Abstract
目的
观察淫羊藿苷对 Masquelet 技术治疗大鼠胫骨骨缺损后诱导膜内血管化及其相关生物活性因子 TGF-β1 和 bFGF 表达的影响，探讨淫羊藿苷在 Masquelet 技术修复骨缺损中的作用。
方法
将 60 只 3 月龄 Wistar 雄性大鼠随机分为 3 组，每组 20 只，建立右后肢 6 mm 长胫骨骨缺损模型。空白组（A 组）骨缺损处不作处理；对照组（B 组）和实验组（C 组）将处于拉丝期的去甲万古霉素抗生素骨水泥填充于骨缺损处，待骨水泥完全凝固。C 组从术后第 1 天开始每天给予淫羊藿总黄酮注射液稀释液（10 μmol/L）灌胃 1 次（0.3 mL），A、B 组予以等量生理盐水灌胃。观察实验动物术后恢复及切口愈合情况；术后 4 周摄 X 线片观察胫骨近端骨缺损处恢复情况；术后 6 周大体观察骨缺损处情况，并取材观察肉芽组织及诱导膜组织形态变化及其血管化程度，免疫组织化学染色观察及 ELISA 检测 TGF-β1、bFGF 表达。
结果
3 组大鼠骨缺损模型均造模成功，术后无异常，切口均Ⅰ期愈合。术后 4 周胫骨近端骨缺损处 X 线片示 A 组有明显空隙，B、C 组为骨水泥充填、克氏针固定良好。术后 6 周大体观察示，A 组可见缺损区被肉芽组织充填；B、C 组可见透明薄膜形成，部分区域可见微血管，且 C 组薄膜及微血管明显多于 B 组。免疫组织化学染色示 A 组 TGF-β1、bFGF 表达均为阴性，B、C 组均有表达且 B 组表达明显少于 C 组。ELISA 检测示，C 组 TGF-β1、bFGF 表达水平显著高于 A、B 组（P<0.05）；A、B 组间比较差异均无统计学意义（P>0.05）。
结论
淫羊藿苷在大鼠胫骨骨缺损模型形成诱导膜时可显著提高 TGF-β1 及 bFGF 的表达，加速成骨过程，有利于骨质塑形与改建。
Keywords: 骨缺损, 淫羊藿苷, Masquelet技术, 成骨活性, TGF-β1, bFGF
Abstract
Objective
To observe the expressions of transforming growth factor β1 (TGF-β1) and basic fibroblast growth factor (bFGF) induced membrane by Masquelet technique in rats treated with glycoside of short-horned epimedium Herb, and to explore the effect of glycoside of short-horned epimedium Herb on Masquelet induced membrane.
Methods
Sixty 3-month-old male Wistar rats were randomly divided into 3 groups with 20 rats in each group; a tibial bone defect (6 mm in length) model was established. The blank group (group A) was not treated; the control group (group B) and the experimental group (group C) were filled with vancomycin antibiotic bone cement in the drawing stage, and the bone cement was completely solidified. Group C was given perfused flavonoids glycoside of short-horned epimedium Herb (10 μmol/L) by gavage once a day (0.3 mL) from 1 day after operation, and groups A and B were given the same amount of normal saline by gavage. After operation, the recovery and wound healing of experimental animals were observed; at 4 weeks after operation, X-ray film was taken to observe the recovery of bone defect of proximal tibia; at 6 weeks after operation, the bone defect was observed, and the morphological changes and vascularization degree of granulation tissue and induction membrane tissue were observed; the expressions of TGF-β1 and bFGF were observed by immunohistochemistry staining and ELISA detection.
Results
The bone defect models of the 3 groups were established successfully, and there was no abnormality after operation. The incisions healed by first intention after operation. At 4 weeks after operation, X-ray films of proximal tibial defect showed that there was obvious space in group A, while bone cement was filled and Kirschner wire fixation was good in groups B and C. At 6 weeks after operation, the gross observation showed that the granulation tissue was filled in the defect area in group A; transparent membrane was formed in groups B and C, and microvessels were seen in some areas, and the microvessels in group C were significantly more than those in group B. Immunohistochemical staining showed that the expressions of TGF-β1 and bFGF were negative in group A, but they were expressed in groups B and C, and the expressions of TGF-β1 and bFGF in group B were significantly less than those in group C. ELISA detection showed that the expressions of TGF-β1 and bFGF in group C were significantly higher than those in groups A and B (P<0.05), but there was no significant difference between groups A and B (P>0.05).
Conclusion
Glycoside of short-horned epimedium Herb can significantly increase the expressions of TGF-β1 and bFGF, accelerate the process of osteogenesis, and contribute to bone shaping and reconstruction.
Keywords: Bone defect, glycoside of short-horned epimedium Herb, Masquelet technique, osteogenic activity, transforming growth factor β1, basic fibroblast growth factor
临床上各种原因造成的大段骨缺损一直是骨科治疗难题。淫羊藿是中医骨伤科常用药物，为补命门、益精气、强筋骨、补肾壮阳之要药。药理实验表明，淫羊藿能增加心脑血管血流量，促进造血功能、免疫功能及骨代谢，具有抗衰老、抗肿瘤等功效；临床常用于治疗肾虚腰痛、筋骨折伤等疾病[1-2]。其有效成分淫羊藿苷对新骨形成及骨修复具有显著促进作用[3-4]。自 2000 年 Masquelet 报道采用一期抗生素骨水泥填充、二期植骨治疗大段骨缺损获得优良临床效果以来，该方法逐渐受到临床医师的关注，但也存在治疗时间长、骨质塑形慢等问题。在 Masquelet 技术一期和二期两个阶段中，骨修复再生的基础是诱导膜形成，目前关于淫羊藿苷对诱导膜形成期的影响鲜见报道。通过调节内源性细胞因子提高诱导膜微血管化程度，可以作为促进后期植骨血管化和骨再生的突破口。
本研究通过制备大鼠胫骨骨缺损模型，应用 Masquelet 技术治疗后再进行淫羊藿药物干预，观察诱导膜内血管化及其相关生物活性因子 TGF-β1 和 bFGF 的变化，为淫羊藿苷在诱导膜技术修复骨缺损中的应用提供实验依据。
1. 材料与方法
1.1. 实验动物及主要试剂、仪器
SPF 级 3 月龄健康 Wistar 雄性大鼠 60 只，体质量 180～200 g，由河南省实验动物中心提供，全部大鼠均适应性饲养 1 周后开始实验。实验动物使用许可证号：SYXK（豫）2015-0001。
淫羊藿苷（成都曼斯特生物科技有限公司）；淫羊藿总黄酮注射液（深褐色液体，含 20 mg/mL 淫羊藿苷，总黄酮含量为 88%；北京世佳研究中心提供）；去甲万古霉素抗生素骨水泥（Palacos 公司名，德国）；苏木素-伊红染色液（北京雷根生物技术有限公司）；大鼠 TGF-β1 和 bFGF 的 ELISA 试剂盒（上海通蔚科技有限公司）；组织脱水机、染色机（上海五相仪器仪表有限公司）；BX53 生物显微镜（Olympus 公司，日本）；超净工作台（浙江苏净净化设备有限公司）。
1.2. 实验分组及方法
将 60 只大鼠按随机数字表法分为 3 组，每组 20 只。所有大鼠腹腔注射戊巴比妥（5 mg/kg）麻醉后，仰卧位固定于超净工作台上。于右后肢胫骨中段外侧作一长约 2 cm 纵切口，逐层切开分离，显露胫骨干骨质，分离周围肌肉组织，用手外科电动摆锯截取长约 6 mm 骨质，将 1.5 cm 克氏针由骨缺损远近端插入胫骨髓腔。空白组（A 组）骨缺损处不作处理；对照组（B 组）和实验组（C 组）将处于拉丝期的去甲万古霉素抗生素骨水泥填充于骨缺损处，待骨水泥完全凝固，冲洗并缝合切口。术后各组大鼠均连续 3 d 腹腔注射青霉素钠（8 万 U/d）预防感染，常规饲料喂养。术后第 1 天开始，C 组每天淫羊藿总黄酮注射液稀释液（10 μmol/L）灌胃 1 次（0.3 mL）[5]，A、B 组予以等量生理盐水灌胃。
1.3. 观测指标
1.3.1. 大体观察
术后观察实验动物围术期恢复及切口愈合情况；术后 4 周摄 X 线片观察胫骨近端骨缺损恢复情况；术后 6 周所有动物腹腔注射戊巴比妥（5 mg/kg）麻醉后于原切口处切开，大体观察骨缺损处肉芽组织及诱导膜组织形态变化及其血管化程度。
1.3.2. 免疫组织化学染色观察
术后 6 周大体观察后，取各组大鼠骨缺损处组织进行连续切片，片厚 4～5 μm，常规脱蜡至水。用 0.01 mol/L 柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）高压热修复抗原，PBS 冲洗 2 次，每次 5 min；30 mL/L H2O2 阻断内源性过氧化物酶 10 min，PBS 冲洗 2 次，每次 5 min；滴加 TGF-β1、bFGF 一抗 4℃ 过夜，PBS 冲洗 2 次，每次 5 min；滴加二抗和三抗，PBS 各冲洗 2 次，每次 5 min；DAB 显色 5～20 min，有满意阳性结果时终止染色；蒸馏水冲洗 10 min，PBS 冲洗 2 次，每次 5 min；苏木素复染 2 min，BX53 生物显微镜下观察适时终止；梯度系列乙醇脱水、二甲苯透明各 5 min、树脂封片，生物显微镜下观察。
1.3.3. ELISA 法检测血清 TGF-β1和 bFGF 表达
术后 6 周于动物腹腔取血静置 30 min 以上，4℃ 以离心半径 10 cm、2 500 r/min 离心 20 min，轻轻吸取上层血清，采用 ELISA 法检测大鼠血清 TGF-β1、bFGF 水平。
1.4. 统计学方法
采用 SPSS18.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 SNK 检验；检验水准α=0.05。
2. 结果
2.1. 大体观察
3 组大鼠骨缺损模型均造模成功，术后无异常，切口均Ⅰ期愈合。术后 4 周 X 线片观察示，A 组胫骨近端骨缺损处能观察到明显空隙；B、C 组胫骨近端骨缺损处骨水泥充填，克氏针固定良好。见图 1。术后 6 周大体观察示，A 组可见缺损区被肉芽组织充填；B、C 组可见透明薄膜形成，部分区域可见微血管，且 C 组骨水泥上薄膜和微血管明显多于 B 组。见图 2。
图 1.
X-ray films of each group at 4 weeks after operation
术后 4 周各组 X 线片
a. A 组；b. B 组；c. C 组
a. Group A; b. Group B; c. Group C
图 2.
General observation of each group at 6 weeks after operation
术后 6 周各组大体观察
a. A 组；b. B 组；c. C 组
a. Group A; b. Group B; c. Group C
2.2. 免疫组织化学染色观察
A 组 TGF-β1、bFGF 表达均为阴性。TGF-β1、bFGF 在 B、C 组均有表达，B 组表达明显少于 C 组。见图 3。
图 3.
Immunohistochemical observation of each group at 6 weeks after operation (Biomicroscope×20)
术后 6 周各组免疫组织化学染色观察（生物显微镜×20）
从左至右依次为 A、B、C 组 a. TGF-β1；b. bFGF
From left to right for groups A, B, and C, respectively a. TGF-β1; b. bFGF
2.3. ELISA 检测
C 组 TGF-β1、bFGF 表达水平显著高于 A、B 组，差异均有统计学意义（P<0.05）；A、B 组间比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见表 1。
表 1.
The expressions of serum TGF-β1 and bFGF detected by ELISA in 3 groups at 6 weeks after operation (n=20,
, pg/mL)
ELISA 检测术后 6 周各组大鼠血清中 TGF-β1、bFGF 表达水平（n=20，
，pg/mL）
| 组别
Group |
TGF-β1 | bFGF |
|
*与 A 组比较P<0.05，#与 B 组比较P<0.05
*Compared with group A, P<0.05;#compared with group B, P<0.05 | ||
| A | 1 803.67±11.53 | 52.40±1.48 |
| B | 1 858.46±9.93 | 56.63±2.36 |
| C | 2 548.62±39.48*# | 94.01±3.86*# |
| 统计值
Statistic |
F=5 777.249
P=0.000 |
F=1 389.559
P=0.000 |
3. 讨论
对于较大范围长骨干骨缺损，常用治疗方法有带血管的自体骨移植技术、Ilizarov 骨搬移技术、Masquelet 技术，3 种方法各有优缺点。带血管的自体骨移植技术需要作血管显微吻合，且容易出现受区应力性骨折及供区并发症；而且其适用于骨缺损范围较小的患者，当骨缺损>6 cm 时，采用该方法重建骨干后骨愈合是不完全的，还容易出现植骨块吸收的情况。虽然 Ilizarov 骨搬移技术适应证较广泛，尤其适用于合并软组织缺损和感染的患者，但骨缺损愈合时间较长，术后护理不便，常需多次手术，并发症较多，如钉道感染、松动，关节粘连僵硬，神经损伤，对合端偏移等；该技术治疗后骨不愈合发生率较高，并且需要特殊的复杂装置。Masquelet 技术可用于修复创伤后骨缺损、恶性肿瘤切除术后的骨缺损、骨髓炎性骨缺损等，还可用于骨骺、干骺端、足跗骨、下颌骨等长骨骨干以外的骨缺损；尤其对于感染引起的骨缺损，骨水泥中混入万古霉素可有效控制感染，优势较其他方法明显。
Masquelet 技术分两期进行，一期首先对骨缺损区彻底清创，将聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥混入抗生素，塑形为棒状填充连接骨断端，用软组织包裹骨水泥，缝合筋膜和皮肤，并用外固定架固定骨缺损两端。一期术后 6～8 周软组织愈合良好、感染控制的情况下，二期手术去除外固定架，切开软组织及形成的诱导膜，小心取出骨水泥以免损伤诱导膜，打通纤维膜两端，使骨髓腔与膜囊腔相通，同时在膜囊腔内填满切碎的自体松质骨或骨替代材料。动物实验表明[6]，诱导膜上有垂直于骨长轴方向密集排列的小血管系统，还能分泌促进成骨的生长因子，如 TGF-β1、bFGF、VEGF 等。VEGF 不仅可促进膜内皮细胞增殖，还可促进成骨细胞的增殖与分化，为骨的生长提供营养，并促进骨再生；TGF-β1 可促进成骨细胞的新陈代谢和细胞外基质的合成；bFGF 可促进骨的再生与修复。因此，在骨生长区形成的诱导膜可以诱导出更强的骨重建。Gouron 等[7]在动物模型中发现，诱导膜囊腔内有破骨细胞及破骨前体细胞，这些细胞可能有助于骨重建。
近年来大量研究表明淫羊藿苷有益于骨损伤愈合[8-10]，抑制破骨细胞活性同时促进成骨细胞增殖，在骨伤科应用较多。国内外许多学者已从分子水平对淫羊藿苷的作用机制进行了深入研究，淫羊藿苷具有减少骨吸收、促进骨形成、增加骨密度的作用[11-12]；还能增加骨痂厚度，提高骨折愈合质量，增加 TGF-β1 等因子在骨痂组织中的表达[13]。高子范等[14]研究认为，淫羊藿注射液对鸡胚胫骨有促进作用，用药组骨长度、干重和渗透度均明显增加，且能促进蛋白质的合成。本研究应用 Masquelet 技术治疗后再进行淫羊藿药物干预，观察诱导膜内血管化及其相关生物活性因子 TGF-β1 和 bFGF 的变化，为淫羊藿苷在 Masquelet 技术修复骨缺损中的应用提供实验依据。结果发现，与对照组比较，实验组中淫羊藿苷能使诱导膜组织内 bFGF、TGF-β1 表达显著上升，与临床治疗情况一致。
目前已有研究证实[15-16]，诱导膜内微血管系统与成骨细胞分化增殖密切相关，这对二期植骨后的新骨形成意义重大。基于此，我们下一步将对淫羊藿苷促进诱导膜微血管化的具体分子调控机制进行深入分析，而微血管化如何影响 Masquelet 技术后期骨再生修复的机制也需要进一步研究。
作者贡献：丁强负责实验实施及文章撰写；孙楠负责数据收集整理；王孝辉负责实验设计及统计学分析。
利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。课题经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。
Funding Statement
2018 洛阳市科技计划医疗卫生项目（1830003A）；2019 洛阳市科技计划医疗卫生项目（1930002A）
Medical Project of 2018 Luoyang Science and Technology Research Plan (1830003A); Medical Project of 2019 Luoyang Science and Technology Research Plan (1930002A)
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