Abstract
目的
探讨脱钙骨基质（demineralized bone matrix，DBM）中 BMP-2 含量与其体内/外成骨活性的相关性，以期选择一种简易、便捷的评价 DBM 成骨活性的方法。
方法
取 9 具人尸体左侧股骨中段组织，采用动态脱钙工艺制备 DBM（S1～S9），同时制备灭活 DBM（对照）。分别采用蛋白酶抑制剂法、胶原酶法、盐酸胍/EDTA 法、RIPA 裂解液法提取 S1～S9 以及灭活 DBM 中 BMP-2，测量比较不同 DBM 间 BMP-2 含量差异。取 S1～S9 以及灭活 DBM，分别与小鼠胚胎成骨细胞 MC3T3-E1 共培养，采用 MTT 法及荧光染色检测细胞增殖，同时检测 ALP 活性。取 30 只 BALB/c 雄性裸小鼠分为 10 组，分别为 S1～S9 DBM 组（S1～S9 组）以及灭活 DBM 组（对照组），每组 3 只。于各组小鼠双侧后肢大腿中部制备肌袋，植入对应 DBM 材料，术后 4 周取材行 HE 染色观察并半定量评价（新骨形成评分）。
结果
不同供体骨制备的 DBM，其 BMP-2 含量存在差异；同一供体骨制备的 DBM，经不同提取方法获得的 BMP-2 含量也不同，其中盐酸胍/EDTA 法提取效率最高。体外成骨性能评价，共培养后各时间点 S4、S6 组细胞增殖、ALP 活性均较其他组明显增高（P<0.05），且 7 d 时 S4 组细胞增殖最显著（P<0.05）；荧光染色示各组成骨细胞状态均良好，但 S1、S2、S3、S4、S6 组成骨细胞多于其他组。体内异位成骨诱导实验示，术后 4 周 S1～S6 组植骨区域均可见软骨和新骨生成，并且随着 BMP-2 含量增加，材料诱导新骨生成越多，新骨形成评分较高（P<0.05）；其中 S4、S6 组骨新生区域含有大量软骨细胞和成骨细胞。
结论
BMP-2 定量检测结合体外成骨细胞增殖分化实验可用于评估 DBM 成骨活性。
Keywords: 脱钙骨基质, BMP-2, 成骨活性, 盐酸胍/EDTA
Abstract
Objective
To investigate the correlation between the content of bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) in demineralized bone matrix (DBM) and its osteogenic activity in vitro and in vivo, in order to choose a simple and convenient method to evaluate the osteogenic activity of DBM.
Methods
The left mid-femoral tissues of 9 donors were taken, and DBMs (S1-S9) were prepared by dynamic decalcification process, and inactivated DBM (control group) was prepared at the same time. Protease inhibitor method, collagenase method, guanidine hydrochloride/ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA) method, and RIPA lysate method were used to extract BMP-2 in S1-S9 and inactivated DBMs. The BMP-2 content was measured and the differences between DBMs were compared. Then the S1-S9 and inactivated DBMs were co-cultured with mouse embryonic osteoblasts MC3T3-E1, respectively. The cell proliferation was detected by MTT method and fluorescence staining, and alkaline phosphatase (ALP) activity was detected at the same time. Thirty BALB/c male nude mice were divided into 10 groups, namely S1-S9 DBM groups (S1-S9 groups) and inactivated DBM group (control group), with 3 mice in each group. Muscle pockets of the middle thighs were prepared on both hindlimbs of mice in each group, and implanted corresponding DBM materials. At 4 weeks after operation, the samples were taken for HE staining observation and semi-quantitative evaluation, and the new bone formation score was calculated.
Results
The BMP-2 content of DBM derived from different donor bones was distinct. The BMP-2 content obtained by different extraction methods for DBM prepared from the same donor bone was also different, and the extraction efficiency of the guanidine hydrochloride/EDTA method was the highest. In vitro cell experiments, MTT test displayed that cell proliferations and ALP activity were significantly higher in S4 and S6 groups than in other groups at each time point after co-cultivation (P<0.05). Moreover, the cell proliferation of S4 group was the most significant at 7 days (P<0.05); fluorescence staining demonstrated that the osteoblasts of each group was in good condition, but the osteoblasts of S1, S2, S3, S4, and S6 groups were significantly more than other groups.In vivo ectopic osteogenesis experiments, the cartilage and new bone formation could be seen in the bone graft area of S1-S6 groups at 4 weeks after operation, and with the increase of BMP-2 content, the more new bone formation induced by the material, the higher the score of new bone formation of the material (P<0.05). Among them, S4 and S6 groups contained a large number of chondrocytes and osteoblasts in the osteogenesis area.
Conclusion
The osteogenic activity of DBM can be evaluated through BMP-2 quantitative detection combined with in vitro osteoblast proliferation and differentiation experiments.
Keywords: Demineralized bone matrix, bone morphogenetic protein 2, osteogenic activity, guanidine hydrochloride/ethylene diamine tetraacetic acid
骨缺损修复与重建一直是临床研究的重点。自体骨移植被认为是治疗骨缺损的金标准，但来源受限是其最大不足。同种异体骨是自体骨理想替代材料[1-3]，其来源相对广泛，具有良好的生物相容性和骨诱导活性，已广泛用于临床硬组织修复[4]。自 20 世纪 60 年代 Urist 在同种异体骨中发现了BMP-2 后，BMP-2 得到越来越多研究关注[5-6]。BMP-2 是一种多功能生长因子，属于 TGF-β 超家族，在刺激成骨分化的骨诱导过程中扮演着重要角色。临床前和临床研究均表明，BMP-2 可用于各种治疗性干预措施，例如骨缺损、不愈合骨折、脊柱融合、骨质疏松症的治疗及根管治疗术[5, 7-9]。
脱钙骨基质（demineralized bone matrix，DBM）是目前临床常用的一种同种异体骨移植材料，脱钙处理可以使骨组织中的 BMP-2 蛋白暴露，提高材料的成骨活性。目前，常用的同种异体 DBM 成骨能力评价方法为裸鼠体内异位成骨诱导实验[10]，耗时较长，不适用于组织库和同种异体骨生产型企业，因此需要寻求一种科学、简易的评价方法。本研究通过 4 种方法提取 DBM 中 BMP-2，检测材料中 BMP-2 含量，并通过体外及体内实验评价材料成骨活性，探讨 DBM 中 BMP-2 含量与其成骨活性的相关性，以期寻找一种简易、便捷评价 DBM 成骨活性的方法。
1. 材料与方法
1.1. 实验材料及主要试剂、仪器
9 具人尸体左侧股骨中段标本用于制备 DBM，由上海亚朋生物技术有限公司提供。小鼠胚胎成骨细胞 MC3T3-E1 由上海生命科学研究院细胞中心提供。BALB/c 雄性裸小鼠 30 只，体质量（25±5）g，由北京大学口腔医院动物实验室提供，手术及取材均在动物实验室完成。
10% 中性甲醛（南昌雨露实验器材有限公司）；Ⅰ型胶原酶、氨基己酸、MTT、磷酸对硝基苯酯（p-nitrophenyl phosphate，pNPP）、DMSO（Sigma 公司，美国）；Tris-HCl、RIPA 裂解液、蛋白酶抑制剂（上海碧云天生物技术有限公司）；乙二胺四乙酸、Triton X-100（国药集团化学试剂有限公司）；苯甲脒盐酸盐（Adamas 公司，瑞士）；青霉素/链霉素（GIBCO 公司，美国）；PBS（浙江天杭生物科技股份有限公司）；α-MEM 培养基、0.25% 胰蛋白酶（HyClone 公司，美国）；人 BMP-2 ELISA 试剂盒、BCA 蛋白质测定试剂盒（上海优选生物科技有限公司）；DAPI（江苏凯基生物技术股份有限公司）；多聚甲醛（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；TESCA 缓冲液（北京索莱宝科技有限公司）。
LT-100 连续投料粉碎机（北京兴时利和科技发展有限公司）；KQ250B 型超声波清洗器（昆山市超声波仪器有限公司）；EG1150 H 病理组织包埋机（Leica 公司，德国）；BX50 荧光显微镜、IX71 倒置荧光显微镜（Olympus 公司，日本）；倒置显微镜（Nikon 公司，日本）；CO2 培养箱（济南鑫贝生物技术有限公司）；酶标仪（Tecan 公司，瑞士）；高速冷冻离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）。
1.2. DBM 制备
将 9 具股骨标本解冻、去除软组织，制备成大小为 5 mm×10 mm×20 mm 骨块；高压冲洗后晾干，置于粉碎机中低温保护粉碎；筛选粒径为 0.1～1.0 mm 颗粒，脱脂处理并晾干后进行脱钙操作。具体脱钙方法：① 浓盐酸与纯化水按照体积比（V/V）1∶20 配置成稀盐酸作为脱钙液。② 将骨颗粒与脱钙液按照质量比（W/W）1∶20 加入锥形瓶中，置于恒温摇床上，以 25℃、180 r/min 条件脱钙处理 24 h；③ 取出骨颗粒，以纯化水洗去残留脱钙液，冷冻干燥 48 h，获得 DBM。9 具标本获得的 DBM 分别标记为 S1～S9，PA/PE 尼龙袋分装，3 层密封，60Co 辐照灭菌（剂量 25 kGy）。取任一 S1～S9 DBM 置于高压灭菌锅内，于 121℃ 处理 30 min 进行灭活处理。
1.3. BMP-2 提取及检测
取 S1～S9 DBM 标本以及灭活 DBM 标本（对照），分别采用 4 种方法提取 BMP-2 后，参照人 BMP-2 ELISA 试剂盒说明书检测提取的 BMP-2 含量。每个样品设置 6 个复孔。
① 蛋白酶抑制剂法：将 0.2 g DBM 样品置于 1 mL 添加蛋白酶抑制剂的 Tris-HCl 溶液，于 4℃ 静置 2 h，将混合物以离心半径 8.5 cm、12 000 r/min离心 10 min，将上清液置于–80℃ 条件下储存待检测。
② 胶原酶法：将 0.2 g DBM 样品置于 1.5 mL EP 管中，加入 1 mL 0.2 mol/L Tris-HCl 溶液，于 37℃ 温育 2 h；加入 TESCA 缓冲液配置的Ⅰ型胶原酶溶液，于 37℃ 水浴中孵育过夜；以离心半径 8.5 cm、12 000 r/min 离心 20 min。将上清液于 4℃ 条件下超滤透析纯化蛋白，−80℃ 条件下储存待检测[11-12]。
③ 盐酸胍/EDTA 法：将 30 mg DBM 样品置于含 5 mmol/L 苯甲脒盐酸盐、1 mmol/L 苯甲基磺酰和 0.1 mmol/L 氨基己酸的盐酸胍/EDTA 溶液（Tris 配置，pH7.4）。于 4℃ 水溶液中透析 72 h，每 24 小时更换 1 次透析液。取透析袋内混合物以离心半径 8.5 cm、12 000 r/min 离心 10 min；取上清液保存于−80℃ 待检测[13-14]。
④ RIPA 裂解液法：将 0.1 g DBM 样品置于 1.5 mL EP 管中，加入 1 mL RIPA 裂解液以及 10 μL 蛋白酶抑制剂、10 μL 0.1 mmol/L EDTA 溶液，于 4℃ 条件下吹打混合物直至组织裂解。然后，以离心半径 8.5 cm、12 000 r/min 离心 20 min；取上清液保存于−80℃ 待检测。
1.4. 体外成骨性能评价
1.4.1. DBM 与成骨细胞共培养
将 MC3T3-E1 细胞置于含 1% 青霉素/链霉素和 10%FBS 的 α-MEM 培养基中，于 37℃、5%CO2 培养箱中培养。每隔 1 d 换液，待细胞融合约 90% 时进行传代，取第 3 代细胞进行实验。采用 0.25% 胰蛋白酶溶液消化细胞，调整细胞浓度为 5.0×104个/mL。S1～S9 DBM 骨粉（S1～S9 组）以及灭活 DBM 骨粉（对照组）各取 1 mg，分别加入 24 孔培养板中，每孔加入 1.5 mL 细胞悬液，置于 37℃ 培养箱中培养。
1.4.2. 观测方法
① MTT 法检测细胞增殖：共培养 1、4、7 d 后，每组各取 3 孔，分别加入 600 μL 5 mg/mL MTT，于 37℃ 放置 4 h；弃去 MTT 并加入 400 μL DMSO 振荡 10 min；酶标仪测量 492 nm 处吸光度（A）值。
② 荧光染色观察：共培养 7 d 后每组取 3 孔，PBS 溶液洗涤 2 次去除未贴壁细胞；将贴壁细胞置于 4% 多聚甲醛固定 40 min，PBS 溶液冲洗 3 次；DAPI 对细胞核进行染色。倒置荧光显微镜下观察染色的细胞核。
③ ALP 活性检测：共培养 7、14 d，每组各取 3 孔，−20℃ 下加入 0.2%Triton X-100 裂解细胞 10 min，置于 4℃ 冰箱裂解 1 h；吹打细胞悬液，于 4℃ 以离心半径 8.5 cm、10 000 r/min 离心 10 min；取上清液与 100 μL 1 mg/mL pNPP 反应溶液混合，于 37℃ 反应 30 min。通过测量 405 nm 波长处A值确定 MC3T3-E1 细胞 ALP 活性，使用 BCA 蛋白质测定试剂盒在 562 nm 波长处测定总蛋白质含量。用总蛋白质浓度将 ALP 的相对活性进行标准化。
1.5. 体内异位成骨诱导实验
1.5.1. 实验分组及方法
将 30 只 BALB/c 雄性裸小鼠分为 10 组，分别为 S1～S9 DBM 组（S1～S9 组）以及灭活 DBM 组（对照组），每组 3 只。各组裸小鼠腹腔注射 1% 戊巴比妥钠（0.2 mL/只）麻醉后，分别于双侧后肢大腿中部制备肌袋，根据分组每个肌袋植入对应 0.1 mL DBM 样品。
1.5.2. 组织学观察
术后 4 周处死全部裸小鼠，取植入材料及其周围组织，固定、脱钙、包埋、切片（片厚 5 μm），常规 HE 染色后进行组织学观察，评价新骨形成情况。新骨形成参照 “YY/T 1680-2020 同种异体修复材料脱矿骨材料的体内成骨诱导性能评价”[15]中的组织学结果评定标准进行半定量评价。由 2 个研究人员独立盲评并统计。
1.6. 统计学方法
采用 SPSS20.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 SNK 检验；两组间比较采用独立样本t检验；检验水准α=0.05。
2. 结果
2.1. BMP-2 含量检测
4 种方法从 DBM 中提取的 BMP-2 检测结果见图 1。其中，盐酸胍/EDTA 法 BMP-2 提取效率最高，蛋白酶抑制剂法最低。而且，不同供体制备的 DBM 中 BMP-2 含量差异较大，其中材料 S4 的 BMP-2 含量最高（平均 64.67 ng/g），其次为 S6（平均 52.35 ng/g）、S1（平均 37.23 ng/g）、S3（平均27.84 ng/g）、S2（平均 27.63 ng/g）、S5（平均 20.63 ng/g）、S8（平均 16.26 ng/g）、S7（平均 9.26 ng/g）、S9（平均 6.33 ng/g）。灭活 DBM 的 BMP-2 含量（平均 1.34 ng/g）明显低于上述未灭活 DBM。其中灭活 DBM 以及 S7、S8、S9 材料的 BMP-2 含量均低于 20 ng/g。
图 1.
Comparison of BMP-2 contents extracted by 4 methods for S1-S9 and inactivated DBMs
S1～S9 以及灭活 DBM 经 4 种方法提取的 BMP-2 含量 比较
2.2. 体外成骨性能评价
2.2.1. MTT 法检测细胞增殖
共培养后各组细胞A值均逐渐增加。其中，共培养 1 d，与对照组比较，S1、S2、S3、S4、S6 组A值明显增加，差异有统计学意义（P<0.05）；与 S4 组相比，S5、S7、S8、S9 组A值明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）；其余组间比较差异均无统计学意义（P>0.05）。4 d 时，与对照组比较，S4、S6 组明显增高（P<0.05）；并且 S4 组明显高于其他 DBM 组（P<0.05）。7 d 时，与对照组比较，S1～S6 组A值均明显增高（P<0.05），且 S4 组明显高于其他 DBM 组（P<0.05）。见图 2。
图 2.
The proliferations of MC3T3-E1 cells co-cultured with different DBMs for 1, 4, and 7 days by MTT method
MTT 法检测 MC3T3-E1 细胞与不同 DBM 共培养 1、4、 7 d 增殖情况
2.2.2. 荧光染色观察
倒置荧光显微镜下观察，共培养 7 d 后各组成骨细胞均状态良好，可见丝状伪足，其中 S1、S2、S3、S4、S6 组成骨细胞多于其他组，且 S4 组成骨细胞最多。见图 3。
图 3.
Fluorescence staining observation of each group (Inverted fluorescence microscope×100)
各组荧光染色观察（倒置荧光显微镜×100）
a. 对照组；b～j. S1～S9 组
a. Control group; b-j. S1-S9 groups
2.2.3. ALP 活性检测
共培养 7 d 时，与对照组比较，S1、S2、S3、S4、S6 组 ALP 活性明显增高（P<0.05）；其余组间比较差异均无统计学意义（P>0.05）。14 d 时，与对照组比较，S4、S6 组 ALP 进一步增加（P<0.05），且 S4、S6 组间差异无统计学意义（P>0.05）；与 S4 组比较，S7、S8、S9 组 ALP 明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）；其余组间比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见图 4。
图 4.
ALP activity in each group for 7 and 14 days of co-cultivation
共培养 7 d 及 14 d 各组 ALP 活性检测
2.3. 体内异位成骨诱导实验
术后 4 周，HE 染色观察见对照组植骨区域新生骨较少。各 DBM 组中，BMP-2 含量较高的 S1～S6 组植骨区域均可见软骨和新骨生成，并且随着 BMP-2 含量增加，材料的成骨活性越好，材料边缘的腔隙内可观察到越多的新骨生成；S4、S6 组骨新生区域含有大量软骨细胞和成骨细胞。见图 5。
图 5.
HE staining in each group at 4 weeks after operation (Left: ×100, right: ×200)
术后 4 周各组 HE 染色观察（左：×100，右：×200）
a. 对照组；b～j. S1～S9 组
a. Control group; b-j. S1-S9 groups
半定量分析显示，对照组新骨形成评分为 1 分。与对照组比较，S1～S6 组新骨形成评分明显增高（P<0.05），S7、S8、S9 组评分无明显差异（P>0.05），表明 S7、S8、S9 组无成骨活性。见图 6。
图 6.
Semi-quantitative score of histological observation in each group at 4 weeks after operation
术后 4 周各组组织学观察半定量评分
3. 讨论
研究者普遍认为 DBM 中的 BMP-2 是诱导体内异位成骨的主要因素，因此可通过直接检测 BMP-2 含量间接评估 DBM 产品体内成骨活性，是一种快速、便捷的方法。目前，BMP-2 提取方法主要有胶原酶法、蛋白酶抑制剂法、盐酸胍/EDTA 法和 RIPA 裂解液法。本研究显示上述 4 种方法的 BMP-2 提取效率差异较大，其中盐酸胍/EDTA 法效率最高，分析与 BMP 蛋白是一种酸性多肽，不溶于水，可溶于中性盐溶液，尤其是盐酸胍溶液中有关。为此，Cook[16]的研究选择将 BMP 溶于盐酸胍溶液后，直接注入新鲜骨折模型中。但是上述 BMP-2 提取方法存在需脱钙、浸提处理以及长时间暴露于体外等问题，造成 BMP-2 蛋白失活，因此不能准确反映 DBM 中的真实 BMP-2 含量，故通过单纯 BMP-2 定量检测评价 DBM 成骨活性具有一定局限性。
相比体内异位成骨实验，体外细胞实验是一种经济的评价 DBM 活性方法。BMP-2 是一种包含 396 个氨基酸的多肽生长因子，可诱导未分化的 MSCs 形成软骨和骨组织，促进成骨细胞增殖[17-18]，是促进成骨分化能力最强的细胞因子[19-20]，以此促使成骨细胞 ALP 表达升高。而且细胞对 BMP-2 的刺激具有较高敏感性，可以精确反映不同骨组织中 BMP-2 含量的微小差异。但是，目前尚无证据表明 BMP-2 含量与细胞增殖分化和 ALP 活性具有剂量关系。本研究发现随着 DBM 中 BMP-2 含量升高，共培养的成骨细胞增殖能力也越强。当成骨细胞与 DBM 材料共培养 7 d，BMP-2 含量低于 20 ng/mg 的 DBM 样品 S7、S8、S9 中共培养的细胞增殖能力较差，与灭活 DBM 相比无显著差异。该结果与 14 d 时 ALP 表达检测结果相对应。
体内异位成骨实验能够直接且全面地评价材料成骨活性。本研究结果提示，随着 DBM 中 BMP-2 含量升高，其体内成骨活性也越强。其中 BMP-2 含量最高的DBM S4 表面有大量成骨细胞吸附，成骨最活跃，表现出最佳成骨活性，新骨形成评分也最高。相对而言，BMP-2 含量较低的 S7、S8 及 S9 成骨活性较差，与灭活 DBM 相比无显著性差异，新骨形成评分也较低。体内的异位成骨实验结果与体外细胞实验以及 BMP-2 定量结果相对应，体现出三者的相关性。
综上述，BMP-2 含量会显著影响 DBM 成骨活性。当 BMP-2 含量>20.63 ng/g 时，DBM 成骨活性较好；<16.26 ng/g 时，DBM 在体内及体外均不具备骨诱导能力。这为组织库或同种异体骨生产企业评价 DBM 产品提供了新的思路。然而本研究样本量较少，对于通过 BMP-2 定量检测和体外成骨细胞增殖分化实验评估 DBM 成骨活性的准确度，有待进一步探究。
作者贡献：李淼直接参与DBM制备、BMP-2提取及检测、体外细胞实验以及数据收集和文章撰写；潘小亮参与DBM制备；汪晶晶、陈维明、骆井万、胡凯参与动物实验；白玉龙、陈金发提供实验设计思路并把控实验实施、文章修改并，对文章的知识性内容作批评性审阅。
利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。
机构伦理问题：研究方案经北京大学生物医学伦理委员会实验动物福利伦理分会委员批准（LA2019019）。
Funding Statement
2020上海市科技型中小企业技术创新资金（200H1029400）
Shanghai Technology Innovation Funds for Small and Medium-Sized Technological Enterprises 2020 (200H1029400)
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