Treino de Força Reduz Stress Oxidativo Cardíaco e Renal em Ratos com Hipertensão Renovascular

Resumo

Fundamento

O treino de força tem efeitos benéficos em doenças renais, além de ajudar a melhorar a defesa antioxidante em animais saudáveis.

Objetivo

Verificar se o treino de força reduz o dano oxidativo ao coração e rim contralateral para cirurgia de indução de hipertensão renovascular, bem como avaliar as alterações na atividade das enzimas antioxidantes endógenas superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e glutationa peroxidase (GPx).

Métodos

Dezoito ratos machos foram divididos em três grupos (n=6/grupo): placebo, hipertenso e hipertenso treinado. Os animais foram induzidos a hipertensão renovascular através da ligação da artéria renal esquerda. O treino de força foi iniciado quatro semanas após a indução da hipertensão renovascular, teve 12 semanas de duração e foi realizada a 70% de 1RM. Depois do período de treino, os animais foram submetidos a eutanásia e o rim esquerdo e o coração foram retirados para realizar a quantificação de peróxidos de hidrogênio, malondialdeído e grupos sulfidrílicos, que são marcadores de danos oxidativos. Além disso, foram medidas as atividades das enzimas antioxidantes superóxido dismutase, catalase e glutationa peroxidase. O nível de significância adotado foi de 5% (p < 0,05).

Resultados

Depois do treino de força, houve redução de danos oxidativos a lipídios e proteínas, como pode-se observar pela redução de peróxidos de hidrogênio e níveis sulfidrílicos totais, respectivamente. Além disso, houve um aumento nas atividades das enzimas antioxidantes superóxido dismutase, catalase e glutationa peroxidase.

Conclusão

O treino de força tem o potencial de reduzir danos oxidativos, aumentando a atividades de enzimas antioxidantes. (Arq Bras Cardiol. 2021; 116(1):4-11)

Introdução

A hipertensão renovascular, um tipo de hipertensão causada por estenose arterial renal total ou parcial devido a fatores genéticos ou aterosclerose, é uma causa importante de hipertensão secundária.¹ Nesse tipo de hipertensão, o aumento da pressão arterial (PA) é iniciado por uma maior liberação de renina pelo rim isquêmico resultante do fluxo sanguíneo para esse órgão, devido à estenose da artéria renal.^{1 , 2}

A renina é responsável pela conversão de angiotensinogênio em angiotensina I, que é clivada pela enzima conversora da angiotensina (ECA) produzindo angiotensina II (Ang II).^{3 , 4} Portanto, a elevação da renina acarreta um aumento na liberação de Ang II. A Ang II, por sua vez, ativa as enzimas NADPH oxidase³ e xantina oxidase,⁴ aumentando a produção de ânion superóxido (O₂^-), uma molécula sinalizadora de pró-oxidante altamente reativa que pode causar danos oxidativos a lipídios, proteínas e DNA, e foi descrita na hipertensão renovascular.^{5 , 6} O aumento dos danos oxidativos no rim e no coração pode levar ao amento de fibrose do tecido, causando a redução de sua função,² e, acabando por resultar em falência do rim que não foi afetado por estenose e disfunção cardíaca.

Está relatada, na literatura, a ação protetora do treino de força no tratamento de várias doenças, entre as quais está a hipertensão arterial.^{7 , 8} Entre os benefícios gerados pelo treino de força, já se observou que ela promove a melhoria da função cardíaca,⁹ bem como o aumento da atividade e/ou expressão das enzimas envolvidas na síntese de óxido nítrico.^{10 , 11} Essas mudanças causam o aumento da liberação de óxido nítrico, melhoria do tônus vascular,^{10 , 11} e redução da PA em animais normotensos¹² e hipertensos.¹³

Além disso, também foi descrita a ação protetora do treino de força no stress oxidativo, melhorando a defesa antioxidante no fígado¹⁴ e no músculo esquelético.¹⁵ Entretanto, os efeitos do treino de força no coração e no rim contralateral para estenose arterial renal não são conhecidos. Dessa forma, o objetivo deste estudo foi verificar se o treino de força reduz o dano oxidativo ao coração e rim contralateral para cirurgia de indução de hipertensão renovascular, bem como avaliar as alterações na atividade das enzimas antioxidantes endógenas superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e glutationa peroxidase (GPx).

Métodos

O protocolo experimental do presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal (CEPA - Nº 54/2015) da Universidade Federal de Sergipe, em conformidade com os Princípios Éticos da Experimentação Animal adotados pelo Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal (CONCEA).

Amostra

Ratos Wistar machos, com idade de 10 a 12 semanas e massa corporal entre 240 e 270 g, foram obtidos pela instalação de animais da Universidade Federal de Sergipe. Os animais foram alojados em gaiolas coletivas (cinco animais/gaiola), mantidos em condições controladas de temperatura (23 ± 1ºC) e um ciclo claro-escuro de 12 horas, com alimentação e água à vontade.

Grupos experimentais

Dezoito animais foram divididos aleatoriamente, por meio de um software online, em três grupos experimentais (n = 6 por grupo): placebo, hipertensos e hipertensos treinados. O tamanho da amostra foi definido por conveniência.

Indução da hipertensão renovascular

A indução da hipertensão foi realizada em animais dos grupos dos hipertensos e dos hipertensos treinados, pelo modelo de clipagem arterial desenvolvido por Goldblatt et al.,¹⁶ seguindo as adaptações propostas por Cangiano et al., ¹⁷ Assim, com os animais em anestesia profunda (cetamina 90 mg/kg e xilazina 10 mg/kg, intraperitoneal), foi feita uma incisão no flanco esquerdo da traseira do animal para exteriorização do rim esquerdo, e foi feita uma ligação de artéria renal com uma linha cirúrgica de algodão estéril 4,0. Os animais do grupo de placebo passaram por cirurgia apenas para exteriorização do rim esquerdo para reproduzir o stress gerado pela cirurgia nos animais dos grupos dos hipertensos e dos hipertensos treinados. Todos os animais receberam analgésicos (Flunixina meglumina, sc, 1 mg/Kg, a cada 24 horas) por quatro dias depois do pós-cirúrgico.

Protocolo do treino de força

Três semanas após a cirurgia de indução da hipertensão, os animais dos grupos dos hipertensos e dos hipertensos treinados foram adaptados ao equipamento de treino por cinco dias, mantendo os animais presos aos equipamentos durante 10 minutos por dia. Daí em diante, um teste de repetição máxima (1RM) foi realizado nos animais de ambos os grupos e a cada duas semanas no grupo dos hipertensos treinados, para determinar a carga usada nas sessões de musculação. O teste foi realizado novamente no grupo hipertenso sedentário apenas ao final do protocolo experimental.

Os testes de repetição máxima foram realizados segundo as diretrizes do American College of Sports Medicine (Colégio Americano de Medicina Esportiva)¹⁸ para seres humanos, com três tentativas por teste. O primeiro teste 1RM foi realizado com 3x o peso corporal do animal, ajustando para cima ou para baixo para a tentativa seguinte, dependendo do desempenho do animal na tentativa. Os animais puderam descansar por três minutos entre cada tentativa.

O treino de força foi realizado conforme descrito por Tamaki, Uchiyama e Nakano,¹⁹ e conforme já usado em outros estudo.^{20 - 22} Resumidamente, esse modelo de treino de força é realizado em um aparelho que simula o agachamento onde o torso do rato é equipado com uma jaqueta de lona, que o mantém na posição ereta ( Figura 1 ). A jaqueta de lona é presa a um suporte de alumínio, apoiado no braço de madeira que segura os pesos levantados pelo animal, e um estimulador elétrico foi conectado ao rabo do rato, de forma que ele recebesse um estímulo elétrico (10-15v, 0,3 s duração, 3 s intervalo).^{12 , 20 - 22}

Figura 1. – Ilustração representativa do aparelho para treino de força. (Adaptado de Tamaki et al., 1992).

O período de treino durou 12 semanas e foi iniciado 48 horas após o teste 1RM. Cada sessão de treino de força foi realizada com 70% de sobrecarga de 1RM, com quatro sets de 12 repetições e intervalos de noventa segundos. Os animais do grupo de hipertensos somente receberam estímulo elétrico sem realizar o treino de força. O treinamento e a estimulação elétrica sempre foram realizados no início de ciclo ativo/escuro (18-20 horas), já que os animais apresentaram melhor tolerância ao exercício durante o ciclo escuro.²³

Aferição da pressão arterial (PA)

Vinte e quatro horas após o período de treinamento, os animais hipertensos foram testados novamente por 1RM, 48 horas após o teste de 1RM, a PA dos animais foi aferida. A PA dos animais foi medida pela implantação de um cateter na artéria femoral por meio de um transdutor de pressão (Edwards Lifescience, CA, EUA) acoplado a um pré-amplificador (BioData, Model BD-01, PB, Brasil).

Os sinais de PA pulsátil foram registrados por 30 minutos com os animais acordados (Advanced Codas/Windaq, Dataq Instruments Inc., OH, EUA), permitindo a análise de pulso-batimento-a-batimento para identificar a frequência cardíaca (FC), PA sistólica (PAS), e PA diastólica (PAD). A PA média (PAM) foi determinada pela PAS e pela DAP no próprio software de registro.

Danos oxidativos

Após a avaliação da PA, os animais foram submetidos a eutanásia por decapitação sem anestesia,²⁴ e o coração e o rim foram coletados para os testes de danos oxidativos e atividade de enzima antioxidante.

Para determinar os danos oxidativos a lipídios, os produtos de lipoperoxidação foram medidos por oxidação por xilenol laranja, em que a oxidação de íons ferrosos (Fe²) para íons férricos (Fe³) ocorre em condições ácidas, pelos lipídios de peróxidos de hidrogênio.²⁵ Da mesma forma, o malondialdeído foi medido pela quantificação de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico.²⁶

Os grupos sulfidrílicos, que são estruturas associadas a proteínas e altamente suscetíveis a danos oxidativos, também foram medidos. Por meio de sua quantificação, é possível estimar o dano proteico nos tecidos. A determinação dos grupos sulfidrílicos foi feita pela reação entre o reagente de Ellman (DTNB) e sulfidrila livre da cadeia lateral de cisteína.²⁷

Atividade de enzima antioxidante

A atividade de SOD foi determinada pela habilidade da enzima do tecido de dissociar os ânions superóxidos derivados da auto-oxidação do pirogalol e sua reação reduzindo o 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil )-2,5-difenil-2H-tetrazólio (MTT) e formando cristais de formazan.^{26 , 28}

A atividade da CAT foi estimada pelo índice de degradação do peróxido de hidrogênio (H₂O₂) conforme o protocolo descrito previamente por Nelson e Kiesow.²⁹ A atividade de GPx foi avaliada pela oxidação de NADPH, conforme descrito por Paglia e Valentine.³⁰

Determinação da concentração de proteína

A determinação de concentração de proteína nos testes realizados foi feita pela técnica de Lowry et al.,³¹ quantificando a concentração de proteínas presentes no homogenato das amostras, por comparação com uma curva padrão feita com albumina sérica.

Análise estatística

A normalidade dos dados foi verificada utilizando-se o teste de normalidade Shapiro-Wilk. Os resultados são expressos em média ± desvio padrão (DP). A análise estatística foi realizada por meio de análise de variância (ANOVA) de um fator, seguida do teste de Bonferroni post-hoc. Um valor de p<0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Foram realizadas análises estatísticas utilizando GraphPad Prism^TM 8.0.

Resultados

Para validar nosso modelo de indução de hipertensão renovascular, foram avaliados parâmetros hemodinâmicos. Esses parâmetros foram medidos pela PA pulsátil com os animais acordados. A indução da hipertensão renovascular foi bem-sucedida e causou o aumento de PAS, PAD, PAM e FC. Por outro lado, o treino de força conseguiu neutralizar os efeitos da hipertensão renovascular ( Tabela 1 ).

Tabela 1. – Alteração na pressão arterial causada por estenose arterial renal.

	Placebo	Hipertenso sedentário	Hipertenso treinado
PAS (mmHg)	133±2	187±5***	150±10##
PAD (mmHg)	92±1	151±6***	121±5**,##
PAM (mmHg)	114±2	165±5***	138±8*,#
FC (BPM)	337±4	385±9**	338±4##

Todos os dados representam média de ± EPM. *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001 em comparação com o placebo; #p<0,05, ##p<0,01 comparados com o grupo dos hipertensos sedentários, calculado por ANOVA de um fator seguido do teste de Bonferroni post hoc para comparações em pares. PAS: pressão arterial sistólica, PAD: pressão arterial diastólica, PAM: pressão arterial média, FC: frequência cardíaca, BPM: batimentos por minuto.

Também avaliamos a eficiência do treino de força por uma medição de 1RM, que mede a força máxima dos animais. O treino de força promoveu o aumento na carga suspensa pelos animais hipertensos treinados após 12 semanas de treinamento (p<0,0001; Figura 2 ). Entretanto, como esperado, não houve mudanças na força dos ratos sedentários hipertensos (p>0,05).

Figura 2. – Valores absolutos do teste de força máxima. Todos os dados representam média de ± EPM. ****p<0,0001 em comparação com antes do treino; ###p<0,001 comparado com o grupo dos hipertensos sedentários, calculado por ANOVA de dois fatores seguido do teste de Bonferroni post hoc para comparações em pares. 1RM: teste de repetição máxima.

O aumento do stress oxidativo é outra marca da hipertensão. Dessa forma, medimos os danos oxidativos a lipídios e proteínas, medindo peróxidos de hidrogênio, malondialdeído, e grupos sulfidrílicos. Novamente foi possível validar nosso modelo de hipertensão, já que esta aumentou os danos a lipídios e proteínas no rim contralateral e no coração (p<0,01; Figura 3A e C ), pelo aumento dos peróxidos de hidrogênio e pela redução dos níveis de grupos sulfidrílicos. Entretanto, os animais treinados demonstraram ter proteção contra danos oxidativos com níveis baixos de peróxidos de hidrogênio e preservação dos grupos sulfidrílicos, no rim direito e no coração. Além disso, não se observaram mudanças no nível de malondialdeído (p>0,05; Figura 3B ).

Figura 3. – Efeitos da hipertensão renovascular e do treino de força nos marcadores de danos oxidativos no rim contralateral e no coração. Todos os dados representam média de ± EPM. *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, calculado por ANOVA de um fator seguido do teste de Bonferroni post hoc para comparações em pares. MDA: malondialdeído.

Para melhor identificar os efeitos do treino de força no stress oxidativo em hipertensão renovascular, medimos a atividade das enzimas antioxidantes endógenas. O treino de força aumentou a atividade de SOD no coração e resgatou a atividade de SOD no rim (p<0,01; Figura 4A ), bem como a atividade da catalase em ambos os tecidos (p<0,01; Figura 4B ), enquanto a atividade da GPx só foi normalizada no coração (p<0,01; Figura 4C ).

Figura 4. – Efeitos da hipertensão renovascular e do treino de força na atividade das enzimas antioxidantes. Todos os dados representam média de ± EPM. *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, calculado por ANOVA de um fator seguido do teste de Bonferroni post hoc para comparações em pares. SOD: superóxido dismutase; Gpx: glutationa peroxidase.

Discussão

Os principais resultados do presente estudo demonstraram que o treino de força de 12 semanas com intensidade moderada reduziu os danos oxidativos ao coração e rim contralateral na hipertensão renovascular, aumentando a atividade das enzimas antioxidantes endógenas, bem como reduzindo a pressão sanguínea.

Os modelos de hipertensão renovascular são conhecidos pela ativação do sistema renina-angiotensina, aumentando os níveis de angiotensina II, e com consequente aumento de PA.^{16 , 17 , 32 , 33} Como ocorreu no presente estudo, em que os animais passaram por indução de hipertensão tinham valores de PA elevados, demonstrando que o modelo de indução de hipertensão experimental foi realizado com sucesso.

Além disso, havíamos realizado o modelo de treino de força descrito por Tamaki, Uchiyama e Nakano,¹⁹ cujos efeitos benéficos semelhantes aos encontrados em seres humanos que praticam esse tipo de treino físico já foram relatados.^{9 , 12 , 19 - 22 , 34} No presente trabalho, identificou-se que um treino de força moderado foi eficiente no aumento da força dos animais treinados. Essa demonstração acarretou mudanças benéficas, como se pode ver pela redução da PA. Além disso, os efeitos benéficos também puderam ser observados pela redução de danos a lipídios e preservação dos grupos sulfidrílicos no coração e nos rins. Foi relatado na literatura que o treino de natação aeróbico realizado com intensidade moderada reduz os danos oxidativos no rim contralateral para estenose arterial renal.³⁵

Outros estudos também demonstraram esse efeito protetor do exercício físico no stress oxidativo. Como foi relatado, o treinamento aeróbico em esteira com intensidade que aumenta progressivamente reduz os danos oxidativos renais em outro modelo de hipertensão experimental,³⁶ bem como em outro modelo de doenças renais crônicas.³⁷ Efeitos semelhantes também foram demonstrados em outros modelos de treino de força.^{38 , 39} Essa proteção promovida pelo exercício físico é importante para evitar a ocorrência de fibrose, um processo que ocorre pela deposição de colágeno nas áreas que sofreram danos oxidativos.⁴⁰ Esses danos são aumentados na hipertensão renovascular devido à hiperativação do sistema renina-angiotensina-aldosterona, gerando stress oxidativo.^{2 , 41}

Entretanto, o organismo tem mecanismos para evitar a ocorrência desses danos oxidativos, um dos quais sendo a ativação de enzimas antioxidantes endógenas.^{42 , 43} Por meio desse mecanismo, a enzima antioxidante SOD catalisa a dismutação de O₂^- para H₂O₂. Em seguida, o H₂O₂ é reduzido para H₂O e O₂ pelas peroxidases, GPx ou CAT.^{42 , 43} Em indivíduos saudáveis, essas enzimas são expressas em diferentes maneiras em órgãos diferentes, dependendo dos processos metabólicos e funcionais que ocorrem neles. Entretanto, essas enzimas antioxidantes são reduzidas durante a hipertensão arterial.^{44 , 45}

No presente estudo, a atividade reduzida das enzimas antioxidantes foi observada nos animais do grupo dos hipertensos. Outros estudos corroboram esses achados, demonstrando que tanto a atividade,⁶ quanto a expressão genética dessas enzimas são reduzidas nesse modelo de hipertensão renovascular.⁵ O treino de natação aeróbico^{35 , 46} demonstrou ter aumentado a atividade das enzimas SOD e CAT no coração e no rim contralateral de animais com hipertensão induzida, usando o mesmo modelo de hipertensão renovascular. Embora os efeitos do treino de força no stress oxidativo do rim contralateral ainda não tenham sido estudados, demonstrou-se que o treino de força em subida promove um aumento de enzimas antioxidantes nos músculos esquelético e cardíaco.^{15 , 38 , 39}

Nosso estudo tem limitações porque, por motivos técnicos, não pudemos monitorar o decurso temporal da alteração na PA, bem como a medição de linha de base de outros parâmetros para entender melhor a ação terapêutica do treino de força. Apesar das limitações, os resultados demonstram, no modelo renovascular de ratos, que o treino de força tem um efeito protetor, como já foi observado em outras modalidades de exercício físico. O treino de força aumentou a atividade das enzimas SOD e CAT no rim contralateral e no coração, restabelecendo essa atividade antioxidante a valores encontrados em animais saudáveis (grupo placebo), indicando que esse é um mecanismo possível pelo qual o treino de força consegue reduzir danos oxidativos em animais com hipertensão renovascular.

Conclusão

Os resultados encontrados no presente estudo nos permitem concluir que o treino de força pode neutralizar danos oxidativos produzidos por hipertensão renovascular no rim contralateral e no coração. Essa redução se deve, em parte, ao aumento da atividade das enzimas antioxidantes SOD e CAT promovido pelo treino de força. Portanto, esses resultados sugerem que o treino de força é uma ferramenta não farmacológica importante para o tratamento de hipertensão renovascular, com o potencial de evitar o avanço dos danos ao coração e rim que não tem estenose arterial renal.