创伤性脊髓损伤后环状非编码 RNA-微小 RNA 潜在调控网络信息挖掘

Abstract

Objective

To systematically profile and characterize the circular RNA (circRNA) and microRNA (miRNA) expression pattern in the lesion epicenter of spinal tissues after traumatic spinal cord injury (TSCI) and predict the structure and potential functions of the regulatory network.

Methods

Forty-eight adult male C57BL/6 mice (weighing, 18-22 g) were randomly divided into the TSCI (n=24) and sham (n=24) groups. Mice in the TSCI group underwent T_8-10 vertebral laminectomy and Allen’s weight-drop spinal cord injury. Mice in the sham group underwent the same laminectomy without TSCI. The spinal tissues were harvested after 3 days. Some tissues were stained with HE staining to observe the structure. The others were used for sequencing. The RNA-Seq, gene ontology (GO) analysis, and circRNA-miRNA network analyses (TargetScan and miRanda) were used to profile the expression and regulation patterns of network of mice models after TSCI.

Results

HE staining showed the severe damage to the spinal cord in TSCI group compared with sham group. A total of 17 440 circRNAs and 1 228 miRNAs were identified. The host gene of significant differentially expressed circRNA enriched in the cytoplasm, associated with positive regulation of transcription and protein phosphorylation. mmu-miR-21-5p was the most significant differentially expressed miRNA after TSCI, and circRNA6730 was predicted to be its targeted circRNA. Then a potential regulatory circRNA-miRNA network was constructed.

Conclusion

The significant differentially expressed circRNAs and miRNAs may play important roles after TSCI. A targeted interaction network with mmu-miR-21-5p at the core of circRNA6730 could provide basis of pathophysiological mechanism, as well as help guide therapeutic strategies for TSCI.

创伤性脊髓损伤（traumatic spinal cord injury，TSCI）是一类具有高致死、高致残特征的中枢神经损伤，常导致神经组织缺失和死亡，引起感觉和运动功能障碍^[1-2]。目前对 TSCI 机制了解十分有限，尚无有效治疗手段^[3]。为了发掘轴突再生和功能恢复的新治疗策略，需要对 TSCI 后细胞和分子病理生理机制进一步研究。

非编码 RNA 是一类在诸多病理生理进程中调控遗传编程、表观遗传和转录翻译的关键因子^[4]，其中环状非编码 RNA（circular RNA，circRNA）-微小 RNA（microRNA，miRNA）调控轴已被证明在神经系统生长、成熟和退变等进程中发挥重要调控作用^[5]。但是 circRNA-miRNA 调控轴在 TSCI 中的作用尚缺乏系统研究，为此我们使用 miRNA 与 circRNA 的高通量测序，筛选 miRNA 与 circRNA 差异表达谱，预测并构建 TSCI 后发挥潜在调控作用的 circRNA-miRNA 调控轴，为临床诊断和治疗 TSCI 奠定理论基础。

1. 材料与方法

1.1. 实验动物及主要试剂、仪器

清洁级健康雄性 8 周龄 C57BL/6 小鼠 48 只，体质量 18～22 g，购于山东大学动物中心。戊巴比妥钠（国药集团化学试剂有限公司）；HE 染色试剂盒（广州凯秀贸易有限公司）；Trizol 裂解液（Takara 公司，日本）； Ribo-Zero 试剂盒、TruSeq Small RNA Sample Prep 试剂盒（Illumina 公司，美国）。

NanoDrop 微量分光光度计（Thermo Fisher 公司，美国）；Agilent 2100 生物分析仪、Hiseq2000/2500 测序系统、HiSeq4000 测序系统（Agilent 公司，美国）；ACGT101-miR 系统（LC Sciences 公司，美国）。标准 Allen’s 打击器械由济南市骨生物力学与骨代谢实验室提供。

1.2. 动物模型制备

将 48 只小鼠随机分为 TSCI 组及假手术组（Sham 组），每组 24 只。两组小鼠腹腔注射戊巴比妥钠（30 mg /kg）麻醉后，背部逐层切开，暴露及定位 T_8～10 节段，去除椎板暴露脊髓。TSCI 组采用标准 Allen’s 打击器械以 6 g 重物于 6 cm 高度自由落下，对已暴露脊髓进行打击^[6]，逐层缝合切口。Sham 组暴露脊髓后不作任何处理，直接缝合切口。

1.3. 组织学观察

术后 3 d 两组各取 3 只小鼠脊髓损伤中心组织行 HE 染色观察。小鼠同上法麻醉后，切开心包自左心室插入导管至主动脉，持续灌注生理盐水，剪开右心耳待流出清亮液体后更换为 4% 多聚甲醛灌注至小鼠变硬。剥离损伤中心区域脊髓组织，置于 4% 多聚甲醛中过夜，脱水，石蜡包埋后切片，片厚 5 μm。常规 HE 染色后，光镜下观察脊髓损伤前后病理改变。

1.4. 测序文库构建与测序实验

1.4.1. 总 RNA 提取及检测

术后 3 d，两组剩余小鼠提取总 RNA。同上法麻醉后，按照原切口入路，剥离损伤中心区域脊髓组织，冰上研磨加入 Trizol 裂解后，加入氯仿，震荡混匀；取中层，加入异丙醇，4℃，以 12 000×g 离心 15 min，弃上清；加入乙醇，4℃，以 7 500×g 离心 5 min，干燥沉淀；加无 RNA 酶水溶解。使用分光光度计检测总 RNA 的纯度，根据吸光度（A）_260/280 比值评估其无污染及降解，且经生物分析仪检测 RNA 完整度后构建测序文库。

1.4.2. miRNA 建库及测序

所有测序均按照美国 Illumina 公司提供的标准步骤执行。使用 T4 RNA 连接酶 2 将 1 个腺苷化单链 DNA 3’ 接头和 5’ 接头相继连接到小 RNA 上，带有 5’ 与 3’ 接头的小 RNA 序列通过与 3’ 端互补的 RT 引物进行反转录反应，对反转录产生的 cDNA 序列进行 PCR 扩增。最后，对 140～160 bp 长度范围的 PCR 产物进行 6% polyacrylamideTris-borate-EDTA 胶回收，完成建库。设定测序读长参数为单端 1×50 bp，对文库进行测序。

1.4.3. circRNA 建库及测序

去除总 RNA 核糖体 RNA，纯化回收剩余 RNA，用片段化试剂随机打断成短片段，以片段化 circRNA 为模板，用六碱基随机引物合成第 1 链 cDNA，进一步与脱氧核苷酸、核糖核酸酶和脱氧核糖核酸聚合酶进行第 2 链 cDNA 合成。使用核酸纯化磁珠纯化双链产物，利用 T4 DNA 聚合酶和 Klenow DNA 聚合酶活性将 DNA 的黏性末端修复为平末端，3’ 端加碱基腺嘌呤（A）并加接头，核酸纯化磁珠进行片段选择，之后用尿嘧啶-特异性切除试剂酶降解含有尿嘧啶（U）的 cDNA 第 2 链，最后进行 PCR 扩增即建立测序文库。设定测序读长参数为双端 2×150 bp，对文库进行测序。

1.5. 表达谱数据分析及差异表达数据整理

1.5.1. miRNA 的表达鉴定与差异分析

将非典型 miRNA 序列以及 N 特征序列清理后，筛选长度为 18～26 nt 的序列，剩余序列与 mRNA、RFam 和重复序列数据库中信息对比鉴定。筛选出的序列与 miRBase21.0 数据库中对比，鉴定为已知 miRNA 并进行 RNA 二级结构预测，最后对 TSCI 组和 Sham 组样本 miRNA 进行差异统计。通过 miRNA 检出率统计 TSCI 组和 Sham 组 miRNA 表达的重合情况，利用独立样本 t 检验进行差异显著性分析。为筛选具有高研究潜能的差异表达 miRNA，设定以下条件：排除组织中低表达的 miRNA，以 log2 差异倍数降序排列，其中表达倍数≥2 的 miRNA 设定为显著差异表达。

1.5.2. circRNA 的表达鉴定与差异分析

RNA 成环分为外显子环化和内含子环化，均有反向剪切位点，由反向剪切位点鉴定序列来自 circRNA 的可能，进一步使用 CIRCExplorer 对 circRNA 序列本身进行预测，并用 Tophat 比对结果。进一步通过 circRNA 位置关系分类进行注释，统计样本基因表达值分布，比较不同样本间表达趋势，确认样本的生物学重复情况，最后对不同样本组织之间的 circRNA 进行差异统计。通过韦恩图分析 TSCI 组和 Sham 组 circRNA 表达的重合情况，进一步排除组织中低表达的 circRNA，利用独立样本 t 检验进行差异显著性分析，选择表达倍数≥1、P<0.05，并以差异表达倍数降序排列。

1.6. 差异表达 circRNA 的功能预测分析

基因本体分析（gene ontology，GO）结果柱状图反映在生物过程、细胞组分和分子功能方面，富集的 GO 词条上差异基因的数量分布情况，通过 GO 功能显著性富集分析能确定差异表达基因行使的主要生物学功能。将差异表达 circRNA 的宿主基因导入 GO 分析。

circRNA 宿主基因的 GO 分析基本单位是词条，每个词条都对应 1 个属性。GO 分析首先把所有显著性差异表达基因向 GeneOntology 数据库的各词条映射，计算每个词条的基因数目，应用超几何检验后与整个基因组背景相比，并以 P≤0.05 为阈值筛选在显著性差异表达基因中显著富集的 GO 条目，进而预测差异表达基因行使的主要生物学功能。

1.7. miRNA-circRNA 靶向互作预测分析

分别使用 TargetScan、miRanda 软件预测 miRNA 的靶基因，从而预测 miRNA-circRNA 的靶向互作。TargetScan 软件通过种子区中种子匹配的方式预测序列完全互补信息；miRanda 软件以碱基互补（A=U、G=C）构建打分矩阵预测靶点信息。TargetScan 分析设定阈值为≥50，miRanda 分析设定阈值为 Max_Energy<−10；两种算法结果取交集，即为靶向互作预测分析的最终结果。进一步使用 Cytoscape 软件绘制 miRNA-circRNA 互作图，直观阐明预测的互作网络信息。

2. 结果

2.1. 组织学观察

Sham 组小鼠脊髓结构清晰，脊膜完整无破裂，中央管居中，无出血，未见损伤痕迹（图 1a）。TSCI 组小鼠脊髓有明显损伤破裂，脊膜缺损，中央管破裂或偏于一侧，可见血管破裂引起的红细胞广泛弥散和炎性细胞浸润（图 1b）。

图 1.

HE staining of spinal cord tissue in two groups (×100)a. TSCI group; b. Sham group

两组小鼠脊髓组织 HE 染色观察（×100）

a. TSCI 组；b. Sham 组

2.2. miRNA/circRNA 表达谱及差异表达分析

聚类图系统显示与 Sham 组相比 TSCI 组中各 miRNA 和 circRNA 变化情况（图 2），韦恩图可以直观显示 TSCI 组与 Sham 组共同重叠和特征表达的 miRNA/circRNA（图 3）。

图 2.

Cluster analysis of differentially expressed miRNA and circRNA in TSCI group and sham group

TSCI 组与 Sham 组差异表达 miRNA 与 circRNA 聚类分析

1～3: TSCI 组，4～6: Sham 组　a. miRNA；b. circRNA

1-3: TSCI group, 4-6: Sham group　a. miRNA; b. circRNA

图 3.

Venn diagram of differentially expressed miRNA and circRNA in TSCI group and sham group

TSCI 组与 Sham 组表达 miRNA 与 circRNA 韦恩图

a. miRNA；b. circRNA

a. miRNA; b. circRNA

本研究共鉴定出 1 228 个 miRNA，其中 TSCI 组特征表达 169 个，Sham 组特征表达 99 个，两组重合表达 960 个。进一步以 log2 差异倍数降序排列，前 10 位 miRNA 依次为 mmu-miR-21a-3p、mmu-miR-92a-1-5p、mmu-miR-18a-3p、mmu-miR-21a-5p、mmu-miR-27a-5p、mmu-miR-7688-5p、mmu-miR-351-3p、mmu-miR-1964-3p、mmu-miR-5121_L-1、mmu-miR-7689-3p，其中前 6 位 miRNA 满足表达倍数≥2 的显著差异表达要求。见表 1。

表 1.

Top 10 differentially expressed miRNAs in TSCI group compared with sham group

TSCI 组与 Sham 组表达差异排前 10 位的 miRNA

miRNA	P	log2 差异倍数 log2 fold-change	变化趋势 Regulation
mmu-miR-21a-3p	0.021 9	5.19	上调
mmu-miR-92a-1-5p	0.009 8	3.16	上调
mmu-miR-18a-3p	0.006 4	3.07	上调
mmu-miR-21a-5p	0.012 1	2.46	上调
mmu-miR-27a-5p	0.005 9	2.30	上调
mmu-miR-7688-5p	0.003 2	2.10	上调
mmu-miR-351-3p	0.019 9	1.88	上调
mmu-miR-1964-3p	0.004 5	1.73	上调
mmu-miR-5121_L-1	0.033 8	1.55	上调
mmu-miR-7689-3p	0.028 6	1.54	上调

本研究共鉴定出 17 440 个 circRNA，其中 TSCI 组特征表达 54 个，Sham 组特征表达 11 个，两组重合表达 17 375 个。进一步以 log2 差异表达倍数降序排列，前 10 位 circRNA 依次为 circRNA271、circRNA802、circRNA4206、circRNA4119、circRNA1374、circRNA4700、circRNA10712、circRNA7452、circRNA5004、circRNA172。见表 2。

表 2.

Top 10 differentially expressed circRNAs in TSCI group compared with sham group

TSCI 组与 Sham 组表达差异排前 10 位的 circRNA

circRNA	宿主基因 Host gene	P	log2 差异倍数 log2 fold-change	变化趋势 Regulation
circRNA271	Serpine1	0.0153	10.29	上调
circRNA802	Ticrr	0.0315	8.17	上调
circRNA4206	Dtl	0.0157	7.61	上调
circRNA4119	Cd84	0.0389	6.54	上调
circRNA1374	Fancd2	0.0048	5.77	上调
circRNA4700	Zwilch	0.0492	5.28	上调
circRNA10712	Tmc8	0.0491	5.01	上调
circRNA7452	Runx1	0.0331	4.76	上调
circRNA5004	Kif15	0.0408	4.72	上调
circRNA172	Col1a1	0.0006	4.71	上调

2.3. 差异表达 circRNA 的功能预测分析

将差异表达 circRNA 的宿主基因导入 GO 分析，在细胞组分中差异基因主要富集在细胞质、细胞核、外泌体以及质膜中，在生物过程中差异基因主要富集在转录的正调控和蛋白磷酸化过程，在分子功能中差异基因主要富集在蛋白结合、三磷酸腺苷结合以及金属离子结合。见图 4。

图 4.

GO analysis of differentially expressed circRNA

差异表达 circRNA 的 GO 分析

2.4. miRNA-circRNA 靶向互作预测分析

TSCI 后 mmu-miR-21a-5p 表达显著上调，满足表达倍数≥2 的显著差异表达要求。结合前期研究结果^[6-8]，确定 mmu-miR-21a-5p 为 TSCI 后诸多病理生理过程的关键调控节点，进一步筛选可与其靶向结合的差异表达 circRNA。

本研究共筛选出 8 个可能与 mmu-miR-21a-5p 靶向结合的差异表达 circRNA，即 circRNA6370、circRNA11033、circRNA222、circRNA6371、ciRNA295、circRNA13622、circRNA9429、circRNA3618（表 3）。综合分析反剪切位点、TargetScan 以及 miRanda 评分，筛选出 circRNA6370 为潜在的与 mmu-miR-21a-5p 互作影响 TSCI 后病理生理进程的关键 circRNA。反向筛选可与 circRNA6370 靶向结合的差异表达 miRNA 分别为 mmu-miR-21a-5p、mmu-miR-873a-5p、mmu-miR-22-5p、mmu-miR-135a-5p 和 mmu-miR-135b-5p，并以 circRNA6370 为核心构建了 TSCI 后差异表达 circRNA- miRNA 互作网络（图 5）。

表 3.

The targeted circRNAs with mmu-miR-21a-5p

mmu-miR-21a-5p 靶向结合差异表达 circRNA 筛选

circRNA	circbase ID	宿主基因 Host gene	TargetScan	miRanda	平均反向剪切位点数 Mean back splice	P	变化趋势 Regulation
circRNA6370	无	Nsf	50	−16.11	27.17	0.01	下调
circRNA11033	mmu_circ_0006253	Stxbp5l	77	−11.05	8.00	0.02	下调
circRNA222	mmu_circ_0009937	Strbp	72	−13.72	7.00	0.03	下调
circRNA6371	无	Nsf	61	−16.11	5.17	0.01	下调
ciRNA295	无	Itgav	88	−13.74	1.00	0.04	上调
circRNA13622	mmu_circ_0002672	Nsf	66	−16.11	0.83	0.01	下调
circRNA9429	无	Gatb	50	−12.20	0.83	0.04	上调
circRNA3618	无	Stau2	83	−13.29	0.33	0.05	下调

图 5.

Differentially expressed circRNA-miRNA-mRNA networks

差异表达 circRNA-miRNA-mRNA 靶向互作图

蓝色：circRNA 红色：miRNA 黄色：mRNA

Blue: circRNA; Red: miRNA; Yellow: mRNA

3. 讨论

TSCI 主要由交通事故和高处坠落造成，也可由血管病变、肿瘤和医源性损伤造成，常导致患者瘫痪、无意识运动、大小便失禁和抑郁等^[9]。创伤会导致神经细胞凋亡，破坏神经连接，从而使得上、下行传导的神经兴奋中断^[10]。TSCI 包括急性期、亚急性期和慢性期，许多分子共同参与损伤后的修复过程。目前有越来越多的证据表明非编码 RNA 在脊髓损伤进展中起重要作用^{[5, 11]}。70% 以上的人类基因被转录，但是只有不到 2% 的基因被翻译成蛋白质，其余大部分的基因被转录成非编码 RNA^[12]。非编码 RNA 按照内在功能可分为两大类，一类是管家非编码 RNA，包括核内小 RNA、核糖体 RNA 和搬运 RNA 等；另一类是调控性非编码 RNA，包括 miRNA、circRNA 和长非编码 RNA 等^[13]。目前，调控性非编码 RNA 中，对 miRNA 的研究开展最早且最全面。miRNA 广泛存在于各种组织和体液中^[14-15]，尤其在神经系统中 miRNA 可作为调控因子，甚至类激素样因子，通过自分泌或者旁分泌途径影响靶细胞之间的交流和信息传递，从而调控神经退行性变和再生进程^[5]。circRNA 是一类刚进入研究者视野的非编码 RNA，不同于其他非编码 RNA 的线性结构，circRNA 呈现出首尾相连的特殊环状结构，由于没有 5’ 端和 3’ 端，circRNA 对核酸酶不敏感，故比线性 RNA 更稳定。circRNA 从果蝇到人的各类生物组织中均有表达，在人体中 circRNA 源于 14.4% 的表达基因，约占人类总 RNA 的 1%^[16]。circRNA 的表达存在时间、空间和组织特异性，大部分与对应的线性转录本相比表达偏低，但在一定情况下可以远高于其对应的线性转录本，尤其在中枢神经系统中，circRNA 大量表达，参与神经的发育、退变、递质释放和轴突生长等过程^[17-18]。目前认为 circRNA 最重要的作用是作为 miRNA 的吸附海绵来发挥转录后的调控功能，且已证实 Cyrano–Cdr1as-miR-7 这一 lncRNA-circRNA-miRNA 多 RNA 互作轴可调控退变相关的神经活动^{[5, 19-20]}。

本研究分别对 TSCI 后差异表达的 circRNA 和 miRNA 进行高通量测序，分别获得损伤急性期差异表达谱，并进行了相关宿主基因功能注释的分析。mmu-miR-21a-5p 为损伤后大量表达且上调最明显的 miRNA，测序中的差异表达趋势与前期研究中 PCR 结果一致^[6-7]。前期研究结果表明脊髓损伤后上调的 mmu-miR-21-5p，不仅能通过 PI3K-Akt-mTOR 通路调控星形胶质细胞的活化，也能通过 TGF-β-Smad 通路调控血管和脊膜成纤维细胞的活化^[6-7]。而脊髓星形胶质细胞和成纤维细胞是形成瘢痕阻隔影响轴突再生的关键^[21-22]。因此结合前期研究基础，本研究中为筛选可与 mmu-miR-21-5p 靶向结合的差异表达 circRNA，默认设置的 circRNA 差异表达阈值是 log2 差异倍数≥1 且P≤ 0.05，进一步通过 TargetScan 和 miRanda 软件预测 circRNA-miRNA 之间的靶向关系，TargetScan 设定阈值是≥50，该值越大结合率越高，miRanda 设置阈值 Max_Energy<−10，该值越小结合率越高。进而在所有能与 miR-21-5p 靶向结合的差异表达 circRNA 中，筛选出成环指数最高、结合率最高的 circRNA6370 进行轴向预测。根据 circRNA 与 miRNA 结合一对多的特征^[19-20]，构建了以 circRNA6370 为核心的 circRNA-miRNA 靶向互作网络。

在后续研究中，我们将从体外、体内方向共同验证和完善本研究预测的 TSCI 后 circRNA-miRNA 靶向结合网络，进一步探索其功能及通路，旨在探究 TSCI 后非编码 RNA 调控网络的病理生理作用及机制，尤其在急性期炎症相关病理生理功能发掘与验证。

作者贡献：王文朝承担实验设计及文章撰写，王善玺、张正东和李军参与数据收集，谢伟、苏延林和陈佳男参与动物实验及统计分析，刘雷指导研究并对文章的知识性内容作批评性审阅。

利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。

机构伦理问题：研究方案经山东大学医学/动物实验伦理委员会批准，实验动物使用许可证号：SYXK（鲁）20150015。

Funding Statement

国家自然科学基金资助项目（81874002）；四川省科技厅项目（2018SZ0159）；四川省创新创业苗子工程重点项目（2019JDRC0100）；国家老年疾病临床医学研究中心（四川大学华西医院）项目（Y2018B22、Z20192013）；山东省医药卫生科技发展计划项目（2016WS0618）；重庆市九龙坡区科技计划项目（201850）