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. 2021 Mar 3;116(3):415–422. [Article in Portuguese] doi: 10.36660/abc.20190529
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A Inibição do Metabolismo da Glicose por miR-34a e miR-125b Protege contra a Morte Celular de Cardiomiócitos Causada por Hiperglicemia

Chao-rui Xu 1, Qiu-ju Fang 2,✉
PMCID: PMC8159564  PMID: 33909769

Resumo

Fundamento:

É sabido que a resistência à insulina e a hiperglicemia são causas patológicas importantes no desenvolvimento de cardiomiopatia diabética (CMD). Entretanto, seus mecanismos moleculares precisos na patogênese da CMD ainda não estão claros.

Objetivos:

Estudos recentes revelam que os microRNAs (miRNAs) desempenham papéis essenciais na patogênese da CMD. Este projeto tem o objetivo de determinar os papéis de miR-34a e miR-125b na morte celular de cardiomiócitos causada por hiperglicemia.

Métodos:

Cardiomiócitos primários de ratos foram isolados e expostos a concentrações de glicose normais e altas. A viabilidade das células foi medida utilizando-se o ensaio MTT. As expressões de miR-34a e miR-125b foram detectadas por qRT-PCR. Alvos potenciais de miR-34a e miR-125b foram previstos pelo www.Targetscan.org, e validados a partir de tecidos cardíacos humanos. Um p<0,05 foi considerado significância estatística.

Resultados:

Demonstra-se neste estudo que o miR-34a e o miR-125b têm resposta celular reduzida no coração humano diabético. Além disso, os dados in vitro de cardiomiócitos primários de ratos demonstraram que o tratamento com glicose alta em curto prazo estimula a expressão de miR-34a e miR-125b. Demonstrou-se que, em condições de glicose alta, os cardiomiócitos de ratos apresentaram metabolismo de glicose intracelular, e a captação de glicose e a produção de lactato aumentaram significativamente. Foi identificado que as principais enzimas metabólicas da glicose, hexoquinase 2 (HK2) e lactato desidrogenase-A (LDHA) eram alvos diretos de miR-125b e miR-34a, respectivamente. A superexpressão de miR-125b e miR-34a poderia evitar a morte de celular de cardiomiócitos causada por hiperglicemia. Por fim, a recuperação de HK2 e LDHA em cardiomiócitos com superexpressão de miR-125b e miR-34a restaurou a sensibilidade de cardiomiócitos à hiperglicemia.

Conclusões:

Nossos resultados propõem um mecanismo molecular para proteção cardiovascular diabética mediada por microRNA e contribuirão para o desenvolvimento de estratégias de tratamento de disfunção cardiovascular associada a diabetes.

Palavras-chave: Cardiomiopatia Diabética, Hiperglicemia, Transtornos Metabólicos de Glicose, Morte Celular, Miócitos Cardíacos, Ratos

Introdução

A cardiomiopatia diabética (CMD), que está associada ao aumento da incidência de insuficiência cardíaca em pacientes diabéticos, é uma complicação cardíaca crônica e irreversível.1,2 Ela é caracterizada por alterações patopsicológicas complicadas na estrutura e na função do miocárdio, incluindo disfunção diastólica precoce, dilatação ventricular e hipertrofia cardíaca.2,3 A CMD é causada por fatores que são independentes de doença arterial coronariana (DAC), tais como resistência à insulina no tecido cardíaco, hiperinsulinemia compensatória e hiperglicemia.4 Atualmente, os mecanismos precisos que resultam em CMD ainda estão sendo investigados.

Altos níveis glicêmicos têm um papel importante em várias complicações diabéticas, incluindo a CMD, pela indução de reações inflamatórias.5 Após a captação pelas células, a glicose é quebrada em piruvato/lactato, um processo chamado glicólise anaeróbia.6 A glicólise é regulada em várias etapas reguladoras, tais como a captação da glicose, a fosforilação da glicose, e a conversão do piruvato em lactato ou Acetil-CoA.7 Estudos recentes relataram que a inibição de glicose alta por irisina pode afetar o desenvolvimento de CMD pela regulação da transição endotélio-mesenquimal (EndMT),8 o que sugere que o bloqueio da glicólise pode ser benéfico de pacientes de CMD. Além disso, outro estudo ilustrou que a metalotiona, um antioxidante, poderia inibir o stress oxidativo causado pela hiperglicemia, resultando na supressão da CMD.9 Os relatórios acima indicam que o bloqueio da hiperglicemia poderia evitar a CMD. Portanto, um entendimento melhor da patofisiologia das CMD será uma ajuda significativa para o diagnóstico precoce e o tratamento de disfunção cardiovascular associada a diabetes.

O MicroRNA, um pequeno (~20-25 nt) RNA altamente conservado e não codificante, já demonstrou ter papéis essenciais na remodelação cardíaca e no desenvolvimento de insuficiência cardíaca,10,11 sugerindo um alvo terapêutico potencial para o diagnóstico e o tratamento de CMD. Entre os microRNAs sobre os quais há relatos de alteração significativa durante as CMD, o miR-34a tende a aumentar durante a CMD,11 enquanto sabe-se que o miR-125b está associado ao crescimento hipertrófico,12 indicando que o miR-34a e o miR-125b estão envolvidos no desenvolvimento de CMD. Entretanto, ainda não está claro se o miR-125b e o miR-34a poderiam regular a cardiomiopatia causada por hiperglicemia. Portanto, serão investigados o possível papel e o mecanismo do miR-34a e do miR-125b na disfunção de cardiomiócitos causada por hiperglicemia, sugerindo uma nova estratégia terapêutica para lidar com a CMD.

Métodos

Cultura de cardiomiócitos de ratos

Foi realizado o isolamento de cardiomiócitos de ratos após o estudo prévio.13 Resumidamente, foram coletados cardiomiócitos de ratos neonatos com dois dias de vida. No total, 8 ratos foram dissecados, e todos os cardiomiócitos de ratos isolados/em cultura foram agrupados. Todos os experimentos foram realizados utilizando-se as mesmas células do grupo. Os cardiomiócitos foram ainda foram identificados por coloração com actina de músculo liso, alfa-actina sarcomérica e tropomiosina. Os cardiomiócitos foram colocados em cultura em meio de cardiomiócito específico (Nº de catálogo 6201; ScienCell), de acordo com as instruções do fabricante. O meio de cultura foi renovado a cada 24 horas. Após setenta e duas horas, o meio de cultura celular foi trocado pelo meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Nº de catálogo 31600-034; Invitrogen Corporation, Grand Island, NY, EUA) com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% penicilina/estreptomicina em uma atmosfera umidificada com 5% CO2 a 37oC. Os experimentos com células de ratos foram realizados em triplicata e repetidos três vezes. Os experimentos com animais foram realizados com aprovação do Comitê Análise de Ética Animal do Hospital da Província de Heilongjiang (Nº AHPH-201711-06).

Amostras de tecido cardíaco humano

Foram obtidas amostras de tecido cardíaco humano de corações humanos com insuficiência devido à CMD (20 casos) no momento do transplante no Hospital da Província de Heilongjiang. Os tecidos foram congelados imediatamente em nitrogênio líquido e, em seguida, armazenados a -80oC até o uso. Os tecidos de corações normais (20 casos) foram obtidos de doadores saudáveis, sem transplantes, e foram armazenados pelos mesmos procedimentos. A coleta de tecido humano foi realizada com a aprovação do Comitê Análise de Ética do Hospital da Província de Heilongjiang (Nº PH-201706-2H). O termo de consentimento informado foi obtido de todos os pacientes.

Transfecção de precursores de microRNA e DNA plasmidial

O precursor de miR-34a, o precursor de miR-125b e o controle negativo foram comprados da Genepharma (Xangai, China). Os precursores de microRNA e o microRNA de controle negativo foram transfectados a 50 nM. As células foram semeadas em placas de 6 poços em densidades de 105, 24 h antes da transfecção. A transfecção foi realizada utilizando-se o reagente de transfecção Lipofectamine RNAiMax (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Após 72 horas, as células foram coletadas para análise a jusante. Vetores de superexpressão contendo ORF LDHA humana ou HK2 foram comprados da Origene Technologies Inc. (Rockville, MD), e foram transfectadas 4 µg de plasmídeos utilizando-se o reagente de transfecção Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante. As células foram coletadas após 48 horas para análise a jusante.

Captação de glicose e produção de lactato

O ensaio de captação de glicose foi realizado utilizando-se o kit de ensaio colorimétrico de captação de glicose (nº MAK083) da Sigma (Xangai, China), de acordo com as instruções do fabricante. A produção de lactato foi detectada utilizando-se o kit de ensaio de lactato (nº MAK064) da Sigma (Xangai, China), de acordo com as instruções do fabricante. Os dados foram normalizados pelo número de células de cada grupo experimental. Os ensaios foram realizados em triplicata e repetidos três vezes.

Detecção de morte celular de cardiomiócitos

A morte celular de cardiomiócitos foi investigada pelo ensaio MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazolio) e foi verificada por coloração azul de Trypan. Resumidamente, 24 horas após os tratamentos com glicose alta, o meio de cultura das células foi substituído por 200 μl de meio fresco, e 20 μL de MTT de 5 mg/mL (Sigma, nº M5655) foram colocados nos cardiomiócitos de ratos por 2 horas a 37 °C. O meio de cultura foi totalmente retirado, e foram adicionados 100 μL de DMSO. As placas foram colocadas no agitador orbital por 5 minutos em temperatura ambiente. A absorbância na densidade óptica (OD) de 590 nM foi medida. A absorbância foi normalizada pelo número de células de cada poço. Cada experimento foi realizado em triplicata e repetido três vezes.

RT-PCR quantitativo

O RNA total foi isolado de células de cardiomiócitos e tecido utilizando-se o reagente TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acordo com as instruções do fabricante. Depois do tratamento com DNase, a qualidade do RNA foi medida pelo espectrofotômetro NanoDrop. Para detecção dos miRNAs, foi conjugada uma cauda poliA ao RNA digerido por DNase livre de RNase, e o qRT-PCR foi realizado utilizando-se o kit de detecção de miRNA (Applied Biosystems) de acordo com as instruções do fabricante. O gene U6 humano foi utilizado como controle interno. A reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) foi realizada utilizando-se SYBR Green Taq ReadyMix (Sigma) em um sistema de PCR Applied Biosystems7500. Os resultados foram analisados pelo método 2−ΔΔCt e normalizados pela expressão do gene U6. Todos os ensaios foram realizados com o sistema de detecção de PCR em tempo real multicolor Bio-Rad IQTM5. Os experimentos foram realizados em triplicata e repetidos três vezes.

Previsão de alvo

Os alvos potenciais de miR-125b e miR-34a foram previstos por computação pelo programa TargetScan (http://www.targetscan.org/).

Análise Western Blot

A análise Western Blot foi realizada para avaliar as expressões das proteínas HK2 e LDHA. Lisados celulares de cardiomiócitos de ratos foram extraídos utilizando-se o tampão de lise e extração RIPA (#89900, Thermo Scientific, Xangai, China). A concentração de proteína foi determinada pelo método de Bradford conforme previamente descrito.14 Uma quantidade igual de amostra de proteína foi adicionada ao gel SDS-PAGE a 10%, seguida de eletroforese, e transferida para membrana de nitrocelulose. As membranas foram bloqueadas por BSA a 5% por uma hora em temperatura ambiente. Depois de uma lavagem completa com TBST, as manchas foram incubadas com os anticorpos primários da Cellsignaling Technology (Danvers, MA, EUA) (HK2, #2867; LDHA, #3582 e α-tubulina, #2125) a 1:1000, durante toda a noite, a 4 oC. As membranas foram lavadas e incubadas com os anticorpos secundários respectivos a 1:3000 por uma hora em temperatura ambiente. As bandas foram detectadas por agentes desenvolvedores de quimioluminescência (SuperSignal, Thermo Scientific). Os resultados foram repetidos três vezes e números representativos foram apresentados.

Análise estatística

A análise estatística foi realizada com o software GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, EUA). O teste t de Student não pareado foi utilizado para análise de dados entre dois grupos. A significância entre três ou mais grupos foi analisada pelo ANOVA. Os dados foram apresentados como média e desvio padrão. As barras de erro nos gráficos representam o desvio padrão. As correlações entre as variáveis foram determinadas pelo coeficiente de correlação de Pearson. Os experimentos foram realizados em triplicata e repetidos três vezes. Os dados dos experimentos com cardiomiócitos de rato foram normalizados pelo número de células de cada grupo experimental. A α-tubulina foi o controle interno para o teste Western blot. O gene U6 foi o controle interno do qRT-PCR. Um p <0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

Resposta celular reduzida em miR-34a e miR-125b no coração humano diabético

Para avaliar os papéis dos miRNAs no coração humano diabético, foram examinados os níveis de expressão do miR-34a e do miR-125b em tecidos cardíacos humanos obtidos de 20 pacientes com insuficiência cardíaca diabética e 20 doadores saudáveis. As expressões do miR-34a e do miR-125b tiveram resposta celular significativamente reduzida nos tecidos cardíacos com insuficiência cardíaca diabética em comparação com os de doadores saudáveis (Figura 1A e 1B). Esses resultados sugerem uma função protetiva do miR-34a e do miR-125b na insuficiência cardíaca mediada por glicose alta.

Figura 1. Resposta celular reduzida em miR-34a e miR-125b no coração humano diabético induzida por hiperglicemia. (A) Expressões de miR-34a e (B) miR-125b no coração humano normal e em tecidos cardíacos diabéticos. (C) Cardiomiócitos de ratos foram tratados com glicose alta ou de controle em 5, 10 ou 20 mM. As expressões relativas do miR-34a e (D) do miR-125b foram avaliadas por PCR em tempo real e normalizadas aos níveis de snRNA U6. As colunas são a média de três experimentos independentes; as barras de erro nos gráficos representam o DP. **, p < 0,01; ***, p < 0,001.

Figura 1

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A glicose alta de curto prazo estimula as expressões de miR-34a e miR-125b em cardiomiócitos de ratos neonatos

Para avaliar o efeito do miR-34a e do miR-125b na disfunção de cardiomiócitos causada por glicose alta, foi estabelecido um modelo in vitro utilizando cardiomiócitos de rato isolados em cultura em condições normal e de glicose alta. É interessante notar que, em curto prazo (1 hora), detectou-se que o miR-34a e miR-125b foram significativamente induzidos por uma concentração de glicose alta de 25 ou 50 mM (Figura 1C e 1D). Entretanto, em condições de hiperglicemia de longo prazo (48 horas, 50 mM), os cardiomiócitos sofreram morte celular (dados não mostrados). Tomados em conjunto, os resultados acima demonstraram um aumento de miR-34a e miR-125b por hiperglicemia em cardiomiócitos.

A superexpressão de miR-34a e miR-125b protege contra a morte celular de cardiomiócitos causada por hiperglicemia

Sabia-se que a hiperglicemia poderia desencadear uma reação inflamatório e causar a morte celular de cardiomiócitos (4). Dessa forma, foi considerada a hipótese de a superexpressão exógena miR-34a e miR-125b poder proteger contra a morte celular de cardiomiócitos causada por hiperglicemia. Os cardiomiócitos de ratos foram cotransfectados com pré-miR-34a e pré-miR-125b por 48 horas. Os resultados do qRT-PCR demonstraram que as expressões de miR-34a e miR-125b foram aumentadas em até 5-10 vezes (Figura 2A). Em seguida, as células foram expostas a 25 ou 50 mM de glicose para simular a hiperglicemia por 48 horas. Como esperado, cardiomiócitos transfectados de miRNAs de controle apresentaram, obviamente, morte celular com o tratamento por hiperglicemia (Figura 2B). Entretanto, cardiomiócitos com superexpressão de miR-34a e miR-125b mostraram-se significativamente resistentes à hiperglicemia, tanto pelo ensaio MTT e pelo ensaio de atividade de Caspase-3 (Figura 2B e 2C). Esses resultados demonstraram um papel protetivo do miR-34a e do miR-125b na morte celular de cardiomiócitos causada por hiperglicemia.

Figura 2. A superexpressão de miR-34a e miR-125b protege contra morte celular de cardiomiócitos causada por hiperglicemia (A) Cardiomiócitos primários de ratos foram transfectados com microRNA de controle, ou pré-miR-34a mais miR-125b por 72 horas. As expressões de miR-34a e miR-125b foram medidas por qRT-PCR. (B) Cardiomiócitos primários de ratos foram transfectados com microRNA de controle, ou pré-miR-34a mais miR-125b por 72 horas, as células foram expostas em condições de glicose normal ou alta (25 mM ou 50 mM) por 48 horas. O índice de apoptose celular foi medido pelo ensaio de MTT e (C) ensaio de atividade de Caspase-3. As colunas são a média de três experimentos independentes; as barras de erro nos gráficos representam o DP. *, p < 0,05; **, p < 0,01; ***, p < 0,001.

Figura 2

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Inibição da glicólise pelo miR-34a e o miR-125b em hiperglicemia ao atingir LDHA e HK2

Em condições de glicose alta, as células apresentaram um aumento no metabolismo da glicose.6,7 Para investigar os mecanismos subjacentes aos papéis do miR-34a e do miR-125b durante o tratamento de hiperglicemia, foi feita a revisão da literatura e foram encontrados estudos recentes que mostram que tanto o miR-34a quanto o miR-125b poderiam inibir o metabolismo da glicose intracelular.15,16 Portanto, levantou-se a hipótese de que a inibição da glicólise intracelular ativada por hiperglicemia pelo miR-34a e pelo miR-125b contribui para a proteção dos cardiomiócitos contra a morte celular. Para avaliar os efeitos inibitórios do miR-34a e do miR-125b na glicólise em hiperglicemia, foram medidas a captação de glicose e a produção de lactato de cardiomiócitos com ou sem superexpressão de miRNAs em tratamento com glicose normal ou alta. A superexpressão do miR-34a e do miR-125b inibiu a captação de glicose e a produção de lactato em glicose normal (Figura 3A e 3B). Além disso, os cardiomiócitos com miR-34a e miR-125b altos também apresentaram glicólise altamente diminuída, próxima aos níveis normais (Figura 3A e 3B), sugerindo que a superexpressão de miR-34a e miR-125b em condições de hiperglicemia contribui para a manutenção da homeostase da glicose intracelular. Para verificar os alvos diretos do miR-34a e do miR-125b nos cardiomiócitos, foram detectadas as expressões proteicas de LDHA, que é um alvo previsto do miR-34a, e de HK2, cuja 3’UTR poderia ser atingida diretamente pelo miR-125b (Figura 4A). Os resultados do teste de Western Blot demonstraram consistentemente que os níveis de HK2 e LDHA foram suprimidos pela superexpressão de miR-34a e miR-125b em condições de glicose normal ou hiperglicemia (Figura 4B). Foram verificados, além disso, os alvos do miR-34a e do miR-125b em tecido cardíaco humano. De maneira consistente, em miR-34a e miR-125b, cuja expressão é relativamente alta em tecidos cardíacos normais, os níveis de HK2 e LDHA de mRNA foram aparentemente baixos (Figura 4C). A mesma correlação negativa entre miR-34a e LDHA, e entre miR-125b e HK2 foi observada em tecidos cardíacos diabéticos (Figura 4D). Em geral, os dados confirmam que o miR-34a e o miR-125b inibem a glicólise intracelular atingindo enzimas que limitam a velocidade da glicólise, contribuindo para a manutenção da homeostase da glicose em hiperglicemia.

Figura 3. A superexpressão de miR-34a e miR-125b afeta o metabolismo da glicose induzido por hiperglicemia. (A) Cardiomiócitos primários de ratos foram transfectados com microRNA de controle, ou pré-miR-34a mais miR-125b por 72 horas, as células foram expostas em condições de glicose normal ou alta (25 mM) por 48 horas. A captação de glicose e (B) a produção de lactato foram medidas. As colunas são a média de três experimentos independentes; as barras de erro nos gráficos representam o DP. *, p < 0,05; **, p < 0,01; ***, p < 0,001.

Figura 3

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Figura 4. O miR-34a e o miR-125b atingem enzimas da glicólise em cardiomiócitos e tecidos cardíacos. (A) ilustração da LDHA 3’UTR e da HK2 3’UTR, bem como da sequência de semeadura de miR-34a e miR-125b, mostrando a região alvo prevista por computação na 3’UTR dos mRNAs da LDHA e HK2. (B) Cardiomiócitos de ratos foram transfectados com 25 nM de precursores de miR-34a e miR-125b por 72 horas. A superexpressão do miR-34a e do miR-125b teve resposta celular reduzida de expressões proteicas de LDHA e HK2 condições de glicose normal e alta. A α-tubulina foi um controle de carregamento. (C) Correlação negativa entre miR-34a e expressões de mRNA de LDHA em tecidos cardíacos humanos normais. (D) Correlação negativa entre miR-125b e expressões de mRNA de HK2 em tecidos cardíacos humanos normais.

Figura 4

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A restauração de LDHA e HK2 sensibiliza os cardiomiócitos à glicose alta

Por fim, para testar se a proteção de cardiomiócitos em hiperglicemia foi causada diretamente pela inibição da glicólise por miR-34a e miR-125b, foram realizados experimentos de resgate por cotransfecção de plasmídeos de superexpressão de LDHA e HK2 em cardiomiócitos de superexpressão de miR-34a e miR-125b. Os resultados do teste de Western Blot (Figura 5A) demonstraram que a cotransfecção de plasmídeos conseguiu resgatar com sucesso as expressões de LDHA e HK2 em cardiomiócitos de superexpressão de miR-34a e miR-125b. Além disso, a captação de glicose (Figura 5B) e a produção de lactato (Figura 5C) também foram trazidas a níveis normais pela restauração de LDHA e HK2. As células transfectadas acima foram expostas a 50 mM de glicose para simular a hiperglicemia por 48 horas. As células foram coletadas e submetidas a teste de morte celular. Como esperado, os cardiomiócitos com resgate de LDHA e HK2 apresentaram aumento de morte celular em hiperglicemia, em comparação com os índices dos cardiomiócitos com superexpressão de miR-34a e miR-125b (Figura 5D). Esses experimentos de resgate confirmaram a homeostase da glicose intracelular mediada por miR-34a e miR-125b em cardiomiócitos protegidos diretamente por hiperglicemia.

Figura 5. A restauração de glicólise em cardiomiócitos de ratos com superexpressão de miR-34a e miR-125b promove a morte celular em hiperglicemia. (A) Os cardiomiócitos de ratos foram transfectados com mistura de miR-34a e miR-125b sozinhos ou cotransfectados com miR-34a e plasmídeos de superexpressão de miR-125b e plasmídeos de superexpressão de LDHA e HK2 por 72 horas. As células foram tratadas com ou sem glicose alta (25 mM) por 48 horas e submetidas à a análise de Western Blot. A α-tubulina foi um controle de carregamento. (B) Os cardiomiócitos de ratos foram transfectados com mistura de miR-34a e miR-125b sozinhos ou cotransfectados com miR-34a e plasmídeos de superexpressão de miR-125b e plasmídeos de superexpressão de LDHA e HK2 por 72 horas. As células foram tratadas com ou sem glicose alta (25 mM) por 48 horas. A captação de glicose e (C) a produção de lactato foram medidas. (D) Os cardiomiócitos de ratos foram transfectados com mistura de miR-34a e miR-125b sozinhos ou cotransfectados com miR-34a e plasmídeos de superexpressão de miR-125b e plasmídeos de superexpressão de LDHA e HK2 por 72 horas. As células foram tratadas com ou sem glicose alta (50 mM) por 48 horas. A morte celular foi avaliada pelo ensaio de MTT. As colunas são a média de três experimentos independentes; as barras de erro nos gráficos representam o DP. *, p < 0,05; **, p < 0,01; ***, p < 0,001.

Figura 5

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Discussão

A CMD é uma das principais ameaças à saúde de pacientes com diabetes.1,2 Ela está associada a eventos patofisiológicos complexos, incluindo inflamação crônica, morte de células cardíacas, que podem levar à insuficiência cardíaca. A respostas cardíaca inicial ao diabetes foi a morte de cardiomiócitos apoptóticos.3 Neste estudo, relatou-se um mecanismo de proteção de cardiomiócitos mediados por microRNA em condições de hiperglicemia. Cardiomiócitos de ratos foram tratados com glicose alta e detectou-se aumento significativo de glicólise, um processo regulado pelo aumento adaptativo de miR-34a e miR-125b, indicando que atingir o miR-34a e o miR-125b no metabolismo da glicose causado por hiperglicemia pode contribuir para o desenvolvimento de um método terapêutico de proteção contra a morte de células cardíacas.

Glicose e a resistência aguda a insulina foram detectadas em problemas cardíacos agudos.4 Além disso, o metabolismo de glicose intracelular alta foi reconhecido como um marcador prognóstico potencial em síndromes coronárias agudas.17 A associação entre hiperglicemia e CMD foi estudada exaustivamente.18 A sinalização metabólica de insulina anormal, a hiperglicemia, e disfunção mitocondrial e o stress oxidativo são os mecanismos patofisiológicos envolvidos no desenvolvimento da CMD mais notórios.18 Atualmente, os mecanismos moleculares subjacentes que resultam em CMD não são suficientemente entendidos. Estudos recentes indicam que os microRNAs desempenham papéis essenciais na etiologia do diabetes e suas complicações.11 Além disso, relatou-se que o miR-125b e o miR-34a estão associados ao stress oxidativo de tecidos cardíacos, levando à inibição de morte celular de cardiomiócitos.11 Em cânceres, já foi relatado que o miR-34a e o miR-125b diminuíram e inibiram o metabolismo da glicose,15,19 o que sugere que o miR-34a e o miR-125b poderiam regular as células disfuncionais em condições de hiperglicemia. Os resultados demonstraram que miR-34a e miR-125b tiveram resposta celular significativamente reduzida no em tecidos cardíacos humanos diabéticos, em comparação com normais. Além disso, detectou-se que o miR-34a e o miR-125b eram estimulados de forma adaptativa em cardiomiócitos de ratos em condições de glicose alta, sugerindo que o miR-34a e o miR-125b pode suprimir o metabolismo da glicose intracelular causado por hiperglicemia. Já se sabia que o miR-34a poderia atingir a 3’UTR de mRNA de LDHA20 e que a HK2 era um alvo direto do miR-125b em células cancerígenas.19 Este estudo tem algumas limitações na confirmação dos efeitos dos miRNAS na proteção de CMD de dados in vivo. Os dados, entretanto, revelaram, pela primeira vez, que o miR-34a e a HK2 poderiam suprimir a captação de glicose e a produção de lactato em cardiomiócitos. A superexpressão do miR-34a e do miR-125b contribuiu para a manutenção do metabolismo da glicose intracelular em condições de hiperglicemia (Figura 3).

Conclusão

Em resumo, este estudo demonstrou que o miR-34a e o miR-125b estão significativamente correlacionados à CMD humana. Utilizando um modelo de cardiomiócitos de ratos in vitro, a hiperglicemia estimula, de forma adaptativa, as expressões do miR-34a e do miR-125b. A superexpressão de miR-34a e de miR-125b suprimiu o metabolismo da glicose intracelular induzida por hiperglicemia atingindo LDHA e HK2, o que resultou na inibição da morte celular de cardiomiócitos induzida por hiperglicemia. Conjuntamente, os dados revelaram os possíveis papéis desempenhados pelo miR-34a e pelo miR-125b na patogênese da cardiomiopatia induzida por hiperglicemia. Nosso trabalho futuro focará em um modelo de rato diabético in vivo para investigar os mecanismos moleculares do miR-34a e do miR-125b na CMD.

Footnotes

Fontes de financiamento

O presente estudo não teve fontes de financiamento externas.

Vinculação acadêmica

Não há vinculação deste estudo a programas de pós-graduação.

References

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Arq Bras Cardiol. 2021 Mar 3;116(3):415–422. [Article in English]

Inhibiting Glucose Metabolism By miR-34a and miR-125b Protects Against Hyperglycemia-Induced Cardiomyocyte Cell Death

Chao-rui Xu 1, Qiu-ju Fang 2,✉

Abstract

Background:

It is well-known that insulin resistance and hyperglycemia are important pathological causes for the development of diabetic cardiomyopathy (DCM). However, its precise molecular mechanisms in the pathogenesis of DCM remain unclear.

Objectives:

Recent studies reveal that microRNAs (miRNA) play essential roles in the pathogenesis of DCM. This project aimed to determine the roles of miR-34a and miR-125b in hyperglycemia-induced cardiomyocyte cell death.

Methods:

Rat primary cardiomyocytes were isolated and exposed to normal and high concentrations of glucose. Cell viability was measured using MTT assay. Expressions of miR-34a and miR-125b were detected by qRT-PCR. Potential targets of miR-34a and miR-125b were predicted from www.Targetscan.org and validated from human heart tissues. A statistical significance of p<0.05 was considered.

Results:

The present study shows that miR-34a and miR-125b are downregulated in a human diabetic heart. Moreover, in vitro data from rat primary cardiomyocytes showed that short-term high glucose treatment stimulates miR-34a and miR-125b expressions. Under high glucose, it was found that rat cardiomyocytes displayed increased intracellular glucose metabolism, and glucose uptake and lactate production were significantly increased. It was also found that the key glucose metabolic enzymes, Hexokinase 2 (HK2) and Lactate dehydrogenase-A (LDHA), were direct targets of miR-125b and miR-34a, respectively. Overexpression of miR-125b and miR-34a could prevent hyperglycemia-induced cardiomyocyte cell death. Finally, the restoration of HK2 and LDHA in miR-125b and miR-34a overexpressed cardiomyocytes recovered the cardiomyocytes’ sensitivity to hyperglycemia.

Conclusion:

Our results proposed a molecular mechanism for the microRNA-mediated diabetic cardiovascular protection and will contribute to developing treatment strategies for diabetes-associated cardiovascular dysfunction.

Keywords: Hiperglycemia; Glicose Metabolism Disordes; Cell Death; Diabetic Cardiomyopathies; Myocytes,Cardiac; Rats

Introduction

Diabetic cardiomyopathy (DCM), which is associated with an increased incidence of heart failure in diabetic patients, is a chronic and irreversible heart complication.1,2 It is characterized by complicated pathophysiologic changes in the structure and function of the myocardium, including early diastolic dysfunction, ventricular dilation, and cardiac hypertrophy.2,3 DCM is promoted by factors which are independent from coronary artery disease (CAD), such as insulin resistance in heart tissue, compensatory hyperinsulinemia, and hyperglycemia.4 Currently, the precise mechanisms resulting in DCM are still under investigation.

High glucose plays an important role in several diabetic complications including DCM through the induction of inflammatory reactions.5 Following uptake by cells, glucose is broken down into pyruvate/lactate, a process called anerobic glycolysis.6 Glycolysis is regulated at several rate-limiting steps, such as glucose uptake, glucose phosphorylation, and conversion of pyruvate into lactate or Acetyl-CoA.7 Recent studies reported high glucose inhibition by irisin could influence the development of DCM by regulating the endothelial to mesenchymal transition (EndMT),8 suggesting tha tblocking glycolysis may benefit DCM patients. In addition, another study illustrated metallothione, an antioxidant, could inhibit the hyperglycemia-induced oxidative stress, resulting in the suppression of DCM.9 The above reports indicate blocking the hyperglycemia could prevent the DCM. Thus, a better understanding of DCM’s pathophysiology will greatly benefit early diagnosis and the treatment for diabetes-associated cardiovascular dysfunction.

MicroRNA, a small (~20-25 nt) and highly conserved non-coding RNA, has proved to play critical roles in cardiac remodeling and the development of heart failure,10,11 suggesting a potentially therapeutic target for the diagnosis and treatment of DCM. Among microRNAs, which have been reported to be significantly altered during DCM, miR-34a tends be upregulated during DCM,11 while miR- 125b is known to be associated with hypertrophic growth,12 indicating that miR-34a and miR-125 are involved in the development of DCM. However, whether miR-125b and miR-34a could regulate the hyperglycemia-induced cardiomyopathy remains unclear. Therefore, the present study seeks to investigate the potential role and mechanism of miR-34a and miR-125b in hyperglycemia-induced cardiomyocyte dysfunction, suggesting a new therapeutic strategy in the management of DCM.

Methods

Rat cardiomyocyte culture

The isolation of rat cardiomyocytes was performed following prior study.13 Briefly, rat cardiomyocytes were collected from day two postnatal rat hearts. In total, eight rats were dissected, and the isolated/cultured cardiomyocytes from all rat hearts were pooled. All experiments were performed using the same cells from the pool. The cardiomyocytes were further identified by staining the smooth muscle actin, sarcomeric alpha-actinin, and tropomyosin. The cardiomyocytes were cultured with specific cardiomyocyte medium (Catalog No. 6201; ScienCell), according to manufacturer’s instructions. The culture medium was refreshed every 24 hours. Seventy-two hours later, cell culture medium was changed to serum-free Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM, Catalog No. 31600-034; Invitrogen Corporation, Grand Island, NY, USA), together with 10% Fetal Bovine Serum (FBS) and 1% penicillin/streptomycin in a humidified atmosphere of 5% CO2 at 37°C. Rat cell experiments were performed in triplicate and repeated three times. The animal experiments were performed after having received approval from the Animal Ethical Review Board of Heilongjiang Province Hospital (No. AHPH-201711-06).

Human heart tissue samples

Human heart tissue samples were obtained from failing human hearts with DCM (20 cases) at the time of transplant at the Heilongjiang Province Hospital. Tissues were frozen immediately in liquid nitrogen and were then stored at -80°C until use. Normal hearts (20 cases) were obtained from healthy donors without transplants and stored by the same procedures. Human tissue collection was performed after having received approval from the Ethical Review Board of Heilongjiang Province Hospital (No. PH-201706-2H). Informed consent was obtained from all patients.

Plasmid DNA and microRNA precursor transfection

MiR-34a precursor, miR-125b precursor, and negative control were purchased from Genepharma (Shanghai, China). MicroRNA precursors and negative control microRNA were transfected at 50 nM. Cells were seeded in 6-well plates at 105 densities 24 h prior to transfection. Transfection was performed using the Lipofectamine RNAiMax Transfection Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) according to the manufacturer’s instructions. After 72 h, the cells were collected for downstream analysis. Overexpression vectors containing human ORF LDHA, or HK2, were purchased from Origene Technologies Inc. (Rockville, MD) and 4 ug of plasmid was transfected using the Lipofectamine 2000 transfection reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) according to the manufacturer’s protocol. Cells were collected after 48 hours for downstream analysis.

Glucose uptake and lactate production

The glucose uptake assay was performed using the Glucose Uptake Colorimetric Assay Kit (#MAK083) from Sigma (Shanghai, China), according to manufacturer’s instructions. The lactate production was detected using the Lactate Assay Kit (#MAK064) from Sigma (Shanghai, China), according to manufacturer’s instructions. Data were normalized by the cell numbers of each experimental group. Assays were performed in triplicate and repeated three times.

Detection of cardiomyocyte cell death

The cardiomyocyte cell death was investigated by the MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay and verified by direct Trypan blue staining. Briefly, 24 hours after treatments with high glucose, the cell culture medium was replaced with 200 μl fresh medium and 20 μL of 5 mg/mL MTT (Sigma, #M5655) was put into the rat cardiomyocytes for 2 hours at 37°C. The culture medium was completely removed, and 100 µL of DMSO was added. Plates were put on an orbital shaker for 5 minutes at room temperature. The absorbance, at optical density (OD) of 590 nm, was measured. This absorbance was normalized by cell numbers of each well. Each experiment was performed in triplicate and repeated three times.

Quantitative RT-PCR

Total RNA was isolated from tissue and cardiomyocyte cells, using the TRIzol Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA) according to manufacturer’s instructions. After DNase treatment, the quality of the RNA was measured by NanoDrop. To detect the miRNAs, a polyA tail was conjugated to the RNase-free DNase digested RNA, and qRT-PCR was performed using the qRT-PCR miRNA Detection Kit (Applied Biosystems), following manufacturer’s instructions. Human U6 served as an internal control. Quantitative polymerase chain reaction (qPCR) was performed using SYBR Green Taq ReadyMix (Sigma) on an Applied Biosystems7500 PCR system. Results were analyzed using the 2−ΔΔCt method and normalized to U6 expression. All qRT-PCR assays were performed with the Bio-Rad IQTM5 Multicolour Real-Time PCR Detection System. Experiments were performed in triplicate and repeated three times.

Target prediction

The potential targets of miR-125b and miR-34a were computationally predicted by the TargetScan program (http://www.targetscan.org/).

Western blot analysis

Western blot analysis was performed to assess the expressions of HK2 and LDHA proteins. Cell lysates from rat cardiomyocytes were extracted using RIPA Lysis and Extraction Buffer (#89900, Thermo Scientific, Shanghai, China). Protein concentration was determined by applying the Bradford method, as previously described.14 An equal amount of protein sample was loaded on a 10% SDS-PAGE gel, followed by electrophoresis, and transferred onto a nitrocellulose membrane. Membranes were blocked by 5% BSA for one hour at room temperature. After complete washing by TBST, the blots were incubated with primary antibodies, all from Cellsignaling Technology (Danvers, MA, USA) (HK2, #2867; LDHA, #3582 and α-tubulin, #2125) at 1:1000 for overnight at 4°C. Membranes were washed and incubated with respective secondary antibodies at 1:3000 for 1 hour at room temperature. Bands were detected by chemiluminescence developing agents (SuperSignal, Thermo Scientific). Results were repeated three times, and representative figures were shown.

Statistical analysis

Statistical analysis was performed using the GraphPad Prism 5 software (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA). The unpaired Student’s t-test was used for data analysis between two groups. The significance among three or more groups was analyzed by ANOVA. Data was presented as mean and standard deviation. The error bars in graphs represented standard deviation. Correlations between variables were determined by Pearson’s correlation coefficient. Experiments were performed in triplicate and repeated three times. Data from rat cardiomyocyte experiments were normalized by the cell number of each experimental group. α-tubulin was an internal control for Western blot. U6 was an internal control for qRT-PCR. A p<0.05 was considered statistically significant.

Results

Down-regulation of miR-34a and miR-125b in a human diabetic heart

To evaluate the roles of miRNAs in a human diabetic heart, miR-34a and miR-125b expression levels were examined in human heart tissues obtained from 20 patients with diabetic heart failure and 20 healthy donors. The expressions of miR- 34a and miR-125b were significantly downregulated in heart tissues with diabetic heart failure, when compared with those from healthy donors (Figure 1A and 1B). These results suggest a protective role of miR-34a and miR-125b during high glucose-mediated heart failure.

Figure 1. Down-regulation of miR-34a and miR-125b in a human diabetic heart, induced by hyperglycemia. (A) Expressions of miR-34a and (B) miR-125b in a normal human heart and diabetic heart tissues. (C) Rat cardiomyocytes were treated with control or high glucose at 5, 10, or 20 mM. The relative expressions of miR-34a and (D) miR-125b were assessed by real-time PCR and normalized to U6 snRNA levels. Columns, mean of three independent experiments; the error bars in graphs represented SD. **, p < 0.01; ***, p < 0.001.

Figure 1

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Short-term high glucose stimulates miR-34a and miR-125b expressions in neonatal rat cardiomyocytes

To evaluate the effect of miR-34a and miR-125b in high glucose-induced cardiomyocyte dysfunction, this study established an in vitro model using the isolated rat cardiomyocytes cultured under normal and high glucose conditions. Interestingly enough, within a short period of time (1 hour), miR-34a and miR-125b were found to be significantly induced by 25 or 50 mM high glucose concentration (Figure 1C and 1D). However, under long time hyperglycemia (48 hours, 50 mM), cardiomyocytes underwent cell death (data not shown). Taken together, the above results revealed an adaptive upregulation of miR-34a and miR-125b by hyperglycemia in cardiomyocytes.

Overexpression of miR-34a and miR-125b protects against hyperglycemia-induced cardiomyocyte death

It is well-known that hyperglycemia can trigger inflammatory responses and induce cardiomyocyte cell death (4). It was therefore asked whether exogenous overexpressing miR-34a and miR-125b could protect against hyperglycemia-induced cardiomyocyte death. Rat cardiomyocytes were co-transfected with pre-miR-34a and pre-miR-125b for 48 hours. qRT-PCR results showed miR-34a and miR-125b expressions were increased by 5-10 folds (Figure 2A). Cells were then exposed to 25 or 50 mM glucose to mimic hyperglycemia for 48 hours. Expectedly, control miRNA transfected cardiomyocytes presented a clear cell death under HG treatment (Figure 2B). However, cardiomyocytes with miR-34a and miR-125b overexpression proved to be significantly resistant to HG when analyzed by both MTT assay and Caspase-3 activity assay (Figure 2B and 2C). These results demonstrated a protective role of miR-34a and miR-125b in HG-induced cardiomyocyte cell death.

Figure 2. Overexpression of miR-34a and miR-125b protects against hyperglycemia-induced cardiomyocytes death. (A) Rat primary cardiomyocytes were transfected with control microRNA, or pre-miR-34a plus miR-125b for 72 hours. The expressions of miR-34a and miR-125b were measured by qRT-PCR. (B) Rat primary cardiomyocytes were transfected with control microRNA, or pre-miR-34a plus miR-125b for 72 hours; cells were exposed under normal or high glucose (25 mM or 50 mM) for 48 hours. The cell apoptosis rate was measured by MTT assay and (C) Caspase-3 activity. Columns, mean of three independent experiments; the error bars in graphs represented SD. *, p < 0.05; **, p < 0.01; ***, p < 0.001.

Figure 2

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Inhibition of glycolysis by miR-34a and miR-125b under hyperglycemia by targeting LDHA and HK2

Under high glucose, cells exhibited an increased cellular glucose metabolism.6,7 To investigate the mechanisms underlining the roles of miR-34a and miR-125b during HG treatments, a literature review was performed and recent studies were found that showed both miR-34a and miR-125b could inhibit intracellular glucose metabolism.15,16 Thus, it was hypothesized that the inhibition of the HG-activated intracellular glycolysis by miR-34a and miR-125b contributes to protecting cardiomyocytes against cell death. To assess the inhibitory effects of miR-34a and miR-125b on glycolysis under hyperglycemia, the glucose uptake and lactate production of cardiomyocytes with or without miRNAs overexpression were measured in normal or high glucose treatments. Overexpression of miR-34a and miR-125b inhibited glucose uptake and lactate production under normal glucose (Figure 3A and 3B). In addition, cardiomyocytes with high miR-34a and miR-125b also displayed significantly decreased glycolysis, close to the normal levels (Figure 3A and 3B), suggesting that an overexpression of miR-34a and miR-125b under hyperglycemia contributes to the maintenance of intracellular glucose homeostasis. To verify the direct targets of miR-34a and miR-125b in cardiomyocytes, we detected the protein expressions of LDHA, which is a predicted target of miR-34a and HK2, the 3’UTR of which could be directly targeted by miR-125b (Figure 4A). Western blot results consistently showed the protein levels of HK2 and LDHA were suppressed by an overexpression of miR-34a and miR-125b under both normal and HG conditions (Figure 4B). The targets of miR-34a and miR-125b were further verified in human heart tissues. In a consistent manner, in miR-34a and miR- 125b, whose expression is relatively high in normal heart tissues, the mRNA levels of HK2 and LDHA were apparently low (Figure 4C). The same negative correlation between miR-34a and LDHA, miR-125b, and HK2 was observed in diabetic heart tissues (Figure 4D). In general, our data support that the miR-34a and miR-125b inhibit intracellular glycolysis by targeting glycolysis speed limited enzymes, contributing to the maintenance of glucose homeostasis under hyperglycemia.

Figure 3. Overexpression of miR-34a and miR-125b impairs hyperglycemia-induced glucose metabolism. (A) Rat primary cardiomyocytes were transfected with control microRNA, or pre-miR-34a plus miR-125b for 72 hours; cells were exposed under normal or high glucose (25 mM) for 48 hours. Glucose uptake and (B) lactate production were measured. Columns, mean of three independent experiments; the error bars in graphs represented SD. *, p < 0.05; **, p < 0.01; ***, p < 0.001.

Figure 3

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Figure 4. miR-34a and miR-125b target glycolysis enzymes in cardiomyocytes and heart tissues. (A) illustration of LDHA 3’UTR and HK2 3’UTR, as well as the seed sequence of miR-34a and miR-125b, showing the computationally predicted target region on the 3’UTR of LDHA and HK2 mRNAs. (B) Rat cardiomyocytes were transfected with 25 nM miR-34a plus miR-125b precursors for 72 h. Overexpression of miR-34a plus miR-125b downregulated LDHA and HK2 protein expressions under normal and high glucose conditions. α-Tubulin was a loading control. (C) Negative correlation between miR-34a and LDHA mRNA expressions in normal human heart tissues. (D) Negative correlation between miR-125b and HK2 mRNA expressions in normal human heart tissues.

Figure 4

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Restoration of LDHA and HK2 sensitizes cardiomyocyte to high glucose

Finally, to test whether the protection of cardiomyocytes under HG was directly caused by glycolysis inhibition by miR-34a and miR-125b, rescue experiments were performed by co-transfection of LDHA and HK2 overexpression plasmids into miR-34a and miR-125b overexpressing cardiomyocytes. Western blot results (Figure 5A) showed that the co-transfection of plasmids successfully rescued the LDHA and HK2 expressions in miR-34a and miR-125b overexpressing cardiomyocytes. Furthermore, the glucose uptake (Figure 5B) and lactate production (Figure 5C) were also recovered to normal levels by restoration of LDHA and HK2. The above transfected cells were exposed to 50 mM glucose to mimic hyperglycemia for 48 hours. Cells were collected and subjected to cell death assay. As expected, cardiomyocytes with LDHA and HK2 rescue showed significantly increased cell death under hyperglycemia, as compared to that of miR-34a and miR-125b overexpressing cardiomyocytes (Figure 5D). These rescue experiments supported the miR-34a and miR-125b-mediated intracellular glucose homeostasis in hyperglycemia directly protected by cardiomyocytes.

Figure 5. Restoration of glycolysis in miR-34a and miR-125b overexpressed rat cardiomyocyte promotes cell death under hyperglycemia. (A) Rat cardiomyocytes were transfected with miR-34a plus miR-125b mixture alone or co-transfected with miR-34a plus miR-125b and LDHA plus HK2 overexpression plasmids for 72 hours. Cells were then treated with or without high glucose (25 mM) for 48 hours and subjected to Western blot analysis. α-Tubulin was a loading control. (B) Rat cardiomyocytes were transfected with miR-34a plus miR-125b mixture alone or co-transfected with miR-34a plus miR-125b and LDHA plus HK2 overexpression plasmids for 72 hours. Cells were then treated with or without high glucose (25 mM) for 48 hours. Glucose uptake and (C) lactate production were measured. (D) Rat cardiomyocytes were transfected with miR-34a plus miR-125b mixture alone or co-transfected with miR-34a plus miR-125b and LDHA plus HK2 overexpression plasmids for 72 hours. Cells were then treated with or without high glucose (50 mM) for 48 hours. Cell death was assessed by MTT assay. Columns, mean of three independent experiments; the error bars in graphs represented SD. *, p < 0.05; **, p < 0.01; ***, p < 0.001.

Figure 5

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Discussion

DCM is one of the major health threats in patients with diabetes.1,2 It is associated with complex pathophysiologic events, including chronic inflammation and cardiac cell death, eventually resulting in heart failure. The early cardiac response to diabetes was apoptotic cardiomyocyte death.3 The present study reported on a microRNA-mediated cardiomyocyte protection mechanism under hyperglycemia. Rat cardiomyocytes were treated with high glucose, identifying a significant increased glycolysis, a process regulated by the adaptively upregulated miR-34a and miR-125b, indicating that the targeting of hyperglycemia-induced glucose metabolism by miR-34a and miR-125b might contribute to the development of a therapeutic method to protect against cardiac cell death.

Glucose and acute insulin resistance have been found in acute cardiac conditions.4 Furthermore, high intracellular glucose metabolism has been recognized as a potential prognostic marker in acute coronary syndromes.17 The association between hyperglycemia and DCM has been extensively studied.18 Abnormal insulin metabolic signaling, hyperglycemia, mitochondrial dysfunction, and oxidative stress are the most recognized pathophysiological mechanisms involved in the development of DCM.18 Currently, the underlying molecular mechanisms resulting in DCM are poorly understood. Recent studies have shown that microRNAs play essential roles in the etiology of diabetes and its complications.11 Moreover, miR-125b and miR-34a have proven to be associated with the oxidative stress of cardiac tissues, leading to prevent against cardiomyocytes cell death.11 In cancers, miR-34a and miR-125b have been reported to downregulate and inhibit glucose metabolism,15,19 suggesting that miR-34a and miR-125b could regulate the dysfunctional cells under hyperglycemic conditions. Our results demonstrated that miR-34a and miR-125b were significantly downregulated in human diabetic heart tissues, when compared with a normal heart. It was also found that miR-34a and miR-125b were adaptively stimulated under high glucose conditions in rat cardiomyocytes, suggesting that miR-34a and miR-125b might suppress the hyperglycemia-induced intracellular glucose metabolism. It is well-known that miR-34a could target 3’UTR of LDHA mRNA20 and that HK2 is a direct target of miR-125b in cancer cells.19 This study has some limitations in confirming the effects of the miRNAs on the DCM protection from in vivo data. Our data, however, has, for the first time, revealed that miR-34a and HK2 could suppress glucose uptake and lactate production in cardiomyocytes. Overexpression of miR-34a and miR-125b contributed to the maintenance of intracellular glucose metabolism under hyperglycemic conditions (Figure 3).

Conclusion

In summary, the present study demonstrated that miR-34a and miR-125b were significantly correlated with human DCM. Using an in vitro rat cardiomyocytes model, hyperglycemia adaptively stimulated miR-34a and miR-125b expressions. The overexpression of miR-34a and miR-125b suppressed high glucose-induced intracellular glucose metabolism by targeting LDHA and HK2, resulting in the prevention of the hyperglycemia-induced cardiomyocyte cell death. Taken together, this study serves to reveal the potential roles of miR-34a and miR-125b in the pathogenesis of hyperglycemia-induced cardiomyopathy. Our future work will focus on an in vivo rat diabetic model to investigate the molecular mechanisms of miR-34a and miR-125b in DCM.

Footnotes

Sources of Funding

There were no external funding sources for this study.

Study Association

This study is not associated with any thesis or dissertation work.

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