联合调控 Wnt 和 BMP 信号通路促进人源诱导多能干细胞分化为心肌细胞的实验研究

Abstract

目的

探讨联合调控 Wnt 和 BMP 信号通路在人源诱导多能干细胞（human induced pluripotent stem cells，hiPSCs）分化为心肌细胞中的作用。

方法

复苏 hiPSCs 培养，倒置相差显微镜下观察细胞形态，免疫荧光染色鉴定多能性标记物 OCT3/4、NANOG 和 TRA-1-60 表达；传代培养 hiPSCs，取 35 代以内细胞进行后续实验。待细胞融合接近 100% 时开始分化（记为分化第 0 天），加入 Wnt 通路激活剂 CHIR99021。于分化第 3 天加入不同浓度的 IWP4（Wnt 通路抑制剂），实时荧光定量 PCR 检测心肌细胞特异性标记物肌钙蛋白 T（troponin T，TNNT2）mRNA 表达，筛选 IWP4 最佳浓度；在不同时间点加入最佳浓度 IWP4，通过比较 TNNT2 mRNA 表达筛选最佳作用时间。然后，在加入 CHIR99021 和 IWP4 基础上于分化第 5 天加入不同浓度 BMP-4 以及不同时间点加入 BMP-4，通过检测 TNNT2 mRNA 表达筛选 BMP-4 最佳浓度及最佳作用时间。最后，将 hiPSCs 分为 3 组，Wnt 调控组、BMP 调控组和 Wnt+BMP 联合调控组，在分化第 0 天加入 CHIR99021 基础上，分别按照筛选结果加入 IWP4、BMP-4、IWP4+BMP-4。收集分化第 7、15 天细胞，实时荧光定量 PCR 检测心肌前体细胞标记物 ISL1（ISL LIM homeobox 1）、NKX2-5（NK2 homeobox 5）以及心肌细胞特异性标记肌细胞增强因子 2C（myocyte enhancer factor 2C，MEF2C）、肌球蛋白轻链 2（myosin light chain 2，MYL2）、MYL7 及 TNNT2 mRNA 表达；收集分化第 28 天细胞，流式细胞术及免疫荧光染色检测心肌细胞特异性蛋白心肌肌钙蛋白 T（cardiac troponin T，cTnT）表达。

结果

细胞形态及免疫荧光染色观察显示 hiPSCs 表达多能性标记物 OCT3/4、NANOG 和 TRA-1-60，提示其具有良好的多能性特点。IWP4 促 hiPSCs 向心肌细胞分化的最佳浓度为 10.0 μmol/L（P<0.05），最佳作用时间是分化第 3 天（P<0.05）。BMP-4 促 hiPSCs 向心肌细胞分化的最佳浓度为 20.0 ng/mL（P<0.05），最佳作用时间是分化第 3 天（P<0.05）。Wnt+BMP 联合调控组 ISL1、NKX2-5 以及 MEF2C、MYL2、MYL7、TNNT2 mRNA 相对表达量，cTnT 阳性表达率，以及免疫荧光染色 cTnT 阳性表达和肌节结构，均优于 Wnt 调控组，相关定量指标差异均有统计学意义（P<0.05）。

结论

联合调控 Wnt 和 BMP 信号通路可以提高 hiPSCs 诱导分化为心肌细胞的效率。

心肌细胞在缺血缺氧坏死后很难再生，当大面积心肌细胞坏死危及患者生命时，常规治疗手段（如药物、介入及手术等）难以修复受损的心肌细胞，而心脏移植由于供体有限也无法广泛应用于临床^[1]。人源诱导多能干细胞（human induced pluripotent stem cells，hiPSCs）是具有类似于胚胎干细胞的全能性干细胞，能自主增殖和分化。由于 hiPSCs 可以由患者的体细胞重编程获取，从而避免了胚胎干细胞的伦理问题和移植后免疫排斥反应，逐渐成为干细胞生物学和临床再生/修复医学理想的种子细胞^[2-3]。研究发现 hiPSCs 分化而来的心肌细胞可以修复坏死的心肌组织，是目前挽救心肌坏死患者生命最有前景的治疗措施之一。

干细胞可以自然分化为心肌细胞，但比例极低，远远无法满足临床治疗需求。为此研究者尝试各种方法提高干细胞向心肌细胞的分化效率，如采用环孢菌素^[4]、维生素 C^[5]、抑瘤素 M^[6]等化学药物诱导，或者将干细胞接种在静电纺丝聚己内酯纳米纤维仿生支架上进行分化培养^[7]等。上述方法均可提高心肌细胞分化效率，但还有上升空间。为了获得稳定且高效的心肌细胞分化效率，研究者从胚胎心脏发育学角度进行探索，发现调控与胚胎心脏发育相关的通路来诱导干细胞向心肌细胞分化，可以获得相对稳定且较高的分化效率^[8-9]。在脊椎动物体内，心脏发育是多条信号通路联合调控的结果，其中 Wnt/β-catenin 和 BMP 信号通路发挥着重要作用^[10]。Wnt/β-catenin 是双相作用，早期发挥激活作用促进中胚层发育，随后发挥抑制作用促进中胚层向心肌前体细胞发育^[11]。BMP 信号通路在心脏左心室、瓣膜、流出道及心内膜垫等发育中发挥重要作用^[12-13]。研究显示将 Wnt 拮抗剂与 BMP 重叠表达于非洲爪蟾胚胎的前外侧区域，共同促进心脏发育^[14]。基于 Wnt/β-catenin 和 BMP 信号通路可协同促进心脏发育，本研究采用联合调控 Wnt 和 BMP 信号通路方法诱导 hiPSCs 向心肌细胞分化，以期为临床治疗心肌坏死的种子细胞来源提供方法学参考。

1. 材料与方法

1.1. 主要材料、试剂及仪器

hiPSCs（LHPB-YaabC3）、BioCISO hiPSCs 维持培养基（广州皓昇莱生物制药有限公司）；Matrigel 基质胶（Corning 公司，美国）；DMEM、RPMI1640、0.02% EDTA 溶液、0.25%胰蛋白酶-EDTA（GIBCO 公司，美国）；Wnt 通路抑制剂 IWP4（Selleck 公司，美国）；Wnt 通路激活剂 CHIR99021（StemCell 公司，加拿大）；BMP-4（Peprotech 公司，美国）；4% 多聚甲醛（上海碧云天生物技术有限公司）；RNA 提取试剂 Nucleo Zol（MN 公司，德国）；逆转录试剂盒（Toyobo 公司，日本）；荧光定量 PCR 试剂盒（Qiagen 公司，美国）；抗 OCT3/4、NANOG、TRA-1-60、Alexa Fluor594 标记抗兔二抗（Cell Signaling Technology 公司，美国）；抗心肌肌钙蛋白 T（cardiac troponin T，cTnT）抗体（Proteintech Group 公司，美国）；Alexa Fluor488 标记抗兔二抗、Alexa Fluor488 标记抗鼠二抗（Abcam 公司，美国）。

CO₂ 孵箱（SANYO 公司，日本）；倒置相差显微镜、荧光显微镜（Olympus 公司，日本）；实时荧光定量 PCR 仪、低温高速离心机（Thermo Fisher 公司，美国）；流式细胞仪（BD 公司，美国）；紫外分光光度仪（NanoDrop 公司，德国）；U-8 培养皿（Ibidi 公司，德国）。

1.2. hiPSCs 培养及鉴定

1.2.1. hiPSCs 培养

复苏 LHPB-YaabC3，BioCISO hiPSCs 维持培养基重悬后均匀接种在 Matrigel 包被的 6 cm 培养皿中，置于 37℃、5%CO₂ 孵箱中培养，每天更换培养基。待细胞融合达 50% 左右时，倒置相差显微镜观察细胞形态。待细胞融合达 80% 左右时传代至 12 孔板，取 35 代以内的 hiPSCs 用于后续实验。

1.2.2. 免疫荧光染色观察 hiPSCs 多能性标记物表达

取 hiPSCs 均匀接种至 U-8 培养皿中，置于 37℃、5%CO₂ 孵箱中孵育 36 h；吸弃细胞培养基，PBS 洗脱，4% 多聚甲醛固定 30 min，0.5%Triton X-100 通透 10 min，牛血清白蛋白封闭 30 min。加入一抗 OCT3/4（1∶200）、NANOG（1∶400）、TRA-1-60（1∶400），4℃ 过夜。Alexa Fluor488（1∶500）和 Alexa Fluor594（1∶500）标记二抗，避光孵育 1 h。DAPI 染核 10 min，荧光显微镜观察。

1.3. IWP4 促 hiPSCs 分化为心肌细胞的最佳浓度及作用时间筛选

1.3.1. IWP4 最佳浓度筛选

取 hiPSCs 按照 1.2×10⁵个/孔密度接种至 12 孔板，待细胞融合接近 100% 时（记为分化第 0 天），更换为 RPMI1640/B27（不含胰岛素；RPMI1640∶B27=50∶1）培养基，并加入 10 μmol/L CHIR99021^[15]作用 24 h 后，更换为 RPMI1640/B27（不含胰岛素）培养基；分化第 3 天分别加入浓度为 0、2.5、5.0、10.0 和 20.0 μmol/L 的 IWP4，培养 48 h 后再次更换为 RPMI1640/B27（不含胰岛素）培养基。分化第 7 天更换为 RPMI1640/B27（含胰岛素）培养基，以后每 3 天更换 1 次培养基。继续培养细胞至分化第 15 天，收集细胞行实时荧光定量 PCR 检测心肌细胞特异性标记物肌钙蛋白 T（troponin T，TNNT2）mRNA 表达，以最高表达对应浓度为 IWP4 最佳浓度。

检测方法：加入 0.25%胰蛋白酶-EDTA 消化细胞 15 min，中止消化，将细胞转移至无 RNA 酶 EP 管中，以离心半径 6 cm，4 500 r/min 离心 5 min 沉淀细胞，PBS 洗脱 1 次，加入 NucleoZol 细胞裂解液，按照说明书提取 RNA。紫外分光光度仪测定 RNA 浓度，按照逆转录试剂盒说明书取出 1 μg RNA，在 PCR 仪上将 RNA 逆转至 cDNA，将获得的 cDNA 稀释 3 倍。按照荧光定量 PCR 试剂盒说明书精准上样实时荧光定量 PCR 反应体系后进行检测。反应条件：94℃ 预变性 2 min，94℃ 变性 2 s，60℃ 退火/延伸 15 s，40 个热循环。熔解曲线：95℃、2 min，60℃、20 s，95℃、15 s，从 60℃ 缓慢加热到 99℃。以 GAPDH 作为内参，采用 2^–△△Ct 法检测 TNNT2 mRNA 相对表达量。引物序列见表 1。

表 1.

Primer sequence of real-time fluorescence quantitative PCR genes

实时荧光定量 PCR 各基因引物序列

基因 Gene	引物序列（5’→3’） Primer sequence (5’→3’)
TNNT2	上游 TTCACCAAAGATCTGCTCCTCGCT Forward 下游 TTATTACTGGTGTGGAGTGGGTGTGG Reverse
ISL1	上游 ATCAGGTTGTACGGGATCAAATG Forward 下游 ATGTGATACACCTTGGAGCG Reverse
NKX2-5	上游 CAAGTGTGCGTCTGCCTTT Forward 下游 CAGCTCTTTCTTTTCGGCTCTA Reverse
MEF2C	上游 AGCCCTGAGTCTGAGGACAA Forward 下游 GTGAGCCAGTGGCAATAGGT Reverse
MYL2	上游 ACATCATCACCCACGGAGAAGAGA Forward 下游 ATTGGAACATGGCCTCTGGATGGA Reverse
MYL7	上游 GAGGAGAATGGCCAGCAGGAA Forward 下游 GCGAACATCTGCTCCACCTCA Reverse
GAPDH	上游 GTGGACCTGACCTGCCGTCT Forward 下游 GGAGGAGTGGGTGTCGCTGT Reverse

1.3.2. IWP4 最佳作用时间筛选

实验分为 3 组。对照组细胞只在分化第 0 天加入 CHIR99021 作用 24 h；实验组 1、2 在分化第 0 天加入 CHIR99021 作用 24 h 基础上，分别于第 3、5 天加入最佳浓度 IWP4 作用 48 h，之后更换培养基继续培养。分化前 7 d 采用 RPMI1640/B27（不含胰岛素）培养基，分化第 7 天更换为 RPMI1640/B27（含胰岛素）培养基，以后每 3 天更换 1 次培养基。分化第 15 天收集细胞，同 1.3.1 方法行实时荧光定量 PCR 检测心肌细胞特异性标记物 TNNT2 mRNA 表达，以最高表达对应作用时间为 IWP4 最佳作用时间。

1.4. BMP-4 促 hiPSCs 分化为心肌细胞的最佳浓度及作用时间筛选

1.4.1. BMP-4 最佳浓度筛选

实验分为两部分。实验 1 在分化第 5 天分别加入浓度为 0、2.5、5.0、10.0、20.0、30.0 ng/mL 的 BMP-4 作用 48 h；实验 2 在分化第 0 天加入 CHIR99021 作用 24 h 以及最佳浓度 IWP4 作用 48 h 基础上，于分化第 5 天分别加入浓度为 0、2.5、5.0、10.0、20.0 和 30.0 ng/mL 的 BMP-4 作用 48 h；之后均更换为 RPMI1640/B27（含胰岛素）培养基继续培养。分化第 15 天收集细胞，同 1.3.1 方法行实时荧光定量 PCR 检测心肌细胞特异性标记物 TNNT2 mRNA 表达，以最高表达对应浓度为 BMP-4 最佳浓度。

1.4.2. BMP-4 最佳作用时间筛选

实验分为 4 组。对照组在分化第 0 天加入 CHIR99021 作用 24 h 以及最佳浓度 IWP4 作用 48 h；实验组 1、2、3 在分化第 0 天加入 CHIR99021 作用 24 h 以及最佳浓度 IWP4 作用 48 h 基础上，分别于分化第 3、5、7 天加入最佳浓度 BMP-4 作用 48 h，之后更换为 RPMI1640/B27（含胰岛素）培养基继续培养。分化第 15 天收集细胞，同 1.3.1 方法行实时荧光定量 PCR 检测心肌细胞特异性标记物 TNNT2 mRNA 表达，以最高表达对应作用时间为 BMP-4 最佳作用时间。

1.5. Wnt 和 BMP 通路对 hiPSCs 向心肌细胞分化的影响

1.5.1. 实验分组及方法

实验分为 3 组，分别为 Wnt 调控组、BMP 调控组、Wnt+BMP 联合调控组。其中，Wnt 调控组在分化第 0 天加入 CHIR99021 作用 24 h，然后于最佳作用时间加入最佳浓度 IWP4 作用 48 h；BMP 调控组于最佳作用时间加入最佳浓度 BMP-4 作用 48 h；Wnt+BMP 联合调控组分化第 0 天加入 CHIR99021 作用 24 h，然后按照最佳作用时间依次加入最佳浓度 IWP4 和 BMP-4 作用 48 h 后，更换培养基继续培养。分化前 7 d 加入 RPMI1640/B27（不含胰岛素）培养基，分化第 7 天更换为 RPMI1640/B27（含胰岛素）培养基，以后每 3 天换液 1 次，诱导 hiPSCs 向心肌细胞分化。

1.5.2. 实时荧光定量 PCR 检测

收集分化第 7 天细胞，按照 1.3.1 方法提取 RNA，检测心肌前体细胞标记物 ISL1（ISL LIM homeobox 1）和 NKX2-5（NK2 homeobox 5）mRNA 表达。收集分化第 15 天细胞，检测心肌细胞特异性标记物肌细胞增强因子 2C（myocyte enhancer factor 2C，MEF2C）、肌球蛋白轻链 2（myosin light chain 2，MYL2）、MYL7 及 TNNT2 mRNA 表达。各基因引物序列见表 1。

1.5.3. 流式细胞术检测

收集分化第 28 天细胞，4% 多聚甲醛室温固定 15 min，0.2%Triton X-100 通透细胞 15 min，0.5% 牛血清白蛋白/PBS 封闭细胞非特异性结合位点 15 min。添加 1∶200 比例稀释兔来源抗 cTnT 抗体，4℃ 孵育过夜（12～16 h）。添加 1∶500 比例稀释 Alexa Fluor488 标记抗兔二抗，室温避光孵育 30 min。0.5% 牛血清白蛋白/PBS 重悬细胞，100 μm 滤膜转移至上机管中（置于冰盒上，注意避光），上机进行检测。

1.5.4. 免疫荧光染色观察

收集分化第 28 天细胞，按照 1.2.2 方法行免疫荧光染色，观察心肌细胞特异性蛋白 cTnT 的表达。

1.6. 统计学方法

采用 GraphPad Prim 8 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 SNK 检验；两组间比较采用独立样本 t 检验；检验水准 α=0.05。

2. 结果

2.1. hiPSCs 形态观察及鉴定

倒置相差显微镜下见 hiPSCs 为成簇生长的克隆团，高倍镜下细胞紧密规则排列，细胞呈椭圆形、形态较小，细胞核大而明显，细胞质较少，核质比高。见图 1。

图 1.

Morphology observation of hiPSCs under inverted phase contrast microscope

倒置相差显微镜观察 hiPSCs

a. ×4；b. ×20

a. ×4; b. ×20

荧光显微镜下见 hiPSCs 多能性标记物 OCT3/4、NANOG 和 TRA-1-60 免疫荧光染色均为阳性。OCT3/4、NANOG 分布于细胞核中，能与 DAPI 染色的细胞核重合；TRA-1-60 分布在细胞核周围。见图 2。细胞形态学及免疫荧光染色观察结果提示 hiPSCs 具有良好的多能性特点。

图 2.

The expressions of pluripotent markers of hiPSCs by immunofluorescence staining (Fluorescence microscope×40)

免疫荧光染色观察 hiPSCs 多能性标记物表达（荧光显微镜×40）

从左至右依次为 DAPI 核染色、荧光染色及二者重叠　a. OCT3/4；b. NANOG；c.TRA-1-60

From left to right for DAPI nucleus staining, fluorescence staining, and merge　a. OCT3/4; b. NANOG; c. TRA-1-60

2.2. IWP4 促 hiPSCs 分化为心肌细胞的最佳浓度及作用时间筛选

2.2.1. IWP4 最佳浓度

IWP4 浓度为 10.0 μmol/L 时 TNNT2 mRNA 相对表达量最高，与 0、2.5、5.0、20.0 μmol/L 比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见图 3a。

图 3.

The relative expression of TNNT2 mRNA detected by real-time fluorescence quantitative PCR after adding IWP4

实时荧光定量 PCR 检测 IWP4 作用后 TNNT2 mRNA 相对表达量

a. IWP4 最佳浓度筛选；b. IWP4 最佳作用时间筛选

a. Screening of optimal concentration of IWP4; b. Screening of optimal effective period of IWP4

2.2.2. IWP4 最佳作用时间

实验组 1 在分化第 3 天加入最佳浓度 IWP4 后，TNNT2 mRNA 相对表达量最高，与对照组和实验组 2 比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见图 3b。

IWP4 促 hiPSCs 分化为心肌细胞的最佳浓度为 10.0 μmol/L、最佳作用时间为分化第 3 天。

2.3. BMP-4 促 hiPSCs 向心肌细胞分化的最佳浓度及作用时间筛选

2.3.1. BMP-4 最佳浓度筛选

实验 1 在 hiPSCs 分化第 5 天仅加入 BMP-4 作用 48 h 后未能启动心肌细胞基因表达，故排除该部分实验。实验 2 中，当 BMP-4 浓度为 20.0 ng/mL 时，TNNT2 mRNA 相对表达量最高，与 2.5、5.0、10.0、30.0 ng/mL 比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见图 4a。

图 4.

The relative expression of TNNT2 mRNA detected by real-time fluorescence quantitative PCR after adding BMP-4a. Screening of optimal concentration of BMP-4; b. Screening of optimal effective period of BMP-4

实时荧光定量 PCR 检测 BMP-4 作用后 TNNT2 mRNA 相对表达量

a. BMP-4 最佳浓度筛选；b. BMP-4 最佳作用时间筛选

2.3.2. BMP-4 最佳作用时间

实验组 1 分化第 3 天加入最佳浓度 BMP-4 后，TNNT2 mRNA 相对表达量最高，与其他 3 组比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见图 4b。

BMP-4 促 hiPSCs 向心肌细胞分化的最佳浓度为 20.0 ng/mL，最佳作用时间为分化后第 3 天。

2.4. Wnt 和 BMP 通路对 hiPSCs 向心肌细胞分化的影响

观测显示 BMP 调控组不能启动心肌细胞基因的表达，故研究排除该组。

2.4.1. 实时荧光定量 PCR 检测

分化第 7 天 Wnt+BMP 联合调控组的 ISL1 和 NKX2-5 mRNA 相对表达量高于 Wnt 调控组，差异有统计学意义（t=15.654，P=0.004；t=12.075，P=0.007）。分化第 15 天 Wnt+BMP 联合调控组的 MEF2C、MYL2、MYL7 以及 TNNT2 mRNA 相对表达量均明显高于 Wnt 调控组，差异均有统计学意义（t=13.489，P=0.006；t=15.444，P=0.004；t=19.348，P=0.003；t=57.840，P=0.000）。见图 5。

图 5.

Comparison of cardiac precursor cell marker expressions and cardiomyocyte markers expressions detected by real-time fluorescence quantitative PCR between Wnt group and Wnt+BMP group

实时荧光定量 PCR 检测 Wnt 调控组及 Wnt+BMP 联合调控组的心肌前体细胞标记物和心肌细胞标记物的表达a. 分化第 7 天；b. 分化第 15 天

a. On the 7th day of differentiation; b. On the 15th day of differentiation

2.4.2. 流式细胞术检测

分化第 28 天，Wnt+BMP 联合调控组 cTnT 蛋白阳性率为 74.2%，高于 Wnt 调控组的 63.8%，说明前者心肌分化效率较高。见图 6。

图 6.

Detection of positive expression ratio of cTnT by flow cytometry

流式细胞术检测心肌细胞特异性蛋白 cTnT 表达

a. Wnt 调控组；b. Wnt+BMP 联合调控组

a. Wnt group; b. Wnt+BMP group

2.4.3. 免疫荧光染色观察

荧光显微镜观察示各组均见 cTnT 蛋白阳性表达，其中 Wnt+BMP 联合调控组阳性表达更明显，可见类似于心肌细胞的肌节结构。见图 7。

图 7.

The expression of cTnT by immunofluorescence staining (Fluorescence microscope×40)

免疫荧光染色观察心肌细胞特异性蛋白 cTnT 表达（荧光显微镜×40）

从左至右依次为 DAPI 核染色、荧光染色及二者重叠a. Wnt 调控组；b. Wnt+BMP 联合调控组

From left to right for DAPI nucleus staining, fluorescence staining, and merge　a. Wnt group; b. Wnt+BMP group

3. 讨论

心脏是脊椎动物发育的第 1 个器官^[16]。发育初期，心脏由原肠胚祖细胞分化而来的第 1 心脏场（first heart field，FHF）和第 2 心脏场（second heart field，SHF）细胞构成。随后，FHF 形成心脏新月体，SHF 在新月体中间。FHF 和 SHF 细胞移动至中线，FHF 细胞形成线性心管，发育成左心室，SHF 细胞通过增殖、迁移以及与 FHF 细胞的融合，发育成右心室和流入、流出道。研究发现 BMP 信号通路促进 FHF 发育，而 Wnt 信号通路调控 SHF 的发育^{[10, 17]}。

Wnt 信号通路主要由细胞外 Wnt 蛋白、细胞膜受体、细胞质内信号转导部分和核内转录调控部分组成，物种间具有高度的保守性^[18]。其中依赖于 β-catenin 者为经典通路，不依赖 β-catenin 者为非经典通路^[19]，经典 Wnt/β-catenin 信号通路参与调控心脏 SHF 的发育。SHF 细胞的增殖、迁移及分化是心脏循环和右心室形成的基础，当突变 β-catenin 阻断 Wnt/β-catenin 通路时， SHF 细胞增殖受阻，细胞无法分散到右心室，导致 SHF 祖细胞缺乏、心脏环消失及右心室发育不良^[10]。但是，Wnt/β-catenin 信号通路在整个心脏发育中的作用有所争议。在鸡和青蛙的胚胎培养实验中，抑制经典 Wnt 信号可以促进心脏的发生^[20-21]。在小鼠胚胎实验中，β-catenin 的丢失会导致心脏环发育受阻，但在心前中胚层表达高水平的 β-catenin 又会阻止心新月形细胞与线性心管的融合，由于心脏环和心新月形细胞的融合是暂时分离，因此 Wnt 信号的双向作用可能跟发育时间相关^{[10, 22]}。Lian 等^[11]的研究进一步证实了 Wnt/β-catenin 通路在心脏发育中的双向作用。该研究显示在 hiPSCs 向心肌细胞分化早期促进 Wnt/β-catenin 通路，而在中胚层形成后加入抑制剂抑制通路活性，采取依赖于分化时间的双向调控 Wnt/β-catenin 通路，可以有效地促进 hiPSCs 向心肌细胞分化。同样，在斑马鱼的心脏发育中，Wnt/β-catenin 通路也是发挥早期促进、晚期抑制的双向作用^[23]。

鉴于 Wnt 通路在心脏发育中的双向调控作用，本研究中在分化开始的 24 h 用 CHIR99021 激活 Wnt 通路，随后加入 IWP4 抑制 Wnt 通路。结果显示在分化第 3 天加入 10 μmol/L IWP4 作用 48 h，可以有效促进 hiPSCs 分化为心肌细胞。分化而来的细胞可以表达心肌细胞前体标记物 ISL1 和 NKX2-5，以及心肌特异性基因 MEF2C、MYL2、MYL7 和 TNNT2，心肌细胞标志性蛋白 cTnT 阳性细胞可达 63.8%，免疫荧光染色 cTnT 为阳性表达。上述结果提示采用双向调控 Wnt 通路的方法可以有效促进 hiPSCs 分化为心肌细胞。

BMP 信号通路具有促进 FHF 发育的作用。当用突变的 BMP 受体阻断 BMP 信号通路时，心脏的新月体消失和 FHF 特异性基因 Gata6、Tbx-5 和 eHand 表达缺失，心脏祖细胞不能向心脏特异性谱系发展，心肌分化受损，无法形成心脏^[10]。BMP-2/4 是 BMP 信号通路的配体，这些配体是 TGF-β 超家族成员，参与了很多组织器官的分化，如心脏、神经系统、肺、肾、牙齿等^[14]。将合适浓度的 BMP-2/4 作用于鸡的非心前中胚层 48 h，可诱导出表达 NKX2-5 的心系细胞，说明 BMP 可以将鸡的非心前中胚层诱导为心脏谱系^[24]。在非洲爪蟾胚胎中采用瞬时转基因策略的实验也证明了 BMP 信号具有促进脊椎动物体内心脏形成和维持 NKX2-5 表达的作用，阻断 BMP 信号会导致心脏形成受阻，NKX2-5 表达下调^[25]。由于 BMP-2 或 BMP-4 纯合突变小鼠表现出早期胚胎致死性，因此在构建 BMP-2 和 BMP-4 双杂合子小鼠的实验中发现在发育过程中，大约有一半的杂合胎鼠出现室间隔缺损，并在出生后不久死亡，存活小鼠在出生后 2 个月心脏瓣膜结构逐渐发育异常，说明 BMP-2、4 对胚胎发育和出生后功能性心脏的形成至关重要，通路活性的降低可能是先天性和后天性心脏病的潜在原因^[26]。在胚胎心脏的形成过程中，BMP 信号通路的激活促进 FHF 的发育。

然而本研究发现在 hiPSCs 向心肌细胞分化中，仅加入 BMP-4 未能启动心肌细胞的基因和蛋白表达，Kattman 等^[9]的研究也发现仅激活 BMP 信号通路难以促进 hiPSCs 向心肌细胞分化。但是，当 BMP 通路联合 Wnt 通路时，可以有效促进 hiPSCs 分化为心肌细胞，且优于仅调控 Wnt 信号通路。说明 Wnt 信号通路和 BMP 信号通路对于心脏的发育具有协同促进作用。研究也发现 Wnt/β-catenin 在调控心脏发育过程中，通过自分泌和旁分泌途径触发多条发育信号的表达，如 Nodal、BMP 等信号通路^[9]。当在适当的分化阶段，敲除 β-catenin 可以增强 BMP 信号通路配体诱导的心肌细胞生成^[11]。说明在心脏发育过程中，Wnt/β-catenin 信号通路处于抑制状态时，BMP 信号通路是激活状态，两者协同合作以促进体内心脏的发育和形成^[10]。本研究中，在 hiPSCs 分化第 3 天加入 IWP4 使 Wnt 信号通路处于抑制状态时，加入 BMP-4 激活 BMP 信号通路，分化效果最佳，心肌细胞特异性基因表达及蛋白 cTnT 阳性表达更高。Wnt 和 BMP 信号通路的联合调控，也优于仅调控 Wnt 通路促 hiPSCs 分化为心肌细胞的方案。

综上述，联合调控 Wnt 和 BMP 信号通路诱导 hiPSCs 向心肌分化可以上调心肌特异性基因，如 MEF2C、MYL2、MYL7、TNNT2 等的表达，提高 cTnT 阳性细胞比例，表现为接近成熟心肌细胞的肌节结构，从而有效提高 hiPSCs 分化为心肌细胞的效率，为修复坏死心肌细胞、心脏疾病建模、心脏药物筛选等提供更加充足的细胞来源^[1]。

作者贡献：廖斌、周锐、闫颖构思与设计研究，闫颖、刘锋、侯晓杰、万居易、熊琪参与实验实施；闫颖、刘锋负责数据收集整理及统计分析；闫颖撰写文章；廖斌、周锐对文章的知识性内容作批阅性审阅。

利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。课题经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。

Funding Statement

泸州市科技计划项目（2019-JYJ-53）；西南医科大学科技项目（2019ZQN057）

Science and Technology Plan Project from Luzhou City (2019-JYJ-53); Scientific Research Project of Southwest Medical University (2019ZQN057)