Abstract
目的
探讨淫羊藿苷对激素诱导的兔早期激素性股骨头坏死干预效果。
方法
50 只成年新西兰兔（体质量 2.5～3.0 kg）随机分为对照组（n=10）、模型组（n=20）及实验组（n=20）。模型组和实验组采用脂多糖联合甲泼尼龙注射制备早期激素性股骨头坏死模型；实验组首次注射甲泼尼龙开始每日灌服淫羊藿苷药液 1 次，对照组及模型组灌服等量生理盐水，连续 6 周。于 6 周后取左侧股骨头行大体观察；Micro-CT 扫描观察骨小梁微结构，测量骨小梁相对体积（bone volume to total volume，BV/TV）、骨小梁数量（trabecular number，Tb.N）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Tn）及骨小梁分离度（trabecular separation，Tb.Sp），并构建三维图像观察；HE 染色观察骨小梁结构、骨细胞及骨髓脂肪细胞形态变化，按照病理学诊断标准检测股骨头坏死模型造模是否成功，计算空骨陷窝率。
结果
实验期间共 7 只动物死亡，最终对照组 9 只、模型组 16 只、实验组 18 只纳入研究。大体及 Micro-CT 扫描、三维重建显示，与对照组相比，模型组股骨头塌陷明显，骨小梁断裂、排列紊乱稀疏；实验组股骨头表面皱褶，塌陷不明显，骨小梁结构轻度退变。与对照组相比，模型组和实验组 Tb.N、Tb.Tn、BV/TV 下降、Tb.Sp 升高；与模型组相比，实验组 Tb.N、Tb.Tn、BV/TV 升高、Tb.Sp 降低；组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。HE 染色示模型组骨小梁中骨细胞减少，空骨陷窝较多，骨小梁间脂肪细胞堆积，部分呈囊状融合；实验组骨小梁形态较模型组完整，骨细胞坏死及脂肪细胞肥大不明显。按照股骨头坏死病理学诊断标准，对照组无骨坏死发生，模型组骨坏死发生率为 81.3%（13/16），实验组为 66.7%（12/18），差异无统计学意义（P=0.448）。模型组和实验组发生坏死的股骨头标本其空骨陷窝率分别为 33.1%±1.4% 及 18.9%±0.8%，均高于对照组 12.7%±1.5%，且模型组明显高于实验组，差异均有统计学意义（P<0.05）。
结论
淫羊藿苷对激素诱导的兔早期激素性股骨头坏死具有保护作用，可以降低骨细胞凋亡，改善骨微结构，延缓骨坏死发生。
Keywords: 激素性股骨头坏死, 淫羊藿苷, Micro-CT, 骨小梁, 骨陷窝, 兔
Abstract
Objective
To explore the effect of icariin on early steroid-induced osteonecrosis of the femoral head in rabbits.
Methods
Fifty mature New Zealand rabbits (weighing, 2.5-3.0 kg) were randomly divided into control group (n=10), model group (n=20), and experimental group (n=20). The rabbits of model and experimental groups were injected with lipopolysaccharide and methylprednisolone to establish the animal model of early steroid-induced osteonecrosis of the femoral head. The rabbits of experimental group were feeded with icariin solution once a day for 6 weeks since the first injection of methylprednisolone, whereas the rabbits of control and model groups were given normal saline at the same time points. The left femoral heads were removed after 6 weeks and gross morphological features were evaluated. Micro-CT scan was performed to analyze the trabecular microstructure with the following parameters: trabecular bone volume to total volume (BV/TV), trabecular number (Tb.N), trabecular thickness (Tb.Tn), and trabecular separation (Tb.Sp). The Micro-CT scan was also converted to three-dimensional reconstruction images for observation. HE staining was applied to observe the trabecular structure and morphological changes of osteocytes and marrow adipocytes. It was also used to determine whether the samples of femoral heads occurred osteonecrosis based on the criteria for pathological diagnosis, and calculate the rate of empty lacunae.
Results
Seven rabbits died during the study, and 9, 16, and 18 rabbits in the control, model, and experimental groups, respectively, enrolled the final analysis. Compared with control group, the femoral head collapse and trabecular breaks were more obvious, and the trabeculae were sparse with irregular arrangement in the model group according to the results of gross observation, Micro-CT scan, and three-dimensional reconstruction images. But in the experimental group, the surface of femoral head was slight shrinking without obvious collapse, and the degeneration of trabecular structure was mild. According to bone microstructures analysis, the Tb.N, Tb.Tn, and BV/TV of femoral head in model and experimental groups were lower than those in control group, while the Tb.Sp in the model and experimental groups were significantly higher. The Tb.N, Tb.Tn, and BV/TV of femoral head in experimental group were higher than those in model group, while the Tb.Sp in the experimental group was significantly lower. The differences between groups were all significant (P<0.05). In the model group, HE staining showed that the number of osteocytes reduced, the number of empty lacunae increased, and the marrow adipocytes piled up in the space between femoral trabeculae, some even mashed together like a cyst. In the experimental group, the trabecular structure was still relatively complete compared with model group, no obvious apoptosis of osteocytes was observed, the size and number of adipocytes were basically normal. None of the animals in control group occurred osteonecrosis of the femoral head based on the criteria for pathological diagnosis, and the incidence of osteonecrosis were 81.3% (13/16) in the model group and 66.7% (12/18) in the experimental group, and the difference was not significant (P=0.448). The rate of empty lacunae of osteonecrotic femoral heads in the model group was 33.1%±1.4%, which was higher than that in experimental group (18.9%±0.8%) and in control group (12.7%±1.5%), and the differences between groups were significant (P<0.05).
Conclusion
The icariin has a protective effect on the early steroid-induced osteonecrosis of the femoral head in rabbits, which can decrease osteocytes apoptosis, improve the bone microstructure, and delay such disease processes.
Keywords: Steroid-induced osteonecrosis of the femoral head, icariin, Micro-CT, trabecula, empty lacuna, rabbit
激素应用已成为导致非创伤性股骨头坏死的主要原因[1]，目前临床上有多种治疗方案，但总体治疗效果不佳，早期诊断和干预仍是延缓病情进展、改善预后的关键。寻找一种能有效拮抗激素对骨组织损伤作用的治疗方法，以降低该病发生率具有重要临床意义。我们前期实验研究表明，淫羊藿苷对高浓度激素造成的股骨头内骨髓微血管内皮细胞损伤具有显著保护作用[2]，临床上也将淫羊藿苷制剂用于治疗早期股骨头坏死[3]。但是目前缺少淫羊藿苷对骨微结构影响的研究报道。为此，本次实验以兔为研究对象，以脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）联合甲泼尼龙（methylprednisolone，MPS）注射制备早期激素性股骨头坏死模型，通过 Micro-CT 扫描重建及病理学检测，观察淫羊藿苷对早期股骨头坏死骨微结构的影响。报告如下。
1. 材料与方法
1.1. 实验动物
成年清洁级新西兰兔 50 只，雌雄各半，体质量 2.5～3.0 kg，购于北京科宇动物养殖中心，实验动物生产许可证号：SCXK（京）2018-0010。所有动物在中日友好医院动物实验室同一条件下分笼饲养，定量饲料及清洁饮用水喂食，室温 20～25℃，湿度 50% 左右，自然光照，通风良好。
1.2. 主要材料及仪器
LPS、淫羊藿苷、HE 染色试剂盒、青霉素钠、10% 中性甲醛（北京索莱宝科技有限公司）；MPS（辉瑞制药公司，美国）；乌拉坦（上海恒远生物科技有限公司）。硬组织切片机、分层脱水机（Leica 公司，德国）；石蜡包埋机（北京中科亚光科技有限公司）；倒置相差显微镜（Nikon 公司，日本）；Micro-CT（通用公司，美国）；Mimics17.0 图像分割处理软件（Materialise 公司，比利时）。
1.3. 动物模型制备及分组
实验动物适应性喂养 1 周，精确称重后采用随机数字表法分为对照组（10 只）、模型组（20 只）和实验组（20 只）。3 组动物体质量及雌雄构成比差异均无统计学意义（P>0.05）。模型组及实验组制备激素性股骨头坏死模型。具体方法：经耳缘静脉注射 1 次 LPS（5 μg/kg），正常喂养 24 h 后于双侧臀肌注射 MPS（20 mg/kg），每 24 小时注射 1 次，共注射 3 次。
实验组首次注射 MPS 时开始灌胃给予淫羊藿苷，按照实验动物用药换算方法计算给药剂量，将淫羊藿苷用蒸馏水配成 10 mL 药液，每日灌胃 1 次，连续 6 周。对照组和模型组对应时间点灌胃 10 mL 生理盐水。实验动物在相同条件下普通喂养，采用悬吊法饮水迫使其下肢直立行走，每天笼外自由活动 2 h，以增加活动量和范围，双侧臀肌每周交替注射 8 万 U 青霉素钠预防感染。
1.4. 观测指标
1.4.1. 一般情况
观察实验动物存活、活动、精神状况、饮食、排便、皮毛色泽及有无体表感染等，每周称重。
1.4.2. 大体观察
第 1 次注射 MPS 6 周后，以 20% 乌拉坦静脉麻醉处死 3 组实验动物，取左侧股骨头，剔除周围软组织，观察股骨头轮廓外形、表面软骨颜色、光滑度及软骨剥脱情况。
1.4.3. Micro-CT 观测
大体观察后将股骨头置于 10% 中性甲醛固定，Micro-CT 连续断层扫描。扫描参数：电压 80 kV，电流 450 μA，空间分辨率为 45 μm×45 μm×45 μm，曝光时间 2 000 ms。使用 Micro-CT 自带软件 CT-vox 对股骨头进行三维重建，选择软骨下骨全部松质骨作为兴趣区，CTan 定量分析骨小梁微结构，测量参数包括骨小梁相对体积（bone volume to total volume，BV/TV）、骨小梁数量（trabecular number，Tb.N）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Tn）及骨小梁分离度（trabecular separation，Tb.Sp）。
将采集的 CT 数据以 DICOM 格式导入 Mimics 软件中，通过建立蒙版、阈值分割及涂抹充填等操作三维重建股骨头骨性结构。选取横断面、冠状位、矢状位及三维视图，多角度观察股骨头标本三维立体结构。
1.4.4. 组织学观察
Micro-CT 扫描结束后用硬组织切片机沿股骨头标本冠状面纵行剖开，重新置于 10% 中性甲醛固定 7 d，5% 硝酸溶液浸泡脱钙 3 d。脱钙满意后分层脱水机梯度乙醇脱水，常规石蜡包埋，切片机切割、磨平、抛光，制备 20 μm 厚切片，脱蜡后 HE 染色，光镜下观察骨小梁结构、骨细胞及骨髓脂肪形态变化。
按照病理学诊断标准[4]检测股骨头坏死模型造模是否成功。诊断标准：骨小梁出现弥漫性空骨陷窝，骨细胞核固缩，周围组织可见骨髓细胞坏死。高倍镜下分析模型组、实验组中诊断为股骨头坏死的标本切片及对照组全部标本切片，每个标本选取 1 张，随机选取 10 个视野统计 50 个骨细胞中空骨陷窝数量，计算各组空骨陷窝率（空骨陷窝数量/50）×100%。
1.5. 统计学方法
采用 SPSS 22.0 统计软件进行分析。计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 SNK 检验；骨坏死发生率组间比较采用 Fisher 确切概率法；检验水准 α=0.05。
2. 结果
2.1. 一般情况
实验期间共 7 只实验动物死亡。其中，对照组 1 只因呼吸道感染死亡；模型组 1 只因急性腹泻死亡、3 只静脉注射 LPS 后死亡；实验组 2 只于第 1 次注射 MPS 后拒绝进食并出现腹泻症状，最终死亡。最终 43 只动物存活至实验完成，其中对照组 9 只、模型组 16 只、实验组 18 只。
除死亡动物外，模型组及实验组静脉注射 LPS 后共 9 只动物表现不同程度反应迟钝、精神萎靡、呼吸加快以及眼睑充血，3 只出现腹泻、食欲不振，24 h 后症状逐渐缓解。连续 3 次注射 MPS 后，10 只动物活动减少、反应迟缓、饮食及体质量下降，4 周后进食恢复正常；股骨头坏死动物皮毛失去光泽。对照组动物未见明显异常，活动自如，正常饮食，体质量逐渐增加，皮毛光滑。
2.2. 大体观察
大体观察各组全部股骨头标本。对照组股骨头外形轮廓正常、软骨面光滑完整无塌陷，外观洁白明亮；模型组大部分股骨头软骨下坏死范围较大且较严重，关节面塌陷明显，软骨颜色灰暗，易于剖开，骨质松脆；实验组大部分股骨头仍保持圆形，软骨面轻微凹陷，坏死区域呈现皱褶，软骨无剥脱，软骨面颜色基本正常。见图 1。
图 1.
General observation of the femoral head
股骨头大体观察
a. 对照组；b. 模型组；c. 实验组
a. Control group; b. Model group; c. Experimental group
2.3. Micro-CT 观测
Micro-CT 连续断层扫描所有股骨头标本。与对照组相比，模型组股骨头坏死区域骨皮质明显塌陷，软骨面骨皮质变薄，软骨下出现囊性变，骨小梁严重疏松、变细、结构紊乱、间隙显著变宽，部分骨小梁断裂甚至坏死；实验组股骨头坏死区域局限，骨皮质出现皱褶，坏死区软骨面骨皮质轻度变薄，骨小梁结构尚可，只有部分骨小梁出现排列不规则，连续性中断，骨小梁变细，间隙增大，密度轻度改变，有局限性修复。见图 2。
图 2.
Micro-CT observation of the femoral head
股骨头 Micro-CT 观察
从左至右依次为 Micro-CT 三维重建图像、Mimics 三维重建立体显示图像和冠状位图像 a. 对照组；b. 模型组；c. 实验组
From left to right for Micro-CT three-dimensional reconstruction，steric display and coronal display three-dimensional reconstructions by Mimics software a. Control group; b. Model group; c. Experimental group
与对照组相比，模型组和实验组 Tb.N、Tb.Tn、BV/TV 下降、Tb.Sp 升高；与模型组相比，实验组 Tb.N、Tb.Tn、BV/TV 升高、Tb.Sp 降低；组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见表 1。
表 1.
Comparison of bone microstructure parameters of the femoral heads between groups (
)
各组股骨头骨微结构参数比较（
）
| 组别
Group |
例数
n |
Tb.N (/mm) | Tb.Tn (μm) | BV/TV (%) | Tb.Sp (μm) |
|
*与对照组比较P<0.05，#与模型组比较P<0.05
*Compared with the control group, P<0.05;#compared with the model group, P<0.05 | |||||
| 对照组
Control group |
9 | 2.47±0.39# | 6.82±0.04# | 45.30±0.92# | 8.97±0.49# |
| 模型组
Model group |
16 | 1.20±0.27* | 6.22±0.05* | 17.86±0.82* | 11.95±0.44* |
| 实验组
Experimental group |
18 | 2.10±0.08*# | 6.39±0.03*# | 23.40±0.68*# | 10.08±0.31*# |
| 统计值
Statistic |
F=90.776
P=0.000 |
F=565.906
P=0.000 |
F=3 626.198
P=0.000 |
F=175.371
P=0.000 |
|
2.4. 组织学观察
对照组：股骨头软骨较厚，骨小梁饱满、排列规则整齐，骨小梁间充满骨髓造血组织，脂肪细胞少、形态正常，椭圆形骨细胞沿骨小梁成串排列、核大居中，偶见散在的空骨陷窝。模型组：坏死灶主要位于松质骨及软骨下区，软骨层变薄缺损，软骨下骨小梁结构紊乱、排列稀疏松散，可见骨小梁断裂碎片，骨小梁中骨细胞减少，骨陷窝变大，空骨陷窝增多，骨细胞排列无序，骨小梁间脂肪细胞堆积、数目增多，部分肥大呈囊状融合。实验组：坏死区骨小梁形态及结构较模型组完整，骨小梁排列相对致密规则，骨小梁轻度变薄、间隙无明显增大，部分骨细胞凋亡，空骨陷窝少，脂肪细胞无明显肥大。见图 3。
图 3.
HE staining of the femoral head
股骨头 HE 染色观察
从左至右为放大 40、200、400 倍，箭头示空骨陷窝 a. 对照组；b. 模型组；c. 实验组
From left to right for magnifications of 40, 200, and 400, respectively; arrow indicated the empty lacunae a. Control group; b. Model group; c. Experimental group
按照股骨头坏死病理学诊断标准，对照组无骨坏死发生；模型组骨坏死发生率为 81.3%（13/16），实验组为 66.7%（12/18），组间比较差异无统计学意义（P=0.448）。模型组和实验组发生坏死的股骨头标本其空骨陷窝率分别为 33.1%±1.4% （n=13）及 18.9%±0.8% （n=12），均高于对照组 12.7%±1.5% （n=9），且模型组明显高于实验组，组间差异均有统计学意义（P<0.05）。
3. 讨论
激素在多种疾病治疗中起着不可替代的作用，然而在给患者带来满意治疗效果的同时也会产生严重并发症，如股骨头坏死[4]。我们前期临床研究结果表明，激素累计使用量超过 2 000 mg（折合成 MPS）或者每日剂量超过 30 mg 以及静脉冲击使用激素的患者，其骨坏死发生风险显著增高，发病率约为 33%[5]。另一项日本学者的研究中，由于激素应用导致的股骨头坏死患者占非创伤性股骨头坏死患者的 47.4%[6]。如果不进行有效干预，80% 患者将在 1～5 年内进展至股骨头塌陷[7]，进而影响髋关节功能，晚期只能进行人工髋关节置换[8]。早期诊断和有效干预依然是延缓股骨头坏死病情进展，推迟人工关节置换时间的关键。人体股骨头标本研究表明，激素导致的股骨头坏死以多发灶性溶骨性骨质破坏为主要特点[9]。激素性股骨头坏死发生机制尚未完全明确，可能是通过直接损伤骨细胞及骨髓微血管内皮细胞导致骨细胞及骨组织坏死[10-11]。因此，如果能找到一种可以有效拮抗激素这种毒副作用的药物，将有可能从源头上降低该病的发生率。
淫羊藿苷是小檗科淫羊藿属植物茎叶提取物的主要化学成分，属于黄酮类化合物，具有多种生物活性。现代药理学认为淫羊藿苷具有性激素样作用，可以促进骨组织蛋白合成及成骨细胞生长，从而有益于骨再生和骨修复[3, 12]。动物研究表明，淫羊藿苷具有成骨作用，可促进骨缺损再生，加速骨修复[13-14]。我们牵头开展的一项多中心随机双盲对照试验发现，长期服用激素的患者同时服用由淫羊藿苷组成的复方制剂 6 个月后，股骨头坏死发生率（6.98%，9/129）显著低于未服用复方制剂患者（14.4%，21/146）[3]。此外，有研究表明淫羊藿苷在抑制骨量丢失、改善骨质疏松方面也具有显著效果[12, 15-16]。
近年来，国内外对淫羊藿苷的成骨作用研究较多，其成骨机制也是研究热点。BMSCs 是骨髓内多能干细胞，具有自我更新和多向分化潜能，可以分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、内皮细胞等。Fan 等[17]体外实验发现淫羊藿苷可以增强 BMSCs 自我复制及向成骨细胞定向分化的能力，并且与剂量成正相关。还有研究表明，淫羊藿苷在促进 BMSCs 成骨分化、增加成骨细胞数量的同时，还会抑制其向脂肪细胞分化[18-19]。此外，淫羊藿苷一方面增强成骨细胞的活性、促进成骨[20-22]，另一方面抑制破骨细胞活动、降低骨吸收[23]，对透明软骨、钙化软骨及软骨下骨也有保护作用[24]。研究还表明淫羊藿苷具有拮抗激素对血管内皮细胞损伤的作用，促进内皮细胞在体内迁移、增殖、成管，从而诱导新生血管形成[2, 25-26]，增加局部血流，改善微循环，共同促进骨修复，对延缓骨坏死病情进展有重要作用。
目前，股骨头坏死动物模型制备方法有很多种，其中 MPS 联合 LPS 更符合人激素性股骨头坏死病理改变[27]，因此本实验采用该方法建立兔激素性股骨头坏死模型，观察淫羊藿苷对早期股骨头坏死的干预作用。Micro-CT 可清楚显示标本每一层面骨小梁结构，在观察骨微结构方面具有特殊优势，同时本实验还创新性将标本用 Mimics 软件进行三维重建。经淫羊藿苷干预后的股骨头坏死标本软骨轻度变薄、骨小梁结构尚可，破坏不明显，三维重建显示软骨下松质骨仍呈均匀、致密的立体网状结构。而无淫羊藿苷干预的模型组股骨头软骨塌陷明显，骨小梁破坏严重，骨小梁之间的连接断裂，与骨微结构参数比较结果一致。组织学研究显示经淫羊藿苷干预后兔股骨头坏死造模成功率降低，股骨头坏死标本的空骨陷窝率也低于模型组，骨细胞凋亡及脂肪细胞无明显增多。
综上述，激素对兔股骨头微结构具有显著破坏作用，造成骨细胞凋亡及骨髓脂肪细胞增生，而淫羊藿苷可以有效降低这种损伤作用，减少骨细胞凋亡，促进局部骨修复，延缓病情进展。
作者贡献：时利军参与实验设计及实施、数据收集整理及统计分析、文章起草；毛天立参与实验实施、数据收集整理及统计分析；罗攀参与实验实施及数据收集；李腾奇参与实验实施及统计分析；高福强参与实验设计；孙伟参与实验设计，对文章知识性内容作批评性审阅；李子荣对文章知识性内容作批评性审阅。
利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。
机构伦理问题：研究方案经中日友好医院实验动物福利伦理委员会批准（180110），动物使用许可证号：SYXK（京）2018-0036。实验过程中动物处置均符合 2006 年科学技术部发布的《实验动物保健与使用指导意见》要求。
Funding Statement
国家自然科学基金资助项目（81672236、81871830、81802224）；北京市自然科学基金资助项目（7182146、7174346）；北京协和医学院研究生创新基金（2019-1002-91）
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