意义（P=0.238），CyPA干扰序列组侵袭细胞数低于阴性对照组和空白组（P<0.05）（图5）。

图 5. Transwell实验检测3组细胞侵袭能力 结晶紫 × 200.

Fig 5 Transwell test was used to detect the invasion ability of cells in 3 groups crystal violet × 200

左：CyPA干扰序列组；中：阴性对照组；右：空白组。

3. 讨论

近年来，OSCC发病率呈升高趋势，由于口腔颌面部机械运动频繁、血流丰富、淋巴结引流广泛，易于肿瘤扩散转移[11]，OSCC患者早期便可出现转移，已成为影响患者预后的重要危险因素[12]。研究[13]表明，OSCC转移和侵袭是一个涉及众多基因激活或失活、多步骤、多阶段的演化过程。CyPA是存在于各类细胞中的亲环素蛋白家族成员[14]，其可能发挥促癌基因功能而参与了多种肿瘤发生进展过程[15]。有研究[16]指出，CyPA促进了非小细胞肺癌转移。与早期胃癌细胞增殖及移植瘤生长有关[17]。亦有研究[18]指出，CyPA在口腔黏膜下纤维化表达上调，可能是潜在生物标志物和治疗靶标。但CyPA在OSCC组织中表达如何，鲜有报道。本研究中CyPA蛋白在OSCC组织中呈高表达，可能发挥癌基因功能促进了OSCC发生。同时，结果显示，TNM分期T₃+T₄期、临床分期Ⅲ+Ⅳ期、中低分化和发生淋巴结转移组织中CyPA蛋白阳性表达率升高，进一步说明CyPA蛋白可能参与了OSCC进展及恶性化过程。

本研究中CyPA干扰序列组细胞中CyPA mRNA和蛋白相对表达量明显降低，提示SCC-25细胞中CyPA mRNA表达被成功抑制。有研究[19]指出，CyPA对细胞周期具有调控作用，可通过调控细胞周期而参与细胞增殖及凋亡。本研究结果显示，CyPA干扰序列组24、48、72和96 h细胞OD值低于阴性对照组和空白组，且细胞集落数减少，这些结果说明抑制SCC-25细胞中CyPA mRNA表达水平，可有效抑制细胞增殖能力，提示CyPA可能参与了SCC-25细胞增殖过程。有研究[20]指出，CyPA表达上可促进癌细胞迁移。本研究中CyPA干扰序列组侵袭细胞数低于阴性对照组和空白组，说明下调SCC-25细胞中CyPA mRNA表达水平，可抑制细胞侵袭能力，提示CyPA基因可能参与了SCC-25细胞侵袭过程。

综上所述，CyPA蛋白在OSCC组织中呈高表达，与肿瘤发生和进展密切相关，下调SCC-25细胞中CyPA基因表达，可抑制细胞增殖和侵袭能力，为开展机制研究及基因靶向治疗提供新的方向。

Funding Statement

[基金项目] 中央高校基本科研业务费项目（2042018kf0145）

Supported by: Central University Basic Research Business Test Project (2042018kf0145).