Abstract
目的
以中药组份甘草酸为载体，按照阿霉素与甘草酸的不同比例制备阿霉素-甘草酸分子复合物（ADR-GL复合物），探究其在pH=7.4下的溶解度差异并初步评价其抗肿瘤效果。
方法
按照阿霉素与甘草酸摩尔比2∶1，1∶1，1∶2的量（ADR∶GL= 2∶1，1∶ 1，1∶ 2）投料，采用旋蒸法制备ADR-GL分子复合物并经红外光谱（FT-IR）和差式扫描量热（DSC）分析鉴定所得固体复合物。将ADR-GL复合物溶解于pH=7.4的磷酸盐缓冲液中，过夜超声后3000 r/min离心5 min得ADR-GL复合物饱和溶液，采用高效液相色谱法测定其中的阿霉素溶解度。最后，MTT法测定ADR-GL对肝癌细胞HepG2的增殖抑制作用，及经流式细胞仪测定CD44+ MDA-MB-231干细胞所占总MDA-MB-231细胞的比例以初步探究其抗肿瘤活性。
结果
ADR-GL复合物中阿霉素1525 cm-1红外光谱吸收峰消失，且DSC分析显示ADR-GL在86 ℃处出现一个明显的新的吸收峰，表明阿霉素可能被甘草酸所包裹而以新的形式存在，称之为“ADR-GL分子复合物”。对照组盐酸阿霉素组在pH=7.4的磷酸盐缓冲液中溶解度为0.844±0.011 mmol/L，ADR-GL复合物组与对照组相比溶解度均有显著性差异（P < 0.05），其中阿霉素与甘草酸摩尔比为1∶ 2组溶解度最高，为5.562±0.049 mmol/L，是对照组的6.3倍。此外，与阿霉素对照组相比，ADR-GL分子复合物组对HepG2细胞活力的直接影响及对MDA-MB-231肿瘤干细胞群比负作用二者无显著差异。
结论
ADR-GL不降低阿霉素抗肿瘤活性，其可能是一种潜在的安全的具有开发价值的新颖递药系统。
Keywords: 阿霉素, 甘草酸, 分子复合物, 抗肿瘤活性
Abstract
Objective
To prepare an adriamycin-glycyrrhizin molecular complex (ADR-GL complex) using glycyrrhizin (GL, a component in traditional Chinese drug) as the carrier and assess the solubility and anti-tumor activity of the complex.
Methods
Dried solid products of ADR-GL complex with different molar ratios of ADR and GL (2∶1, 1∶1, and 1∶2) were prepared by rotary steaming and characterized using FT-IR and DSC. The products were dissolved in pH7.4 phosphate buffer, sonicated overnight, and centrifuged to obtain saturated ADR-GL complex solution, and ADR solubility was determined using high-performance liquid chromatography (HPLC). The cytotoxicity of ADR and ADR-GL complex was evaluated in HepG2 cells by assessing the cell viability using MTT assay. Breast cancer MDA-MB-231 cells were treated with ADR-GL complex and the proportion of CD44+ cells in the total cells was measured by flow cytometry to evaluate the anti- tumor activity of the complex.
Results
FT-IR spectrum of solid ADR-GL complex did not show the absorption peak of adriamycin at 1525 cm-1, and an intense absorption peak of ADR-GL occurred at 86 ℃ in DSC, indicating that ADR molecules were encapsulated by GL, the giving rise to the new form of ADR-GL molecular complex. The solubility of ADR in pH7.4 phosphate buffer in the control group was 0.844±0.011 mmol/L, significantly different from that in ADR-GL complex group (P < 0.05). The ADR-GL complex with an ADR to GL ratio of 1∶2 showed the highest ADR solubility (5.562±0.049 mmol/L), which was 6.3 times that of the control sample. The ADR-GL complex and ADR showed similar inhibitory effects on HepG2 cells and the negative stemness population of MDA-MB-231 stem cells.
Conclusion
The ADR-GL complex does not reduce the antitumor activity of ADR and may serve potentially as a safe and novel drug delivery system.
Keywords: adriamycin, glycyrrhizin, molecular complex, anti-tumor activity
阿霉素是临床上常见的抗肿瘤药物之一，在体内有广泛的非选择性分布特点。因此，化疗不良反应明显，毒性较大[1-3]。甘草在中药方剂中使用相当普遍，通常作为佐药和使药，起着调和诸药的作用，也常与有毒中药配伍使用，减轻有毒中药的器官损伤、改善毒性损伤指标以及减少毒性药物不良反应等[4-7]。其中，甘草酸是中药甘草的主要活性成分之一，其结构特征上有活性-COOH基团，可能在中药煎煮过程中与其他药物发生反应或者生成新的化合物，由此猜想其是否容易与带NH4+的阿霉素之间通过非共价键结合形成分子复合物？
另一方面，甘草酸自身又是一种表面活性剂，能够提高药物的溶解度[8-11]，基于甘草酸的结构和功能特性，我们构建了ADR-GL分子复合物，并对之进行初步表征和抗肿瘤效果评价。
1. 材料和方法
1.1. 仪器与试药
岛津高效液相色谱仪（岛津LC-20A系列，日本岛津）；离心机（Eppendorf）；红外光谱仪（FT-IR）（Vertex 70，Bruker）；差示量热扫描仪（DSC214 polyma，NETZSCH）；EYELA直立型N-1100 V型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；SHZ-D循环水式真空泵（郑州华特仪器设备有限公司）；5804R Eppendorf冷冻离心机（Eppendorf）；流式细胞仪（BD）。
甘草酸（纯度>98%，北京百灵威科技有限公司）；盐酸阿霉素（纯度>98%，大连美仑生物技术有限公司）；盐酸阿霉素标准品（Adriamycin hydrochloride，国家药品标准物质，中国食品药品检定研究院）；甘草酸标准品（Glycyrrhizic Acid，北京百灵威科技有限公司）；甲醇、乙腈（色谱级，Merck）；水为超纯水；氢氧化钠、三乙胺、磷酸等均为国产分析纯。
1.2. 实验细胞株
HepG2细胞（目录号SCSP-510）购自中科院上海细胞库；MDA-MB-231乳腺癌细胞于广东省中医院大学城院区王胜奇研究员处获得。
1.3. ADR-GL分子复合物的制备
固定阿霉素物质的量为0.2 moL，按照阿霉素与甘草酸的摩尔比（ADR：GL=2∶ 1，1∶ 1，1∶ 2时，其对应GL的量分别为0.1 moL，0.2 moL，0.4 moL）分别称取阿霉素与甘草酸于相应的锥形瓶中。阿霉素中加入6 mL 66.7%乙醇充分溶解，再滴入适量0.1 mol/L NaOH（1.7~ 1.8 mL，万不可过量）脱盐，乙醇终浓度约为50%；甘草酸中则加入50%乙醇，搅拌使之充分溶解；将脱盐后的阿霉素在高速搅拌下逐滴缓慢滴加到甘草酸50%乙醇水溶液中，滴加结束后继续搅拌1~2 h；转移溶液至旋蒸瓶中，用旋蒸蒸发仪蒸干溶剂，得干燥ADR-GL固体复合物，刮下，加入5 mL pH=7.4的磷酸盐缓冲液于超声下尽量使之溶解，最后于3000 r/min离心5 min，取上清即得ADR-GL分子复合物溶液。
1.4. pH 7.4磷酸盐缓冲液的制备
采用磷酸氢二钠（Na2HPO4）和柠檬酸（C6H8O7）配制磷酸盐缓冲液，加入的具体用量参考表 1。
1.
不同pH磷酸盐缓冲液的配制
Preparation of different pH phosphate buffers
| pH | 0.2 mol/L Na2HPO4(mL) | 0.1 mol/L C6H8O7(mL) |
| 2 | 0.40 | 10.60 |
| 4 | 7.71 | 12.29 |
| 6 | 12.63 | 7.37 |
| 7.4 | 19.45 | 0.55 |
1.5. ADR-GL分子复合物的表征
1.5.1. 红外光谱法
将阿霉素、甘草酸、ADR+GL物理混合物、及ADR：GL=2∶ 1，1∶ 1，1∶ 2分子复合物干燥样品在FT-IR中压片，在4000~500 cm-1波数范围扫描测定红外光谱[12]，并对不同样品的红外光谱图进行分析比较。
1.5.2. 差示扫描量热法
将阿霉素、甘草酸、ADR+GL物理混合物、及ADR：GL=2∶1分子复合物干燥样品密封并放置于铝盘中，填充氮气，形成真空条件。利用差示扫描量热仪进行示差扫描量热记录，设定以10 ℃/min的速度将温度从20 ℃上升到300 ℃。
1.6. 阿霉素的溶解度测定
1.6.1. 色谱条件
色谱柱：反相Ecosil C18柱（5 μm，4.6 mm×150 mm）；流动相：乙腈-磷酸三乙胺缓冲液（25∶75，v/v），（pH 2.5）；检测波长：254 nm；柱温：40 ℃；流速：1.0 mL·min-1；进样量：20 μL；检测器：紫外检测器（SPD-20A）；分析时间：12 min。
1.6.2. 标准曲线
精密称量阿霉素标准品5 mg用甲醇溶解并定容至10 mL，得到500 μg/mL的阿霉素标准溶液母液，置4 ℃冰箱避光储存备用。
精密吸取一定量的阿霉素标准品母液，分别用甲醇稀释至浓度为2.5、10、40、160、200、320 μg/mL。经离心机14 000 r/min离心15 min后取上清，进样量20 μL，按“1.6.1”色谱条件测定。以药物浓度（μg/mL）x为横坐标，峰面积y为纵坐标回归分析，得到的方程为y=60 994x- 22 995；R2=1。表明阿霉素在2.5 μg/mL~320 μg/mL浓度范围内，线性良好（图 1）。
1.
阿霉素的标准曲线
Standard curve of Adriamycin.
1.6.3. 精密度测定
精密吸取阿霉素标准品母液，分别用甲醇稀释，配制浓度为10、40、160 μg/mL的3个浓度水平的标准品溶液，于1 d内每个浓度分别测定3次，计算日内精密度；同法分别测定3 d，计算日间精密度[13]（表 2）。
2.
阿霉素的日内、日间精密度
Intra-day and intra-day precision of adriamycin (n=3)
| ADR Con.c. (μg/mL) | Intra-run | Inter-run | |||
| Mean±SD | RSD (%) | Mean±SD | RSD (%) | ||
| 10 | 11.26±0.0099 | 0.090 | 11.30±0.066 | 0.580 | |
| 40 | 38.14±0.097 | 0.260 | 38.04±0.090 | 0.240 | |
| 160 | 158.8±0.120 | 0.077 | 158.9±0.073 | 0.046 | |
1.6.4. 专属性考察
精密吸取一定量的阿霉素标准品，在“1.6.1”色谱条件下测定得到色谱图 2，如图所示阿霉素的保留时间为8.4 min。精密吸取一定量的空白溶液甲醇，在同样测定条件下，甲醇作为溶剂，只出现了溶剂峰，且与样品峰完全分离（图 3），证明甲醇在样品出峰处不会造成干扰。精密吸取一定量的甘草酸溶液，在同样条件下进样分析，甘草酸溶液在样品出峰处不会造成干扰（图 4）。精密吸取一定量的阿霉素标准品，加入适量的甘草酸溶液（阴性对照），HPLC测定含甘草酸的阿霉素溶液（图 5），甘草酸的加入并不影响阿霉素峰，分离度高。
2.
ADR标准品的HPLC色谱图
HPLC chromatogram of ADR.
3.
空白溶剂-甲醇的HPLC色谱图
HPLC chromatogram of methanol.
4.
甘草酸HPLC色谱图
HPLC chromatogram of glycyrrhizin.
5.
ADR+GL物理混合物HPLC色谱图
HPLC chromatogram of ADR+GL mixture.
1.6.5. 加样回收率试验
精密称量适量制备的阿霉素样品，用甲醇溶解并稀释成一定浓度的阿霉素样品溶液，进样20 μL测定其浓度，再分别定量加入不同浓度的阿霉素标准品溶液（分别由阿霉素标准品母液用甲醇稀释成浓度为10，40，160 μg/mL），每个浓度分别测定3次，计算回收率。回收率计算公式为：回收率=测得量/（样品中药物的量+加入量）×100%（表 3），所测得回收率在93%~104%之间，RSD均小于2%，证明该方法用于测定阿霉素的含量，回收率较高。
3.
ADR回收率测定结果
Results of recovery rate of adriamycin (n=3)
| Added concentration (μg/mL) | Measured concentration (μg/mL) | Recovery (%) | Average recovery rate (%) | RSD (%) |
| 11.25 | 10.55 | 93.82 | 93.76 | 0.20 |
| 10.57 | 93.92 | |||
| 10.52 | 93.54 | |||
| 38.26 | 39.49 | 103.2 | 103.27 | 0.25 |
| 39.43 | 103.1 | |||
| 39.62 | 103.5 | |||
| 159.0 | 160.4 | 100.9 | 101.74 | 0.76 |
| 162.6 | 102.3 | |||
| 162.2 | 102.0 |
1.6.6. 浓度测定
取20 μL阿霉素饱和溶液，用甲醇稀释10倍，12 000 r/min离心15 min，取上清进HPLC分析。
1.7. ADR-GL复合物抗肿瘤活性测定
1.7.1. MTT法测定阿霉素及ADR-GL对肝肿瘤细胞HepG2体外增殖的影响
HepG2细胞消化后收集于无菌10 mL EP管中，用Countstar细胞计数板计数，稀释细胞浓度为8×104/mL，每孔100 μL接种于96孔板，即终浓度为8000/孔，边缘孔不加细胞，用无菌PBS缓冲液填充后放入细胞培养箱中继续培养24 h。分为空白对照组、阴性对照组（不含药物的DMEM培养基培养）、阿霉素对照组（ADR浓度依次为0、0.5、1、4、8、16、32 μmol/L）和ADR-GL（2∶ 1）分子复合物组（其中ADR浓度依次为0、0.5、1、4、8、16、32 μmol/L）。药物作用24 h后每孔加入20 μL 5 mg/mL的MTT溶液，混匀，放入细胞培养箱中等待4 h，用1 mL注射器沿边缘小心吸去孔内培养液，弃去，然后每孔加150 μL普通DMSO（可以观察到部分组别细胞颜色出现紫色），将96孔板置于微孔板振荡器上低速振荡5~10 min使紫色结晶物充分溶解，最后在酶标检测仪570 nm处测定各孔的吸光度（A570 nm）。按下式计算各组药物对细胞的活力影响：
细胞活力（%）=1-（1-A570 nm实验组/A570 nm对照组）× 100%
1.7.2. 流式细胞仪测定阿霉素及ADR-GL对MDA-MD- 231肿瘤干细胞群比的影响
将MDA-MD-231细胞按1×106/孔接种在六孔板上，分为空白对照组、阿霉素对照组和ADR-GL（2∶ 1）分子复合物组。对照组为MDAMD- 231细胞不加药物培养24 h，阿霉素对照组在MDA-MD-231细胞中加入0.25，0.5，1 μmol/L阿霉素培养24 h，ADR-GL（2∶ 1）复合物组在MDA-MD-231细胞中加入ADR浓度为0.25，0.5，1 μmol/L的ADR-GL复合物培养24 h。药物处理完毕后将细胞用PBS洗涤两次，加入CD44抗体在暗处孵育20 min后用流式细胞仪进行分析，计算CD44阳性（CD44+）的MDA-MB-231细胞所占总的MDA-MB-231细胞的比例。
1.8. 数据处理
统计学分析采用GraphpadPrism 5.0软件，结果以均数±标准差表示，通过one-way ANOVA with Tukey posthoc test对多组进行分析。P < 0.05被认为差异具有统计学意义。
2. 结果
2.1. ADR-GL复合物的制备与表征
旋蒸后的ADR-GL复合物呈亮红色、透明晶体状（图 6）。红外光谱分析（图 7）结果显示，与阿霉素对照组相比，ADR-GL复合物1525 cm-1碳碳双键吸收峰消失；DSC图示（图 8）阿霉素在239 ℃处存在熔融峰，但此峰在ADR+GL Physical mixture（物理混合物）和ADRGL Complex（ADR-GL分子复合物）中均消失，且ADRGL分子复合物在86 ℃出现一个明显的新吸收峰，表明阿霉素可能被甘草酸所包裹而以ADR-GL分子复合物的新形式存在。
6.
ADR-GL复合物外观图
Image ofADR-GLcomplex.
7.
ADR-GL分子复合物红外表征图
FT-IR image of ADR-GL complex.
8.
ADR-GL分子复合物差示扫描量热（DSC）分析图
DSC Image of ADR (A), ADR+GL physical mixture (B), GL (C), and ADR-GL complex (D).
2.2. 不同比例的ADR-GL复合物在pH=7.4的磷酸盐缓冲液中阿霉素溶解度
研究发现，随GL用量增加，阿霉素的溶解度逐渐升高（图 9），与阿霉素对照组相比，ADR-GL分子复合物组阿霉素溶解度均具显著性差异（P < 0.05），ADR∶ GL=2∶1、1∶1、1∶2的ADR-GL复合物在pH=7.4磷酸盐缓冲液中阿霉素的溶解度分别为2.109，3.630，5.562 mmol/L，其中ADR∶ GL 2∶ 1的分子复合物阿霉素溶解度最高，是阿霉素对照组的6.3倍。将应用于下一步抗肿瘤活性研究中。
9.
不同比例的ADR-GL复合物在pH=7.4磷酸盐缓冲液中的溶解度
Solubility of ADR in pH7.4 phosphate buffer in different ratios of ADR-GL complex. *P < 0.05 vs ADR Group.
2.3. 抗肿瘤活性
MTT结果显示（图 10），随着阿霉素和ADR-GL分子复合物中ADR浓度的升高，HepG2细胞活力逐渐下降，两组对HepG2的细胞活力影响在1 μmol/L处有明显差异（P < 0.05），而其他浓度下均无显著性差异（P> 0.05），其IC50值分别为5.940 μmol/L和6.385 μmol/L。
10.
ADR及ADR-GL分子复合物对HepG2体外增殖的影响
Viability of HepG2 cells with ADR or ADR-GL treatment (concentration of ADR=0, 0.5, 1, 4, 8, 16, and 32 μmol/L) for 24 h.
采用流式细胞仪检测ADR-GL分子复合物的肿瘤抑制作用。与阿霉素对照组相比，ADR-GL复合物能否改善MDA-MB-231乳腺癌干细胞群比的负作用（图 11），MDA-MB-231乳腺癌干细胞群比在阿霉素对照组0.25，0.5，1 μmol/L占比分别为1.51%，2.56%，4.56%；在ADRGL复合物组（ADR∶ GL=1∶ 2）0.25，0.5，1 μmol/L占比分别为1.41%，2.45%，4.31%，二者相比无明显差异。
11.
ADR-GL复合物对MDA-MB-231乳腺癌干细胞群比的影响测定
Determination of ADR-GL complex on MDA-MB-231 stem cell population ratio.
3. 讨论
在中医基础理论中，甘草是调和诸药之王[14]，而甘草酸则是来源于中药甘草的三萜类化合物，具保肝作用[15-17]；阿霉素是一种蒽环类广谱抗肿瘤药物，其药代动力学结果[18-19]显示，它在体内的循环半衰期非常短，并且具有广泛的非选择性组织分布[20]。我们采用旋蒸法制备了ADR-GL分子复合物并对其进行了初步表征，初步证明阿霉素可能被甘草酸所包裹而以一种新的分子复合物的形式存在，且其中阿霉素的溶解度显著提高。
阿霉素又称多柔比星，临床上注射用盐酸多柔比星（辉瑞）适应症为急性白血病、淋巴瘤、软组织和骨肉瘤、儿童恶性肿瘤及成人实体瘤的治疗，尤其用于乳腺癌和肺癌。我们采用MTT法首先考察对比ADR和ADRGL分子复合物对肝癌细胞HepG2细胞增殖的直接作用，结果显示，ADR和ADR-GL分子复合物对HepG2的细胞活力影响在1 μmol/L处有明显差异（P < 0.05），而其他浓度下均无显著性差异（P > 0.05）。另一方面，肿瘤干细胞是肿瘤研究领域相对较新的概念，是指具有干细胞样的特征，能快速自我更新，逃避化疗、放疗抗肿瘤效果导致肿瘤的术后复发，在肿瘤细胞中占很小比例的细胞亚群[21-23]。乳腺癌的多种治疗方案如手术治疗、放射治疗、化学治疗等只能消灭肿瘤细胞，但肿瘤干细胞恶性程度高，能继续分化肿瘤细胞，是导致肿瘤预后差、肿瘤复发和转移的重要介质。因此，意图治愈肿瘤，清除处于非增殖期的肿瘤干细胞就成为恶性肿瘤治疗的首要[24]。MDA-MB-231细胞系是经典的乳腺癌细胞系[25-26]，其分化差、恶性程度高、易复发转移且预后差，而研究表明这可能归因于MDA-MB-231细胞中干细胞比例较高[27]。因此，我们同时选择了MDA-MB-231干细胞作为研究对象比直接作用于肿瘤细胞更加具有实际意义。实验结果表明，ADR和ADR-GL分子复合物均增加MDA-MB-231细胞的肿瘤干细胞负作用占比，与Control组无明显差异，我们笔者前期也已证实，甘草酸能够通过调节自噬流而降低阿霉素的心肌毒性[28]，由此证明，甘草酸可以在一定程度上降低阿霉素的毒副作用而不影响其抗肿瘤能力。
本团队曾先后以甘草酸为载体构建了紫杉醇-甘草酸胶束[29]、鬼臼毒素-甘草酸胶束[30]和羟喜树碱-甘草酸胶束[5]等，其中甘草酸因其具有“两亲性结构”（疏水的甘草次酸+亲水性的葡萄糖醛酸），因此可作为一种“功能性载体”，既是药物载体[31-32]，显著提高药物溶解度的同时，又提高了紫杉醇的口服生物利用度、鬼臼毒素的皮肤抗炎作用以及羟喜树碱的抗肿瘤活性等。本文则再次以甘草酸为载体，构建ADR-GL分子复合物，由于pH 7.4更符合健康人体血液pH值，过酸或者过碱都有可能干扰血管内膜的正常代谢和机能，因此为其作为一种静脉注射制剂提供参考[33]。甘草酸价格低廉，来源丰富易得，有望开发为一种新的“功能性载体”材料，在装载药物的同时发挥增效减毒[34-35]作用。我们的研究发现，ADR-GL分子复合物与阿霉素对照组的抗肿瘤活性无明显差异。由于我们前期研究发现，甘草酸能够通过调控HMGB1介导的自噬而减轻阿霉素心脏毒性[28]，因此，本研究将为后续探究甘草酸增效减毒的机制提供一定的实验基础和科学依据。
Biography
吕雪丽，硕士，E-mail: Lvxueli1030@163.com
Funding Statement
广州市科技计划项目资助(201804010065);广东省自然科学基金(2020A1515010397)
Contributor Information
吕 雪丽 (Xueli LÜ), Email: Lvxueli1030@163.com.
魏 理 (Li1 WEI), Email: runkingone@126.com.
李 国锋 (Guofeng LI), Email: lgfnf@smu.edu.cn.
References
- 1.Bidwell GL, Fokt I, Priebe W, et al. Development of elastin-like polypeptide for thermally targeted delivery of doxorubicin. Biochem Pharmacol. 2007;73(5):620–31. doi: 10.1016/j.bcp.2006.10.028. [Bidwell GL, Fokt I, Priebe W, et al. Development of elastin-like polypeptide for thermally targeted delivery of doxorubicin[J]. Biochem Pharmacol, 2007, 73(5): 620-31.] [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 2.Liu JJ, Tang W, Fu M, et al. Development of R8 modified epirubicindihydroartemisinin liposomes for treatment of non-small-cell lung cancer. Artif Cells Nanomed Biotechnol. 2019;47(1):1947–60. doi: 10.1080/21691401.2019.1615932. [Liu JJ, Tang W, Fu M, et al. Development of R8 modified epirubicindihydroartemisinin liposomes for treatment of non-small-cell lung cancer[J]. Artif Cells Nanomed Biotechnol, 2019, 47(1): 1947-60.] [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 3.周 琦, 刘 敏, 骆 春艳, et al. miR-19b过表达抑制阿霉素诱导的H9c2心肌细胞凋亡. 中国免疫学杂志. 2020;36(17):2077–81. doi: 10.3969/j.issn.1000-484X.2020.17.006. [周琦, 刘敏, 骆春艳, 等. miR-19b过表达抑制阿霉素诱导的H9c2心肌细胞凋亡[J]. 中国免疫学杂志, 2020, 36(17): 2077-81.] [DOI] [Google Scholar]
- 4.李 志华, 颜 苗, 张 毕奎, et al. 基于药动学的甘草配伍减毒机制研究进展. https://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-ZCYO201523028.htm. 中草药. 2015;46(23):3611–6. [李志华, 颜苗, 张毕奎, 等. 基于药动学的甘草配伍减毒机制研究进展[J]. 中草药, 2015, 46(23): 3611-6.] [Google Scholar]
- 5.郎霞. 甘草降低栀子肝肾毒性的作用机制及物质基础初步研究[D]. 太原: 山西中医药大学, 2020.
- 6.李 晗, 张 广平, 杨 依霏, et al. 基于药物代谢酶CYP3A4的乌头碱配伍人参皂苷、甘草苷的减毒机制研究. https://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-YWPJ202002005.htm. 药物评价研究. 2020;43(2):199–205. [李晗, 张广平, 杨依霏, 等. 基于药物代谢酶CYP3A4的乌头碱配伍人参皂苷、甘草苷的减毒机制研究[J]. 药物评价研究, 2020, 43(2): 199-205.] [Google Scholar]
- 7.李 晗, 张 广平, 马 梦, et al. 心脏药代酶的附子-甘草配伍减毒机制. https://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-ZSFX202001010.htm. 中国实验方剂学杂志. 2020;26(1):59–64. [李晗, 张广平, 马梦, 等. 心脏药代酶的附子-甘草配伍减毒机制[J]. 中国实验方剂学杂志, 2020, 26(1): 59-64.] [Google Scholar]
- 8.杨 富恒, 刘 旭东, 刘 思佳, et al. 甘草酸对紫杉醇增溶作用考察. https://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-ZGYZ201621011.htm. 中国医院药学杂志. 2016;36(21):1873–7. [杨富恒, 刘旭东, 刘思佳, 等. 甘草酸对紫杉醇增溶作用考察[J]. 中国医院药学杂志, 2016, 36(21): 1873-7.] [Google Scholar]
- 9.Cai JY, Luo SW, Lv XL, et al. Formulation of injectable glycyrrhizic acid-hydroxycamptothecin micelles as new generation of DNA topoisomerase I inhibitor for enhanced antitumor activity. Int J Pharm. 2019;571:118693. doi: 10.1016/j.ijpharm.2019.118693. [Cai JY, Luo SW, Lv XL, et al. Formulation of injectable glycyrrhizic acid-hydroxycamptothecin micelles as new generation of DNA topoisomerase I inhibitor for enhanced antitumor activity[J]. Int J Pharm, 2019, 571: 118693.] [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 10.薛 禾菲, 张 琬靖, 刘 沛, et al. 甘草酸的增溶作用探究. https://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-MZMJ202014003.htm. 中国民族民间医药. 2020;29(14):13–7. [薛禾菲, 张琬靖, 刘沛, 等. 甘草酸的增溶作用探究[J]. 中国民族民间医药, 2020, 29(14): 13-7.] [Google Scholar]
- 11.刘 晓微, 卓 虹伊, 徐 霞, et al. 基于甘草酸增溶作用的葛根素分散片研究. https://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-ZGZY201907032.htm. 中国中药杂志. 2019;44(7):1350–6. doi: 10.19540/j.cnki.cjcmm.20190318.301. [刘晓微, 卓虹伊, 徐霞, 等. 基于甘草酸增溶作用的葛根素分散片研究[J]. 中国中药杂志, 2019, 44(7): 1350-6.] [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 12.焦 岩, 韩 赫, 常 影, et al. 玉米醇溶蛋白负载叶黄素纳米粒的制备与表征. https://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-SPJX201907002.htm. 食品与机械. 2019;35(7):7–12, 97. [焦岩, 韩赫, 常影, 等. 玉米醇溶蛋白负载叶黄素纳米粒的制备与表征[J]. 食品与机械, 2019, 35(7): 7-12, 97.] [Google Scholar]
- 13.杨 富恒, 李 国锋, 李 振东, et al. 基于甘草酸为载体的紫杉醇-甘草酸纳米胶束的构建和口服生物利用度的评价. https://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-ZGYZ201810006.htm. 中国医院药学杂志. 2018;38(10):1040–4, 1055. [杨富恒, 李国锋, 李振东, 等. 基于甘草酸为载体的紫杉醇-甘草酸纳米胶束的构建和口服生物利用度的评价[J]. 中国医院药学杂志, 2018, 38(10): 1040-4, 1055.] [Google Scholar]
- 14.周建明. 甘草调和诸药的配伍机制及保肝作用研究[D]. 合肥: 安徽医科大学, 2010.
- 15.Hosseinzadeh H., Nassiri-Asl M. Pharmacological Effects of Glycyrrhiza spp. and Its Bioactive Constituents: Update and Review. Phytother Res. 2015;29(12):1868–86. doi: 10.1002/ptr.5487. [H. Hosseinzadeh, M. Nassiri-Asl. Pharmacological Effects of Glycyrrhiza spp. and Its Bioactive Constituents: Update and Review[J]. Phytother Res, 2015, 29(12): 1868-86.] [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 16.Asl MN, Hosseinzadeh H. Review of pharmacological effects of Glycyrrhiza sp. and its bioactive compounds. Phytother Res. 2008;22(6):709–24. doi: 10.1002/ptr.2362. [Asl MN, Hosseinzadeh H. Review of pharmacological effects of Glycyrrhiza sp. and its bioactive compounds[J]. Phytother Res, 2008, 22(6): 709-24.] [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 17.赵 晓春, 钟 庆. 甘草酸类制剂治疗脂肪肝的研究进展. https://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-QKYX2020S1099.htm. 中国全科医学. 2020;23(S1):282–4. [赵晓春, 钟庆. 甘草酸类制剂治疗脂肪肝的研究进展[J]. 中国全科医学, 2020, 23(S1): 282-4.] [Google Scholar]
- 18.范 健, 文 旭, 缪 玉山, et al. 脂质体阿霉素与游离阿霉素在大鼠体内药代动力学. 中国药科大学学报. 2001;32(5):354–8. doi: 10.3321/j.issn:1000-5048.2001.05.009. [范健, 文旭, 缪玉山, 等. 脂质体阿霉素与游离阿霉素在大鼠体内药代动力学[J]. 中国药科大学学报, 2001, 32(5): 354-8.] [DOI] [Google Scholar]
- 19.明 艳, 刘 思源. 参麦注射液增敏阿霉素体内药效学和药代动力学的研究. https://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-HNZB201611015.htm. 中医药导报. 2016;22(11):46–8. [明艳, 刘思源. 参麦注射液增敏阿霉素体内药效学和药代动力学的研究[J]. 中医药导报, 2016, 22(11): 46-8.] [Google Scholar]
- 20.Gabizon AA, Patil Y, La-Beck NM. New insights and evolving role of pegylated liposomal doxorubicin in cancer therapy. http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1368764616300486. Drug Resist Updat. 2016;29:99–106. doi: 10.1016/j.drup.2016.10.003. [Gabizon AA, Patil Y, La-Beck NM. New insights and evolving role of pegylated liposomal doxorubicin in cancer therapy[J]. Drug Resist Updat, 2016, 29: 99-106.] [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 21.Chuthapisith S, Eremin J, El-Sheemey M, et al. Breast cancer chemoresistance: emerging importance of cancer stem cells. Surg Oncol. 2010;19(1):27–32. doi: 10.1016/j.suronc.2009.01.004. [Chuthapisith S, Eremin J, El-Sheemey M, et al. Breast cancer chemoresistance: emerging importance of cancer stem cells[J]. Surg Oncol, 2010, 19(1): 27-32.] [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 22.徐 旭. 欧前胡素下调MCL-1提高口腔鳞癌干细胞顺铂敏感性实验研究. 浙江中西医结合杂志. 2016;26(11):991–5. doi: 10.3969/j.issn.1005-4561.2016.11.006. [徐旭. 欧前胡素下调MCL-1提高口腔鳞癌干细胞顺铂敏感性实验研究[J]. 浙江中西医结合杂志, 2016, 26(11): 991-5.] [DOI] [Google Scholar]
- 23.崔 开宇, 孔 宪超. 肿瘤干细胞在子宫内膜癌的诊断与治疗中的研究进展. 首都医科大学学报. 2012;33(2):280–3. doi: 10.3969/j.issn.1006-7795.2012.02.031. [崔开宇, 孔宪超. 肿瘤干细胞在子宫内膜癌的诊断与治疗中的研究进展[J]. 首都医科大学学报, 2012, 33(2): 280-3.] [DOI] [Google Scholar]
- 24.张双鹤. microRNA在三阴乳腺癌细胞株MDA-MB-231肿瘤干细胞中的表达谱研究[D]. 沈阳: 辽宁中医药大学, 2016.
- 25.刘宇. 缺氧对乳腺癌MDA-MB-231细胞干性的影响[D]. 衡阳: 南华大学, 2015.
- 26.蔡云. 甘草酸或甘草次酸配伍依托泊苷对三阴性乳腺癌MDA-MB- 231细胞作用的差异及其机制初步研究[D]. 广州: 南方医科大学, 2017.
- 27.武瑞仙. 三氧化二砷联合粉防己碱对三阴乳腺癌细胞及干细胞调控作用的研究[D]. 北京: 北京中医药大学, 2018.
- 28.Lv XL, Zhu YL, Deng YG, et al. Glycyrrhizin improved autophagy flux via HMGB1-dependent Akt/mTOR signaling pathway to prevent Doxorubicin-induced cardiotoxicity. Toxicology. 2020;441:152508. doi: 10.1016/j.tox.2020.152508. [Lv XL, Zhu YL, Deng YG, et al. Glycyrrhizin improved autophagy flux via HMGB1-dependent Akt/mTOR signaling pathway to prevent Doxorubicin-induced cardiotoxicity[J]. Toxicology, 2020, 441: 152508.] [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 29.Yang FH, Zhang Q, Liang QY, et al. Bioavailability enhancement of paclitaxel via a novel oral drug delivery system: paclitaxel-loaded glycyrrhizic acid micelles. Molecules. 2015;20(3):4337–56. doi: 10.3390/molecules20034337. [Yang FH, Zhang Q, Liang QY, et al. Bioavailability enhancement of paclitaxel via a novel oral drug delivery system: paclitaxel-loaded glycyrrhizic acid micelles[J]. Molecules, 2015, 20(3): 4337-56.] [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 30.Wang YT, Zhao BX, Wang SQ, et al. Formulation and evaluation of novel glycyrrhizic acid micelles for transdermal delivery of podophyllotoxin. Drug Deliv. 2016;23(5):1623–35. doi: 10.3109/10717544.2015.1135489. [Wang YT, Zhao BX, Wang SQ, et al. Formulation and evaluation of novel glycyrrhizic acid micelles for transdermal delivery of podophyllotoxin[J]. Drug Deliv, 2016, 23(5): 1623-35.] [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 31.Selyutina OY, Polyakov NE. Glycyrrhizic acid as a multifunctional drug carrier-from physicochemical properties to biomedical applications: a modern insight on the ancient drug. Int J Pharm. 2019;559:271–9. doi: 10.1016/j.ijpharm.2019.01.047. [Selyutina OY, Polyakov NE. Glycyrrhizic acid as a multifunctional drug carrier-from physicochemical properties to biomedical applications: a modern insight on the ancient drug[J]. Int J Pharm, 2019, 559: 271-9.] [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 32.Selyutina OY, Shelepova EA, Paramonova ED, et al. Glycyrrhizininduced changes in phospholipid dynamics studied by 1H NMR and MD simulation. Arch Biochem Biophys. 2020;686:108368. doi: 10.1016/j.abb.2020.108368. [Selyutina OY, Shelepova EA, Paramonova ED, et al. Glycyrrhizininduced changes in phospholipid dynamics studied by 1H NMR and MD simulation[J]. Arch Biochem Biophys, 2020, 686: 108368.] [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 33.刘 永厚, 季 东梅, 葛 宝铭, et al. 改变输液pH值对七叶皂苷所致静脉炎的影响. https://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-ZGCF201712039.htm. 中国医师进修杂志. 2008;31(6):26–8. [刘永厚, 季东梅, 葛宝铭, 等. 改变输液pH值对七叶皂苷所致静脉炎的影响[J]. 中国医师进修杂志, 2008, 31(6): 26-8.] [Google Scholar]
- 34.Kim SH, Hong JH, Yang WK, et al. Herbal combinational medication of glycyrrhiza glabra, Agastache rugosa containing glycyrrhizic acid, Tilianin inhibits neutrophilic lung inflammation by affecting CXCL2, Interleukin-17/STAT3 signal pathways in a murine model of COPD. Nutrients. 2020;12(4):926. doi: 10.3390/nu12040926. [Kim SH, Hong JH, Yang WK, et al. Herbal combinational medication of glycyrrhiza glabra, Agastache rugosa containing glycyrrhizic acid, Tilianin inhibits neutrophilic lung inflammation by affecting CXCL2, Interleukin-17/STAT3 signal pathways in a murine model of COPD[J]. Nutrients, 2020, 12(4): 926.] [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 35.Cao YZ, Shi H, Sun ZG, et al. Protective effects of magnesium glycyrrhizinate on methotrexate-induced hepatotoxicity and intestinal toxicity may be by reducing COX-2. Front Pharmacol. 2019;10:119. doi: 10.3389/fphar.2019.00119. [Cao YZ, Shi H, Sun ZG, et al. Protective effects of magnesium glycyrrhizinate on methotrexate-induced hepatotoxicity and intestinal toxicity may be by reducing COX-2[J]. Front Pharmacol, 2019, 10: 119.] [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]