急性T淋巴细胞白血病（T-ALL）是一类临床特征和预后异质性较大的疾病，遗传学异常是T-ALL的重要预后因素[1]。在T-ALL中，NOTCH1和FBXW7基因突变引起NOTCH1信号通路异常激活[2]，NOTCH1信号的组成性激活是T细胞转化中最重要的致癌途径[3]。文献报道T-ALL中NOTCH1突变的发生率约60％，FBXW7突变的发生率为10％～24％[4]。基因拷贝数变异（CNV）是ALL预后相关的另一重要遗传学异常，在T-ALL中发生率也很高，最常见的是染色体9p21中的CDKN2A/B基因（包含p16/INK4A和p14/ARF抑癌基因）的缺失，约70％的T-ALL患者发生该基因缺失[5]。Haydu和Ferrando等[6]报道NOTCH1突变和CDKN2A/B的CNV可以将T-ALL分为不同预后的亚组。我们应用二代测序及多重链接探针基因扩增（MLPA）方法对41例T-ALL患者分别进行了NOTCH1、FBXW7等基因突变以及CDKN2A/B、IKZF1、ETV6、RB1等13种基因缺失情况的检测，结合NOTCH1、FBXW7基因突变与CDKN2A基因缺失对T-ALL患者进行了预后分析。
病例与方法
1. 病例资料：2009年1月至2019年1月中国医学科学院血液病医院白血病诊疗中心收治的41例T-ALL患者纳入研究，初诊时均采用MICM模式（细胞形态学、免疫分型、细胞遗传学、分子生物学）确诊。其中37例患者在本中心接受统一方案的化疗（ChiCTR-TRC-00000397）[7]：诱导治疗采用VDC（L）P方案，在疾病达完全缓解（CR）后患者均接受早期强化治疗、再诱导强化治疗及维持治疗。37例患者中35例达CR，2例患者持续未缓解。37例患者的中位随访时间为16.4（5.4～135.1）个月。
2. 二代测序检测T-ALL患者NOTCH1及FBXW7基因的突变情况：留取初诊时的骨髓3～5 ml，应用QIAamp DNA试剂盒（德国Qiagen公司产品）提取骨髓单个核细胞基因组DNA，取1 µg DNA制备DNA全基因组文库。使用PCR引物扩增目的基因组（175个血液肿瘤相关基因），将目标区域DNA富集后，采用Ion Torrent测序平台进行测序。测序后原始数据利用人基因组数据库（hg19/GRCh37）、dbSNP、1000 genomes、HGMD、SIFT等数据库进行生物信息学分析，确定致病基因的突变位点。平均基因覆盖率99.0％，平均测序深度1200×。
3. MLPA：利用上述DNA标本，应用SALSA MLPA P335试剂盒（荷兰MRC-Holland公司产品）进行特定基因片段的扩增，所得产物置于ABI-3730基因分析仪（美国Applied Biosystems公司产品）进行毛细管电泳，最终结果应用Coffalyser®软件进行分析。SALSA MLPA P335试剂盒中包含与ALL发病相关的13种基因：CDKN2A/B、IKZF1、EBF1、PAX5、ETV6、BTG1、RB1、SHOX-AREA、CRLF2、CSF2RA、IL3RA、P2RY8。
4. 统计学处理：应用SPSS 17.0软件对数据进行统计分析。采用描述性分析及卡方检验对基因突变、基因缺失的临床特征进行分析及比较。采用Kaplan-Meier生存曲线及Log-rank检验进行生存分析。采用Cox回归分析法对预后的影响因素进行分析。P<0.05为差异有统计学意义。
结果
一、患者临床特征
41例T-ALL患者中男29例，女12例；中位年龄26（14～64）岁；中位WBC 41.61（1.18～613.31）×109/L。在本中心接受治疗的37例患者中22例接受异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）（移植组），未接受allo-HSCT（未移植组）患者15例。具体临床特征见表1。
表1. 41例急性T淋巴细胞白血病患者基因突变及缺失情况及与临床特征的关系.
| 临床特征 | 总体（41例） | Notch1突变 |
FBXW7突变 |
CDKN2A/B缺失 |
||||||
| 是（17例） | 否（24例） | P值 | 是（10例） | 否（31例） | P值 | 是（20例） | 否（21例） | P值 | ||
| 年龄［岁，M（范围］） | 26（14～64） | 26（14～52） | 27（15～67） | 0.97 | 27（20～64） | 25（14～53） | 0.49 | 26（14～50） | 27（18～64） | 0.06 |
| 性别（例，男/女） | 29/12 | 11/6 | 18/6 | 0.53 | 9/1 | 20/11 | 0.11 | 18/2 | 11/10 | 0.01 |
| WBC［×109/L，M（范围）］ | 41.6（1.2～613.3） | 44.6（1.2～222.8） | 39.1（1.8～613.3） | 0.57 | 41.6（4.3～145.4） | 44.6（1.2～613.3） | 0.51 | 53.5（4.3～613.3） | 16.3（1.2～222.8） | 0.14 |
| 移植（例，是/否） | 22/15 | 11/6 | 11/6 | 6/4 | 16/11 | 12/7 | 10/8 | |||
| 诊断分型（例） | ||||||||||
| Pre-T | 16 | 7 | 9 | 4 | 12 | 8 | 8 | |||
| Pro-T | 11 | 3 | 8 | 2 | 9 | 3 | 8 | |||
| 髓质T | 9 | 3 | 6 | 2 | 7 | 5 | 4 | |||
| 皮质T | 5 | 4 | 1 | 2 | 3 | 4 | 1 | |||
二、基因突变与基因缺失情况
41例T-ALL患者中24例（58.5％）具有NOTCH1和（或）FBXW7（N/F）基因突变。其中NOTCH1突变患者17例（41.5％），FBXW7突变患者10例（24.4％），同时合并两种突变者3例（7.3％）。
30例（73.2％）患者可检测到基因缺失，最常见的为CDKN2A/B基因缺失（48.7％），其中20例（48.7％）为CDKN2A基因缺失，14例（34.1％）为CDKN2B基因缺失。其他常见基因缺失（发生比例>5％）包括ETV6（22.0％）、EBF1（9.8％）、RB1（7.3％）、IKZF1（7.3％）；12例（29.3％）患者无任何基因缺失。
17例NOTCH1基因突变患者中有10例（58.8％）同时合并CDKN2A/B基因缺失，1例（5.9％）合并IKZF1基因缺失，4例（23.5％）合并ETV6基因缺失。10例FBXW7基因突变患者中有8例（80.0％）同时合并CDKN2A/B基因缺失，1例（10.0％）合并IKZF1基因缺失，3例（30.0％）合并ETV6基因缺失。3例同时具有NOTCH1及FBXW7基因突变者均合并CDKN2A/B基因缺失。7例（17.1％）患者不具有NOTCH1或FBXW7基因突变及任何基因缺失。
三、不同基因突变与基因缺失的预后分析
37例接受治疗的T-ALL患者3年总生存（OS）率为（46.7±12.9）％，3年无复发生存（RFS）率为（44.6±8.5）％。移植组患者生存明显好于未移植组：3年OS率分别为（68.2±9.9）％和（7.9±7.6）％（P<0.01），3年RFS率分别为（63.6±10.3）％和（9.2±8.7）％（P＝0.001）。
1. NOTCH1和FBXW7基因突变对T-ALL预后的影响：在患者总体和接受allo-HSCT患者中，NOTCH1基因突变对生存无明显影响（P>0.05），具有FBXW7基因突变者3年OS率和RFS率高于无此突变者，但差异无统计学意义（表2）。无论在具有NOTCH1基因突变患者中还是在FBXW7基因突变的患者中，接受allo-HSCT者生存明显好于未行移植者（表3）。
表2. NOTCH1、FBXW7基因突变及CDKN2A/B缺失对急性T淋巴细胞白血病预后的影响（％，x±s）.
| 组别 | 患者总体 |
allo-HSCT患者 |
||||
| 例数 | 3年OS率 | 3年RFS率 | 例数 | 3年OS率 | 3年RFS率 | |
| NOTCH1突变 | ||||||
| 是 | 16 | 46.7±12.9 | 40.6±12.7 | 11 | 63.6±14.5 | 60.0±15.5 |
| 否 | 21 | 45.2±11.1 | 47.4±11.5 | 11 | 72.7±13.4 | 80.0±12.6 |
| FBXW7突变 | ||||||
| 是 | 9 | 71.4±17.1 | 64.8±16.5 | 6 | 83.3±15.2 | 83.3±15.2 |
| 否 | 28 | 40.6±12.7 | 38.5±9.5 | 15 | 66.7±12.2 | 64.3±12.8 |
| N/F突变 | ||||||
| 是 | 22 | 50.1±10.7 | 48.1±10.9 | 16 | 68.8±11.6 | 66.7±12.2 |
| 否 | 15 | 29.4±11.1 | 38.5±13.5 | 6 | 66.7±19.2 | 80.0±17.9 |
| CDKN2A/B缺失 | ||||||
| 是 | 20 | 33.4±11.1 | 35.2±10.8 | 12 | 54.5±15.0 | 54.5±15.0 |
| 否 | 17 | 58.8±11.9 | 60.0±12.6 | 10 | 90.0±9.5 | 88.9±10.5 |
注：allo-HSCT：异基因造血干细胞移植；N/F：NOTCH1和（或）FBXW7；OS：总生存；RFS：无复发生存。两组比较，P值均>0.05
表3. 异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）对NOTCH1、FBXW7基因突变及CDKN2A/B缺失患者预后的影响（％，x±s）.
| 组别 | NOTCH1突变患者 |
FBXW7突变患者 |
N/F基因突变患者 |
CDKN2A/B缺失患者 |
||||||||
| 例数 | 3年OS率 | 3年RFS率 | 例数 | 3年OS率 | 3年RFS率 | 例数 | 3年OS率 | 3年RFS率 | 例数 | 3年OS率 | 3年RFS率 | |
| allo-HSCT组 | 11 | 63.6±14.5 | 54.5±15.0 | 6 | 83.3±15.2 | 83.3±15.2 | 16 | 68.8±11.6 | 65.2±12.1 | 12 | 54.5±15.0 | 50.0±14.4 |
| 未移植组 | 5 | 0 | 0 | 3 | 0 | 33.3±27.2 | 6 | 0 | 0 | 8 | 0 | 0 |
|
| ||||||||||||
| P值 | 0.007 | 0.053 | 0.014 | 0.053 | 0.001 | 0.003 | 0.002 | 0.015 | ||||
注：N/F：NOTCH1和（或）FBXW7；OS：总生存；RFS：无复发生存
具有N/F基因突变患者的生存略好于无此突变患者，差异无统计学意义（P>0.05）（表2）。具有N/F基因突变患者中，16例接受了allo-HSCT，移植患者的生存明显好于未行移植者（表3）。
2. CDKN2A/B基因缺失对预后的影响：具有CDKN2A/B基因缺失患者较无此缺失患者具有预后差的趋势，但差异无统计学意义（P>0.05）。尽管接受allo-HSCT患者的总体生存有改善，但CDKN2A/B基因缺失者较无此缺失者预后仍略差（表2）。allo-HSCT可以明显改善CDKN2A/B缺失的患者的生存（表3）。
3. NOTCH1基因突变与CDKN2A/B基因缺失的不同共存状态对T-ALL患者生存的影响：同时具有NOTCH1基因突变及CDKN2A/B基因缺失患者（10例）与单独具有NOTCH1基因突变患者（6例）3年OS率分别为（33.3±15.7）％和（66.7±19.2）％（P＝0.241），3年RFS率分别为（34.3±15.9）％和（50.0±20.4）％（P＝0.641），差异均无统计学意义。
20例CDKN2A/B缺失患者中，同时具有NOTCH1突变患者（10例）和单纯CDKN2A/B基因缺失患者（10例）3年OS率分别为（33.3±15.7）％和（33.3±15.7）％（P＝0.985），3年RFS率分别为（34.3±15.9）％和（30.0±14.5）％（P＝0.553），差异无统计学意义。
4. FBXW7基因突变与CDKN2A/B基因缺失不同存在状态对预后的影响：同时具有FBXW7基因突变和CDKN2A/B基因缺失患者（8例）与单独CDKN2A/B基因缺失患者（12例）相比，生存情况略好，3年OS率分别为（66.7±19.2）％和（16.7±10.8）％（P＝0.066），3年RFS率分别为（60.0±18.2）％和（16.7±10.8）％（P＝0.068）。
在FBXW7野生型患者中，CDKN2A/B缺失者（12例）与无此缺失者（16例）的3年OS率分别为（16.7±10.8）％和（58.8±11.9）％（P＝0.119），3年RFS率分别为（16.7±10.8）％和（52.9±12.1）％（P＝0.040）。接受allo-HSCT患者中，CDKN2A/B缺失者（7例）和无此缺失者（9例）的生存情况仍有显著差异，3年OS率分别为（28.6±17.9）％和（88.9±10.5）％（P＝0.024），3年RFS率分别为（28.6±17.1）％和（77.8±13.9）％（P＝0.067）。
讨论
T-ALL在成人及儿童急性白血病中发生率显著低于B-ALL，但有独特的临床及生物学特征[8]。随着化疗方案的改进及造血干细胞移植比例的升高，T-ALL的疗效得到了显著改善。尽管如此，T-ALL患者OS仍然明显差于B-ALL患者[9]。面对这些临床挑战，研究者们致力于探索T-ALL发病、耐药及复发等相关的分子学异常及其对T-ALL生存的影响，期待进一步优化T-ALL患者的预后分层系统，依据更精细的预后分层系统提供不同的治疗方案；发现更具体的治疗靶点，最终提高T-ALL患者的总体疗效。
T-ALL患者中NOTCH1及FBXW7基因突变发生率较高。NOTCH1和FBXW7基因突变可引起NOTCH1信号通路的异常激活，促进T-ALL的发生。另外，CDKN2A/B基因缺失的发生率很高，该基因缺失常与NOTCH1、FBXW7突变伴随发生，NOTCH1信号通路的组成性激活以及CDKN2A/B基因缺失的同时发生对T-ALL的发病起到了关键作用，两者对T-ALL患者的预后也具有一定的提示意义[5]。
Baldus等[10]报道126例T-ALL患者中NOTCH1和FBXW7基因突变的发生率分别为57％、12％，本组成人T-ALL患者NTOCH1基因突变发生率为41.5％（低于国外患者）。关于NOTCH1和FBXW7突变对T-ALL患者预后的影响，在国外的研究中结论并不统一[11]–[15]：Baldus等[14]发现，NOTCH1和FBXW7突变对成人T-ALL患者没有明显的预后意义，而在少数表达ERG/BAALC的低危组患者中，N/F突变型较野生型患者具有较好的生存趋势。在Asnafi等[15]关于成人T-ALL的研究中，N/F突变患者无事件生存及OS明显好于野生型患者，且发现FBXW7突变的存在明显提高了NOTCH1基因突变对T-ALL患者的预后意义。本组患者中，具有N/F突变的患者整体预后略好于无此类突变者；单独NOTCH1突变对患者的总体OS及RFS无明显影响，而单独FBXW7突变患者生存略好于无此突变者。虽然国内外关于FBXW7单独突变的研究较少，但综合现有结果可认为FBXW7突变对成人T-ALL患者的生存具有重要影响，可能提示预后良好。
本研究中成人T-ALL患者CDKN2A/B缺失的发生率明显低于国外研究中发生率（70％）[5]。但是生存分析中，T-ALL患者具有CDKN2A/B缺失提示具有预后较差的趋势，与Jang等[16]和Mirji等[17]的研究结果类似。尽管allo-HSCT可以改善伴CDKN2A/B缺失的T-ALL患者的OS，但在接受allo-HSCT的T-ALL患者中，伴CDKN2A/B缺失仍然是不良的预后因素。
研究显示75％的CDKN2A/B缺失患者合并NOTCH1或者FBXW7突变。我们结合NOTCH1、FBXW7突变及CDKN2A/B缺失情况进行了T-ALL患者的生存分析，结果发现NOTCH1基因突变的预后意义受到CDKN2A/B缺失的影响，两者同时存在OS也较差。FBXW7突变的存在可改善CDKN2A/B缺失患者的生存。
T-ALL的发生是一个复杂的过程，需要结合多种分子学异常对T-ALL患者的预后情况进行综合分析，基因突变检测和CNV分析十分重要。T-ALL患者应用单纯化疗的疗效并不理想，有条件者应首选allo-HSCT。本研究样本量较少，还需扩大样本量进一步验证研究结果。
Funding Statement
基金项目：国家科技重大专项（2017ZX09304024）；天津市自然科学基金（18JCYBJC91800）；“十二五”国家科技支撑计划”（2014BAI09B12）
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