Abstract
目的
研究低能量激光照射（LLLI）对脂多糖（LPS）介导人牙周膜成纤维细胞（hPDLFs）炎性损伤的影响及机制。
方法
将hPDLFs接种于培养板内，随机分为正常组、LPS组和LPS+LLLI组。正常组细胞行常规培养基培养，LPS组及LPS+LLLI组在加入1 mg·L−1 LPS培养基中培养24 h，LPS+LLLI组3个亚组分别接受不同强度照射。4 d后检测各组细胞凋亡、活力及细胞内游离Ca2+浓度，酶联免疫吸附试验检测各组细胞上清液中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-8、IL-1β及IL-6的含量，逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）及Western blot检测各个实验组hPDLFs的基质金属蛋白酶（MMP）-2、MMP-3、MMP-9基因和蛋白的表达。
结果
与正常组比较，LPS组hPDLFs细胞凋亡率及细胞内游离Ca2+浓度增加，细胞活力降低（P<0.05），细胞上清液中TNF-α、IL-8、IL-1β及IL-6的含量显著升高（P<0.05），hPDLFs的MMP-2、MMP-3、MMP-9基因和蛋白的表达显著升高（P<0.05）。与LPS组比较，LPS+LLLI组细胞凋亡率及细胞内游离Ca2+浓度降低，细胞活力升高（P<0.05），细胞上清液中TNF-α、IL-8、IL-1β及IL-6的含量显著降低（P<0.05），hPDLFs的MMP-2、MMP-3、MMP-9基因和蛋白的表达显著降低（P<0.05）。
结论
LLLI对LPS诱导 hPDLFs炎性损伤有保护作用，照射强度为4 J·cm−2时效果最明显。
Keywords: 低能量激光照射, 人牙周膜成纤维细胞, 脂多糖, 炎性损伤, 影响
Abstract
Objective
To study the effect and mechanism of low-level laser irradiation (LLLI) on lipopolysaccharide (LPS)-induced inflammatory injury of human periodontal ligament fibroblasts (hPDLFs).
Methods
hPDLFs were inoculated into well plates and randomly divided into the normal group, LPS group, and LPS+LLLI group. The cells in the normal group were cultured in conventional medium. The hPDLFs in the LPS and LPS+LLLI groups were cultured in RPMI1640 medium containing 1 mg·L−1 LPS. The three subgroups of the LPS+LLLI group were exposed to different LLLI. After 4 days, the cell apoptosis, viability, and intracellular free Ca2+ concentration of each group were measured. The contents of tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin (IL)-8, IL-1β, and IL-6 were measured by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and Western blot were used to detect the expression of matrix metalloproteinase (MMP)-2, MMP-3, and MMP-9 genes and proteins of hPDLFs in each group.
Results
Compared with the normal group, the LPS group showed increased apoptosis rate of hPDLFs and intracellular free Ca2+ concentration and decreased cell viability (P<0.05). The TNF-α, IL-8, IL-1β, and IL-6 levels were higher in the cell supernatant (P<0.05), and the expression of MMP-2, MMP-3, and MMP-9 genes and proteins of hPDLFs was significantly increased (P<0.05). Compared with the LPS group, the LPS+LLLI group showed significantly decreased apoptosis rate and intracellular free Ca2+ concentration and significantly increased cell viability (P<0.05). The TNF-α, IL-8, IL-1β, and IL-6 levels in the supernatant of cells and the expression of MMP-2, MMP-3, and MMP-9 genes and proteins of hPDLFs were significantly decreased (P<0.05).
Conclusion
LLLI has a protective effect on the inflammatory injury of hPDLFs induced by LPS, and the effect is most obvious when the irradiation intensity is 4 J·cm−2.
Keywords: low-level laser irradiation, human periodontal ligament fibroblasts, lipopolysaccharide, inflammatory injury, effect
牙周炎为慢性破坏性疾病，长期慢性炎性因子浸润导致牙周膜细胞的损伤和凋亡，使得牙周胶原纤维破坏，严重的炎症反应会造成不可逆的牙周损伤导致牙龈萎缩甚至是牙龈坏死。研究[1]–[2]显示人牙周膜成纤维细胞（human periodontal ligament fibroblasts，hPDLFs）在牙周炎受损、牙周组织功能维持和修复中发挥着极其重要的作用，有效阻断牙周炎过程中hPDLFs的损伤对促进牙周组织修复有着重要意义。低能量激光照射（low-level laser irradiation，LLLI）指的是输出功率在500 mW内，能量密度范围0.04~50 J·cm−2，波长范围600~1 100 nm的近红外或红色光激光[3]。LLLI是近年来临床上常用的理疗方法，其在治疗神经性和糖尿病溃疡疾病方面以及促进骨组织和软组织的愈合方面均有较好的作用，其在治疗牙周疾病及牙周炎方面亦有显著疗效[4]–[6]。目前有报道[7]显示LLLT可能通过调节腺苷-3′,5′-环化一磷酸（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）/核转录因子-κB（nuclear transcription factor kappa B，NF-κB）抑制脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的人牙周膜细胞炎症反应，但是关于LLLI对hPDLFs炎性损伤的影响和作用有待进一步研究，本研究拟探讨LLLI对LPS介导hPDLFs炎性损伤的影响及机制。
1. 材料和方法
1.1. 材料和仪器
hPDLFs（上海中乔新舟生物科技有限公司，货号：2630）。HRP标记的山羊抗兔多克隆抗体、HRP标记的山羊抗兔多克隆抗体、大肠埃希菌（Escherichia coli，E.coli）LPS、基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-2、MMP-3、MMP-9、磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH）单克隆抗体（Sigma公司，美国），白细胞介素（interleukin，IL）-8酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒、IL-6 ELISA试剂盒、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA试剂盒、IL-1β ELISA试剂盒（杭州联科生物技术股份有限公司），Trizol试剂盒、CCK8细胞增殖检测试剂盒、Hoechst染色试剂盒、Western blot试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），相关引物合成（北京赛百胜生物技术公司），DMEM低糖培养基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（Gibco公司，美国），CO2培养箱（Thermo Scientific Forma公司，美国），酶标仪（Bio-Rad公司，美国），Fluo-8/AM（Invitrogen公司，美国），Insight-PlusIQ型激光共聚焦显微镜（Meridian公司，美国），荧光相差显微镜（北京荣兴光恒科技有限公司）。
1.2. 方法
1.2.1. hPDLFs的培养
hPDLFs复苏后以10% FBS的低糖DMEM培养基在37 °C、5% CO2饱和湿度的细胞培养箱中培养。每隔1 d换液，于荧光相差显微镜下观察细胞形态及生长状况，待细胞处于对数生长期时用于后续实验。
1.2.2. 分组
将hPDLFs接种于5个不同培养板内培养，随机分为正常组、LPS组、LPS+LLLI组。正常组细胞行常规培养基培养，LPS组和LPS+LLLI组在加入含1 mg·L−1浓度的 LPS培养基中培养24 h后，LPS组继续常规培养及换液，LPS+LLLI组3个亚组在常规培养及换液的基础上分别接受2、4、6 J·cm−2的LLLI。采用输出功率为100 mW~12 W半导体激光器，波长为980 nm。功率密度设置为141.5 mW·cm−2，第1次激光照射，记为第0天，并于第0~3天连续照射4 d，4 d后行后继检测。照射时间（s）=能量密度（J·cm−2）/功率密度（W·cm−2）。2 J·cm−2组照射时间为14.13 s，4 J·cm−2组照射时间为28.27 s，6 J·cm−2组照射时间为42.40 s。
1.2.3. CCK-8测定细胞活力值
LLLI处理后，将5组细胞取出以测定每个组hPDLFs的细胞增殖活力。使用PBS清洗hPDLFs 2次后，采用完全培养液重悬细胞，以密度为每孔1×104个接种于96孔板。随后向其中加10 µL CCK8试剂，37 °C下孵育2 h，酶标仪上测定450 nm波长下的光密度（optical density，OD）值，细胞存活率=（OD实验组/OD对照组）×100%。
1.2.4. 细胞内游离Ca2+浓度的测定
LLLI处理后，将5组hPDLFs经PBS冲洗2次，于37 °C条件下用终浓度为10 µmol·L−1 Fluo-8/AM培养箱中孵育细胞45 min，无钙PSS溶液清洗2遍，将盖玻片倒置密封小室上，并向小室中加入500 µL生理盐液，经过488 nm的氢激光激发产生荧光，通过Insight-PlusIQ型激光共聚焦显微镜对荧光强度行测定。细胞内Ca2+浓度=Kd[（F-Fmin）/（Fmax-F）]，式中Kd为400 nmol·L−1；F为所测到的相对荧光值；Fmax为加入10 µmol·L−1的高钙液后所得最大荧光值；Fmin为加入10 µmol·L−1无钙液后所得最小荧光值。
1.2.5. Hoechst染色检测细胞凋亡率
LLLI处理后，将5组hPDLFs经PBS洗2次，经4%多聚甲醛固定15 min，PBS漂洗后，每孔加入0.5 mL的Hoechst染色液，于温箱中37 °C下孵育30 min，PBS洗去染料后，于倒置荧光显微镜下观察，拍照，随机取5个视野，正常细胞核染成均匀蓝色，凋亡细胞胞核碎裂浓缩，呈现明亮蓝色，计算细胞凋亡率。
1.2.6. ELISA测定细胞上清液炎性因子
LLLI处理后，采用ELISA法按说明书测定每个实验组hPDLFs细胞上清液中TNF-α、IL-8、IL-1β和IL-6炎性因子含量，经离心取各组细胞上清液为样品进行分析，按相应的试剂盒说明书进行上清液中细胞因子的含量测定，利用酶标仪PR-521读取各样品细胞OD值，按照标准品浓度及对应的OD值建立标准曲线确定TNF-α、IL-8、IL-1β和IL-6炎性因子含量。
1.2.7. MMP-2、MMP-3、MMP-9基因表达
LLLI处理后，采用逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）测定5个实验组hPDLFs中MMP-2、MMP-3、MMP-9基因的表达水平。加入TRIzol试剂对各组细胞进行裂解后，提取hPDLFs的总RNA。依据逆转录说明书行相应cDNA合成并进行扩增。扩增条件均为95 °C预变性1 min，95 °C变性30 s，59 °C退火30 s，59 °C延伸30 s，共40个循环。MMP-2上游引物序列：5′-TGACTTTCTTGGATCGGGTCG-3′，下游引物序列：5′-AAGCACCACAGATGACTG-3′；MMP-3上游引物序列：5′-AGTCTTCCAATCCTACTGTTGCT-3′，下游引物序列：5′-TCCCCGTCACCTCCAATCC-3′；MMP-9上游引物序列：5′-TGTACCGCTATGGTTACACTCG-3′，下游引物序列：5′-GGCAGGG ACAGTTGCTTCT-3′；内参GAPDH上游引物序列：5′-TGTGGGCATCAATGGATTTGG-3′，下游引物序列：5′-ACACCATGTATTCCGGGTCAAT-3′。目的基因灰度值与GAPDH灰度值的比值为MMP-2、MMP-3、MMP-9 mRNA的表达水平。
1.2.8. MMP-2、MMP-3、MMP-9蛋白表达
LLLI处理后，通过Western blot测定5个实验组hPDLFs中MMP-2、MMP-3、MMP-9蛋白的相对表达水平。提取并定量测定hPDLFs总蛋白，将变性后的蛋白进行电泳，电泳槽内加入足量电泳液，40 V条件下电泳4~5 h，电泳后对其进行转膜，转膜时长40 min，转膜后用TBST缓冲液反复冲洗，置于4 °C条件下封闭12 h，向其中加入MMP-2、MMP-3、MMP-9一抗（1∶1 000），加入一抗后进行振荡使其充分接触，振荡时间为1 h，1 h后用上述同样的冲洗方法冲洗后；加入HRP标记的二抗（1︰1 500）后再次进行振荡使其充分接触，振荡1 h并再次冲洗3次，最后用DAB显色法显影，拍摄Ｘ射线胶片，用Image J图像分析软件对各组条带行灰度值分析，以GAPDH作为内参。目的蛋白与内参灰度比值为MMP-2、MMP-3、MMP-9蛋白表达相对表达水平。
1.3. 统计学分析
采用SPSS 20.0统计软件对实验结果进行分析，数据以均数±标准差表示，实验数据用K-S检验符合正态分布，多组均数间的比较采用方差分析，两两比较应用最小显著差法（LSD法）进行处理，P<0.05时表示差异有统计学意义。
2. 结果
2.1. hPDLFs细胞培养
在细胞接种后24 h，显微镜下观察可见大部分hPDLFs贴壁，细胞呈长梭形或多角形，胞体较为丰满，胞质均匀，细胞两端有较细长的突起，3 d换液一次，按1∶2传代，经过几次传代，处于对数生长期的hPDLFs生长较为旺盛，免疫荧光显微镜下hPDLFs绿色荧光鉴定波形丝蛋白阳性，为中胚层来源的成纤维细胞（图1左）。相差显微镜下观察其排列形状多为栅栏状、漩涡状或放射状（图1右）。
图 1. hPDLFs的鉴定 × 200.
Fig 1 Identification of hPDLFs × 200
左：波形丝蛋白免疫荧光；右：相差显微镜。
2.2. 细胞存活率及细胞内Ca2+浓度
与正常组比较，LPS组hPDLFs细胞内游离Ca2+浓度增加，细胞活力降低（P<0.05）。与LPS组比较，LPS+LLLI组细胞内游离Ca2+浓度降低，细胞活力升高（P<0.05）。结果表明，LLLI对LPS诱导hPDLFs炎性损伤有保护作用，降低细胞内游离Ca2+浓度，照射强度为4 J·cm−2时效果最明显（表1）。
表 1. 细胞存活率及细胞内Ca2+浓度.
Tab 1 Cell survival rate and intracellular calcium ion concentration
| 组别 | 细胞存活率/% | 细胞内Ca2+浓度/（nmol·L−1） |
| 正常组 | 100* | 226.69±19.45* |
| LPS组 | 34.52±7.86# | 312.38±28.08# |
| 2 J·cm−2组 | 52.36±11.38#*@ | 257.25±26.32#*@ |
| 4 J·cm−2组 | 72.5±12.25#* | 281.42±24.37#* |
| 6 J·cm−2组 | 55.54±9.46#*@ | 251.24±21.32#*@ |
注：与正常组相比，#P<0.05；与LPS组相比，*P<0.05；与4 J·cm−2组相比，@P<0.05。
2.3. Hoechst染色凋亡率检测
与正常组凋亡率（7.8%±2.6%）相比较，LPS组hPDLFs细胞凋亡率（46.2%±6.4%）显著增加（P<0.05）；与LPS组相比较，LPS+LLLI各亚组细胞凋亡率（2、4、6 J·cm−2组细胞凋亡率分别为39.7%±4.8%、23.1%±3.1%、31.8%±5.7%）降低（P<0.05）。结果表明，LLLI对LPS诱导hPDLFs炎性损伤有保护作用，减少细胞凋亡，照射强度为4 J·cm−2时效果最明显（P<0.05）（图2）。
图 2. Hoechst染色检测hPDLFs细胞凋亡率 荧光显微镜 × 200.
Fig 2 Detection of apoptosis rate of hPDLFs by Hoechst staining fluorescence microscope × 200
A：正常组；B：LPS组；C：2 J·cm−2组；D：4 J·cm−2组；E：6 J·cm−2组。
2.4. 细胞上清液中炎性因子含量
采用ELISA法测定各组细胞上清液炎性因子含量，与正常组比较，LPS组细胞上清液中TNF-α、IL-8、IL-1β及IL-6的含量显著升高（P<0.05）；与LPS组相比较，LPS+LLLI各亚组细胞上清液中TNF-α、IL-8、IL-1β及IL-6的含量显著降低（P<0.05），结果表明，LLLI能够降低hPDLFs炎性损伤后细胞上清液中的炎性因子，照射强度为4 J·cm−2时效果最明显（表2）。
表 2. 细胞上清液中炎性因子含量.
Tab 2 The content of inflammatory factors in cell supernatant
| 组别 | TNF-α | IL-8 | IL-1β | IL-6 |
| 正常组 | 0.79±0.14* | 0.92±0.02* | 1.03±0.04* | 0.84±0.03* |
| LPS组 | 5.27±0.08# | 6.38±0.06# | 7.14±0.06# | 3.36±0.05# |
| 2 J·cm−2组 | 3.92±0.05#*@ | 5.06±0.07#*@ | 5.86±0.05#*@ | 2.47±0.04#*@ |
| 4 J·cm−2组 | 2.82±0.02#* | 3.56±0.04#* | 3.75±0.06#* | 1.38±0.02#* |
| 6 J·cm−2组 | 3.48±0.03#*@ | 5.01±0.06#*@ | 5.64±0.03#*@ | 2.35±0.03#*@ |
注：与正常组相比，#P<0.05；与LPS组相比，*P<0.05；与4 J·cm−2组相比，@P<0.05。
µg·L−1，x ± s
2.5. MMP-2、MMP-3、MMP-9基因表达水平
与正常组比较，LPS组hPDLFs的MMP-2、MMP-3、MMP-9基因的表达显著升高（P<0.05）。与LPS组相比较，LPS+LLLI各亚组hPDLFs的MMP-2、MMP-3、MMP-9基因的表达显著降低（P<0.05）。结果表明，LLLI能够降低hPDLFs炎性损伤后细胞MMP-2、MMP-3、MMP-9基因的表达水平，照射强度为4 J·cm−2时效果最明显（P<0.05）（图3）。
图 3. MMP-2、MMP-3、MMP-9基因表达.
Fig 3 MMP-2, MMP-3, MMP-9 gene expression
与正常组相比，#P<0.05；与LPS组相比，*P<0.05；与4 J·cm−2组相比，@P<0.05。
2.6. MMP-2、 MMP-3、 MMP-9蛋白表达水平
与正常组比较，LPS组hPDLFs的MMP-2、MMP-3、MMP-9蛋白的表达显著升高（P<0.05）。与LPS组相比较，LPS+LLLI各亚组hPDLFs的MMP-2、MMP-3、MMP-9蛋白的表达显著降低（P<0.05）。结果表明，LLLI能够降低hPDLFs炎性损伤后细胞MMP-2、MMP-3、MMP-9蛋白的表达，照射强度为4 J·cm−2时效果最明显（P<0.05）（图4）。
图 4. MMP-2、 MMP-3、 MMP-9蛋白表达.
Fig 4 MMP-2, MMP-3, MMP-9 protein expression
与正常组相比，#P<0.05；与LPS组相比，*P<0.05；与4 J·cm−2组相比，@P<0.05。
3. 讨论
慢性牙周炎是最常见的牙周病，其中牙周膜成纤维细胞（periodontal ligament fibroblasts，PDLFs）在牙周炎时损伤凋亡是该病理过程的重要重要环节，本研究使用LPS刺激hPDLFs可以模拟牙周炎症反应过程，LPS选择1 mg·L−1的浓度，参考国内外参考文献，和早前的预实验发现该浓度正合适能够引起中度的hPDLFs炎性损伤，为后继研究提供炎性损伤模型，虽然加大LPS浓度，能够显著抑制hPDLFs的存活，但是考虑临床过程中慢性牙周炎是轻中度的长期炎性刺激，故1 mg·L−1的浓度既能导致细胞炎症，也没有造成细胞大量死亡，是一个合理的诱导剂量，但该浓度仍较参考文献浓度低，考虑与本研究hPDLFs实验前液氮存储冻存复苏后进行LPS诱导有关，冻存复苏对细胞的状态有影响所致，hPDLFs细胞对LPS诱导损伤敏感性升高[7]–[9]。结果显示LPS诱导能够显著上调hPDLFs细胞上清液中TNF-α、IL-8、IL-1β及IL-6的含量，hPDLFs细胞增殖率降低，凋亡增加，细胞内游离Ca2+浓度增加，表明该牙周炎体外细胞模型成功。在此过程中TNF-α、IL-8、IL-1β和IL-6等炎性因子浸润导致牙周组织细胞内钙超载，最终导致细胞外基质中MMP-2、MMP-3、MMP-9的高表达，MMPs是一类含Zn2+的中性蛋白水解酶，能降解细胞外基质（extracellular matrix，ECM），MMPs高表达在牙周炎牙周组织破坏中起着尤为重要的作用[10]–[12]，本研究LPS介导炎性损伤后，hPDLFs细胞MMP-2、MMP-3、MMP-9基因和蛋白表达显著升高印证了这一点。
本研究结果显示经LLLI处理后，LPS介导的hPDLFs增殖活性上升且细胞凋亡率下降，细胞内游离Ca2+浓度亦显著降低；据此可知，LLLI可以显著缓解LPS引起的hPDLFs炎性损伤。进一步采用ELISA法测定，与LPS组比较，LPS+LLLI组细胞上清液中TNF-α、IL-8、IL-1β及IL-6的含量显著降低，表明LLLI对LPS诱导hPDLFs炎性损伤有保护作用，LLLI能够降低hPDLFs炎性损伤后细胞上清液中的炎性因子，照射强度为4 J·cm−2时效果最明显。有研究[12]–[14]表明，牙周炎患者龈沟液中MMP-2、MMP-3和MMP-9的活性增高。此外，随着牙龈炎症程度的增加，MMP活性和表达也增加，因此，MMP途径可能是牙周组织破坏的关键途径，降低其表达意义重大。本研究中LLLI对LPS诱导 hPDLFs炎性损伤后细胞MMP-2、MMP-3和MMP-9的表达检测显示，与LPS组相比，LPS+LLLI各亚组MMP-2、MMP-3和MMP-9显著降低，照射强度为4 J·cm−2时效果最明显，起到了阻断MMP途径的作用。
综上所述，经过LLLI处理后可显著改善LPS诱导的hPDLFs炎性损伤。推测LLLI可能是通过降低细胞上清液中TNF-α、IL-8、IL-1β和IL-6的含量进而降低hPDLFs炎性损伤后细胞MMP-2、MMP-3和MMP-9的表达水平来发挥抗炎作用，本研究结果可为临床上采用LLLI治疗牙周炎提供理论依据和借鉴。
Footnotes
利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。
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