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. 2020 May;34(5):637–642. [Article in Chinese] doi: 10.7507/1002-1892.201909061

自体注射型富血小板纤维蛋白联合 BMSCs 治疗大鼠坐骨神经损伤的实验研究

Experimental study on autologous injectable platelets rich fibrin combined with bone mesenchymal stem cells in treating sciatic nerve injury in rats

Haiming GAO 1, Bo WANG 1, Jiaquan CAO 1, Xiujun LI 1, Chenyi HUANG 1, Jiaqi WU 1,*, Zongchao LIU 1,*
PMCID: PMC8171844  PMID: 32410433

Abstract

Objective

To investigate the effectiveness of autologous injectable platelet rich fibrin (i-PRF) combined with bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) for sciatic nerve injury in rats.

Methods

BMSCs were isolated and cultured from tibial bone marrow of Sprague Dawley (SD) neonatal rats aged 10-15 days and passaged to the 4th generation. i-PRF was prepared from posterior orbital venous blood of adult SD rats by improved low-speed centrifugation. Twenty-four adult SD rats were selected and randomly divided into 4 groups with 6 rats in each group after the sciatic nerve Ⅲ degree injury model was established by modified crush injury method. Groups A, B, C, and D were injected with BMSCs suspension+autologous i-PRF, autologous i-PRF, BMSCs suspension, and normal saline, respectively. The Basso-Beattie-Bresnahan (BBB) score was used to evaluate the recovery of neurological function of the affected limb of rats every week from 1 to 8 weeks after operation. At 2 months after operation, the rats were sacrificed and the histological changes of sciatic nerve were observed by HE staining. The microstructural changes of nerve fibers, myelin sheath, and nucleus were observed by transmission electron microscope. The expressions of N-cadherin, Nestin, and glial fibrillary acidic protein (GFAP) were detected by Western blot.

Results

No immune rejection or death occurred in the rats after operation. There was no significant difference in BBB scores between groups at 1 week after operation (P>0.05); at 2-8 weeks after operation, BBB scores in group A were significantly higher than those in groups B, C, and D, and in groups B, C than in group D (P<0.05), there was no significant difference between groups B and C (P>0.05). HE staining showed that the nerve fibers in group A arranged in order, without defect or demyelination; the nerve fibers in group B were not clear and slightly swollen; some of the nerve fibers in group C were disordered and demyelinated; the nerve fibers in group D were not continuous, obviously demyelinated, and some of the nerve adventitia damaged. Transmission electron microscope showed that the structure of nerve fibers in group A was clear, myelin sheath was complete, and nucleus was dense; group B was slightly less than group A; group C had fuzzy structure, demyelination, and hollowing out; group D had disorder structure, demyelination, and hollowing out, and the middle part of nerve adventitia continuity. Western blot detection results showed that there was no significant difference in the relative expression of Nestin between groups (P>0.05). The relative expression of N-cadherin was significantly lower in groups B, C, and D than in group A, in groups C and D than in group B, and in group D than in group C (P<0.05). The relative expression of GFAP was significantly lower in groups B, C, and D than in group A, in group D than in groups B and C (P<0.05); there was no significant difference between groups B and C (P>0.05).

Conclusion

Autologous i-PRF combined with BMSCs can effectively treat sciatic nerve tissue injury in rats.

Keywords: Neural tissue engineering, injectable platelet rich fibrin, bone marrow mesenchymal stem cells, nerve injury, rat

周围神经损伤后病理过程极其复杂，神经细胞再生速度缓慢、再生神经与周围组织粘连、神经肌肉萎缩及运动终板退化变性等因素均制约着损伤神经组织的恢复，是显微外科面临的临床难题之一[1]。干细胞移植目前已成为一种新的治疗神经系统疾病途径，其中 BMSCs 作为种子细胞之一，在周围神经损伤修复中起重要作用[2-3]。但其仍存在很多不足，如体外培养的 MSCs 归巢能力下降，移植后细胞生存能力不足等。随着血小板浓缩生物材料的发展，注射型富血小板纤维蛋白（injectable platelet rich fibrin，i-PRF）被研发并应用于临床[4]。与富血小板血浆相比，i-PRF 能释放更多的细胞因子，如 TGF-β1、VEGF、bFGF 等，诱导 MSCs 及成纤维细胞分化的潜力更大[5]。本研究拟分析 i-PRF 与 BMSCs 联合使用修复大鼠坐骨神经损伤的疗效，以期为临床治疗周围神经损伤提供理论依据。

1. 材料与方法

1.1. 实验动物及主要试剂、仪器

10～15 日龄 SD 乳鼠 6 只，体质量（30±5）g；2 月龄 SD 大鼠 24 只，体质量（210±15）g；雌雄不限，均购自西南医科大学动物实验中心。

DMEM 培养基（HyClone 公司，美国）；FBS（BI 公司，以色列）；PBS 缓冲液、TBS 缓冲液、BCA 蛋白浓度检测试剂盒、RIPA 裂解液、蛋白酶抑制剂、SDS-PAGE 配胶试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；小鼠抗人 β-catenin、N-cadherin、巢蛋白（Nestin）、胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）单克隆抗体（Abcam 公司，英国）；山羊抗小鼠 Dylight 488 二抗（BD 公司，美国）；聚偏氟乙烯膜（Millipore 公司，美国）。倒置相差显微镜（Olympus 公司，日本）；酶标仪（Hach 公司，美国）；电泳仪、电转仪、凝胶成像仪（Bio-Rad 公司，美国）；透射电镜（Hitachi 公司，日本）。

1.2. 大鼠 BMSCs 分离、培养及传代

取 6 只乳鼠脱颈法处死后暴露出双侧胫骨骨髓腔，用 1 mL 注射器吸取 DMEM 培养基从干骺端进针冲洗骨髓，于离心管中反复吹打成细胞悬液。按照本课题组既往使用的密度梯度离心法[6]进行细胞分离、培养及传代。培养后 3 周可获得纯化的第 4 代 BMSCs 群。见图 1。

图 1.

图 1

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Morphology observation of the 4th generation BMSCs (Inverted phase contrast microscope×100)

第 4 代 BMSCs 形态学观察（倒置相差显微镜×100）

1.3. i-PRF 的制备

按照文献［7-8］报道的改良低速离心法制备 i-PRF。操作步骤：用眼眶采血法采集 24 只 2 月龄 SD 大鼠静脉血 3 mL/只于无抗凝剂的专用真空管，低速（60×g）离心 3 min 得到介于顶部浆液层和底部红细胞层之间的 i-PRF。由于离心管内不含二氧化硅促凝成分，离心后是液体形式的血小板产物，i-PRF 不必使用抗凝血剂，因此必须在纤维蛋白凝块形成之前 15 min 内使用。见图 2。

图 2.

Preparation of i-PRF by improved low-speed centrifugation

改良低速离心法制备 i-PRF

a. 离心前；b. 离心后

a. Before centrifugation; b. After centrifugation

图 2

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1.4. 实验分组及方法

将上述 24 只 2 月龄 SD 大鼠随机分为 A、B、C、D 4 组，每组 6 只。采用 Gigo-Benato 等[9]的改良挤压损伤法制作大鼠坐骨神经Ⅲ度损伤模型。具体方法：以 3% 戊巴比妥（1 mL/100 g）腹腔注射麻醉大鼠，随机选取一侧后肢后侧以 4% 硫化钠脱毛，无菌操作下将术侧坐骨神经暴露于分叉点处，止血钳于第 2 个齿痕上挤压约 45 s，造成宽度为 2 mm 的挤压伤，患处神经形态呈扁薄状。见图 3。造模成功后，A、B、C、D 组分别于损伤部位鞘膜内注射 BMSCs 悬液+自体 i-PRF、自体 i-PRF、BMSCs 悬液、生理盐水各 500 μL，其中 BMSCs 悬液浓度为（1.0～2.0）×105 个/100 μL。常规缝合切口及预防感染处理，术后观察大鼠健康状态及排斥反应。

图 3.

Sciatic nerve injury model established by improved crush injury method

改良挤压损伤法制备大鼠坐骨神经损伤模型

箭头示宽度约 2 mm 的扁状挤压伤

Arrow indicated a flat crush injury with a width of about 2 mm

图 3

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1.5. 观测指标

1.5.1. 大鼠神经功能评估

术后 1～8 周每周采用 BBB 评分法[10]评价大鼠患肢神经功能恢复情况。

1.5.2. HE 染色观察

术后 2 个月以脱颈法处死各组大鼠，获取术侧坐骨神经组织，以 10% 多聚甲醛室温下固定标本 24 h，梯度乙醇脱水，石蜡包埋切片，二甲苯脱蜡后 HE 染色观察各组大鼠坐骨神经组织结构变化。

1.5.3. 透射电镜观察

取上述部分坐骨神经组织，经 3% 戊二醛预固定、1% 四氧化锇再固定、丙酮逐级脱水后，先后经脱水剂和环氧树脂（型号为 Epon812）渗透液渗透，比例分别为 3∶1、1∶1、1∶3，每步 30～60 min。将渗透好的样品块置入适当模具中，包埋后超薄切片机切片（片厚 50 nm），醋酸铀、枸橼酸铅依次染色 15～20 min，透射电镜观察各组大鼠坐骨神经组织神经纤维、髓鞘、细胞核等细微结构改变。

1.5.4. Western blot 检测相关蛋白表达

将各组坐骨神经组织以 PBS 缓冲液漂洗后剪碎，加入配制好的 RIPA 裂解液，匀浆器匀浆收集于离心管中，冰上震荡 30 min；然后于 4℃ 下以 12 000×g 离心 10 min，取上清液经 BCA 法测定蛋白含量并计算上样量；配制 SDS-PAGE 凝胶后上样进行电泳，电泳结束后转膜，随后脱脂奶粉封闭 2 h。分别加入小鼠抗人 β-catenin（1∶2 000）、N-cadherin（1∶1 000）、Nestin（1∶1 000）、GFAP（1∶1 000）单克隆抗体，4℃ 冻库中孵育过夜；TBST 漂洗 10 min×3 次；加入辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶3 000），置于脱色摇床上低速震荡孵育 2 h；TBST 漂洗 10 min×3 次。用凝胶成像系统检测各蛋白及内参 β-actin 表达条带的灰度值，以各蛋白条带灰度值与内参条带灰度值的比值作为各蛋白的相对表达量。

1.6. 统计学方法

采用 SPSS19.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，以 Levene 法行方差齐性检验，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 Bonferroni 法；检验水准 α=0.05。

2. 结果

2.1. 术后大体观察

术后 1 d 各组大鼠均出现患肢活动困难、进食减少、精神欠佳等症状；术后 2 d 各组大鼠开始正常进食、进水，精神正常，对各种刺激反应灵敏，伤口未见明显红肿、渗液。实验期间未出现大鼠死亡情况。

2.2. 大鼠神经功能评估

术后 1 周各组大鼠 BBB 评分比较差异无统计学意义（P>0.05）；随着时间推移，各组 BBB 评分均呈上升趋势，其中 A 组上升趋势最明显，B、C 组次之，D 组最不明显。术后 2～8 周，A 组 BBB 评分显著高于 B、C、D 组，B、C 组显著高于 D 组，差异均有统计学意义（P<0.05）；B、C 组间差异无统计学意义（P>0.05）。见图 4。

图 4.

图 4

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BBB scores of each group at different time points after operation

术后各时间点各组 BBB 评分

2.3. HE 染色观察

HE 染色示，A 组神经纤维排列整齐，无缺损及脱髓鞘改变；B 组神经纤维结构欠清晰，轻度肿胀；C 组神经纤维部分结构紊乱，局部脱髓鞘改变；D 组神经纤维连续性欠佳，明显脱髓鞘改变，神经外膜部分缺损。见图 5。

图 5.

HE staining observation of each group at 2 months after operation (×200)

术后 2 个月各组 HE 染色观察（×200）

a. A 组；b. B 组；c. C 组；d. D 组

a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D

图 5

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2.4. 透射电镜观察

A 组神经纤维结构清晰，髓鞘完整，细胞核致密；B 组结构较 A 组模糊；C 组神经纤维结构明显模糊，有脱髓鞘改变；D 组神经纤维结构紊乱，有脱髓鞘改变，神经外膜连续性中断。见图 6。

图 6.

Transmission electron microscope observation of each group at 2 months after operation (×5 000)

术后 2 个月各组透射电镜观察（×5 000）

a. A 组；b. B 组；c. C 组；d. D 组

a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D

图 6

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2.5. Western blot 检测相关蛋白表达

各组 Nestin 蛋白相对表达量比较差异均无统计学意义（P>0.05）。B、C、D 组 N-cadherin 蛋白相对表达量显著低于 A 组，C、D 组显著低于 B 组，D 组低于 C 组，差异均有统计学意义（P<0.05）。B、C、D 组 GFAP 蛋白相对表达量显著低于 A 组，D 组显著低于 B、C 组，差异有统计学意义（P<0.05）；B、C 组间差异无统计学意义（P>0.05）。见图 7。

图 7.

Western blot detection of each group at 2 months after operation

术后 2 个月各组 Western blot 检测

a. 电泳图　1：A 组　2：B 组　3：C 组　4：D 组；b. 各蛋白相对表达量

a. Electrophoregram 1: Group A 2: Group B 3: Group C 4: Group D; b. Relative expressions of each protein

图 7

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3. 讨论

由于神经损伤后组织重塑，微环境发生不可逆变化，神经组织修复和/或再生的固有能力受到抑制，因此外周神经损伤治疗成为临床难题[11]。虽然国内外学者利用电刺激、NGF 等方式对周围神经损伤进行治疗获得一定疗效，但总体效果仍不满意[12-13]。近年来，以神经支架、种子细胞（如 MSCs）和神经营养因子作为三大要素的神经组织工程的发展，为周围神经损伤治疗带来了新突破。细胞疗法是组织工程最重要的分支之一，其中将细胞材料注射到患者体内以启动再生过程是常用的治疗手段[14]。BMSCs 是一种具有自我更新、多向分化及分泌效应的多能干细胞，其可通过旁分泌集落刺激因子、干细胞生长因子、内皮细胞生长因子及多种 IL 等，调控炎症反应，抑制细胞凋亡，促进血管形成，招募内源性干细胞，促进组织修复[15-16]。近年研究还发现，多种干细胞均可分泌外泌体，以促进神经再生修复[17-18]。但由于周围神经再生的局部微环境和血供特点不能为 MSCs 提供长效的营养支持[19]，尚不能体现上述干细胞的优越性。

前期对富血小板血浆的研究中，我们发现其富含的大量生长因子可为组织修复重建提供充足营养支持，但其为凝胶状态，在损伤组织中的流动性较差，在组织损伤处不能全面均匀分布，限制了其组织修复能力[20]。为此本实验选用流体状态的第 2 代血小板浓缩生物制剂 i-PRF 与 BMSCs 联合使用，于损伤神经组织处鞘膜内注射，术后 2 个月大鼠神经功能学、组织学观察以及Western blot 检测结果均优于其余各对照组，与实验预期一致。我们认为其机制可能与 i-PRF 释放 bFGF、TGF-β、VEGF 等生长因子和一定量干细胞有关。其中 bFGF 作为一种高效的有丝分裂原，能促进 BMSCs 快速增殖及向成纤维样细胞迁移分化[21]；TGF-β 可以调节细胞增殖、黏附、迁移及分化，并能增加细胞外基质如Ⅱ型胶原蛋白的表达[22]；VEGF 介导内皮细胞与细胞外基质的相互作用，可诱导 BMSCs 分化为血管平滑肌细胞，参与血管生成，促进血管重塑、成熟[23]，促进受损神经组织血供恢复。以上各生长因子相互交叉，相互协同，一方面促进 BMSCs 成神经细胞分化，另一方面为神经组织修复提供有利的局部环境。我们的研究结果也显示，BMSCs 组对神经组织的修复差于 i-PRF 组，在一定程度上佐证了在周围神经组织缺乏血供及营养支持环境下，i-PRF对 BMSCs 提供生长因子及营养支持的必要性，但其具体作用机制仍需进一步研究阐明。

本研究联合使用大鼠自体 i-PRF 与 BMSCs 修复损伤坐骨神经，不仅可以减少免疫排斥反应，而且相对于其他诱导剂，i-PRF 不仅制备过程简便、快捷、利于临床推广，还在促进 BMSCs 成神经细胞分化的同时改善损伤神经组织局部微环境，促进神经组织快速修复，是本研究一大创新点。但值得注意的是，i-PRF 富含多种生长因子，不同生长因子对诱导 BMSCs 分化方向不同且具有剂量依赖性[24-25]。本研究中为避免再次伤害及增加感染风险，未进行 i-PRF 剂量调整，但结果仍与预期一致。我们认为一方面可能与神经组织内富含大量神经生长因子有关，神经组织中的生长因子与 i-PRF 中诱导 BMSCs 成神经细胞分化的相关因子（如 bFGF）在数量上占优势，故能引导分化方向，实现对损伤神经组织的修复；另一方面，BMSCs 对损伤灶的趋化性也可能发挥了协同作用[26-27]。

综上述，i-PRF 与 BMSCs 两者联合使用能发挥协同效应，进一步提高对大鼠周围神经组织的修复效果，但具体机制有待进一步研究明确。

作者贡献：高海明直接参与实验设计、实施，数据收集及统计分析，文章撰写；王波直接参与实验实施、数据收集及统计分析；曹家全直接参与实验实施及数据收集；李秀军参与数据统计分析；黄陈翼参与实验指导；刘宗超、吴佳奇设计实验，并对文章的知识性内容作批评性审阅。

利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。基金项目经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。

机构伦理问题：本研究方案获西南医科大学伦理委员会批准（2020-071）。实验动物使用许可证号：SYXK（川）2013-065。

Funding Statement

四川省卫生健康委员会项目（130280）

Contributor Information

佳奇 吴 (Jiaqi WU), Email: wujiaqi15@163.com.

宗超 刘 (Zongchao LIU), Email: 565409672@qq.com.

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