CCL18通过ANXA2促进肺腺癌的侵袭

Abstract

背景与目的

ANXA2在癌症进展中起着非常重要的作用，趋化因子18（chemokine ligand 18, CCL18）与肺腺癌（lung adenocarcinoma, LUAD）的侵袭、迁移、转移及预后不良有关。本研究旨在探究CCL18是否通过ANXA2促进LUAD侵袭以及其在LUAD侵袭中的作用和分子机制。

方法

Western blot检测LUAD组织与癌周正常组织中ANXA2表达量，并检测转染效率及ANXA2作为上游调节剂在AKT/cofilin信号通路中的作用。细胞趋化实验、Transwell侵袭实验等实验探讨ANXA2对LUAD的作用机理。F-actin聚合实验和Western blot检测转染SiRNA的A549细胞侵袭是否与F-actin相关。

结果

与相邻非肿瘤组织相比，癌组织中ANXA2的蛋白表达水平升高（P < 0.05）。敲低ANXA2组的LUAD细胞中CCL18诱导的趋化运动能力和侵袭能力下降（P < 0.05）。与对照组相比，敲低ANXA2的LUAD细胞的F-actin聚合明显降低，而敲低ANXA2的LUAD细胞中AKT在Ser473和Thr308位点的磷酸化和cofilin、LIMK的磷酸化水平均降低（P < 0.05）。

结论

敲低ANXA2可以通过降低AKT及下游通路磷酸化，进而降低CCL18对LUAD细胞的侵袭性的影响。

肺癌是造成我国患者死亡的主要原因之一，其中，肺腺癌（lung adenocarcinoma, LUAD）患者的数量近年来增长迅速，已经在肺癌发病率中占据第一位^{[1, 2]}，严重威胁患者的身体健康。LUAD侵袭和转移是引起患者死亡的主要原因^{[3, 4]}，大多数患者患有非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC），且为晚期。组织学上可分为LUAD和鳞状细胞癌，LUAD是最常见的亚型，占所有NSCLC的50%以上^[5]。由于LUAD患病率逐年增高，因此探究LUAD侵袭和转移分子机制是提高LUAD患者生存质量的关键。前期研究^{[6, 7]}表明，膜联蛋白A2（annexin II, ANXA2）在多种癌症的发生发展中起到关键作用，ANXA2的磷酸化程度升高被认为促进癌症的转移与侵袭。前期试验已经证实，在LUAD患者癌组织中，ANXA2的表达水平显著升高，但其表达水平升高机制鲜有相关报道。趋化因子18（chemokine ligand 18, CCL18）是来源于TAMs分泌的一种癌症细胞因子^{[7, 8]}，相关研究表明，ANXA2受控于CCL18与细胞表面受体Nir1相结合^[9-11]，CCL18与受体结合后通过多种途径影响癌症的发展，其中最为显著的是发生侵袭和转移^[12]。肌动蛋白是一类形成微丝的球状多功能蛋白质，F-肌动蛋白（F-actin）聚合成为G-肌动蛋白是细胞运动的基础，即当癌细胞运动能力发生变化时，F-actin聚合会随之变化^[13]并受上游AKT通路影响^[14]，本研究运用转染技术，降低ANXA2表达后，用蛋白质印迹检测ANXA2蛋白表达水平。通过体外实验检测转染ANXA2-siRNA和ANXA2过表达载体后A549细胞侵袭能力的改变，并采用F-actin聚合实验检测F-actin的变化，进而探究CCL18通过何种机制影响ANXA2及癌症的侵袭及转移。

1. 材料与方法

1.1. 患者和标本

2016年1月1日-2019年12月31日潍坊医学院附属医院病理科获得的患者组织标本。这些组织标本由14例浸润性LUAD及其癌旁组织的样本组成。浸润性LUAD与其相应的癌旁组织之间的距离 > 5 cm。患者的平均年龄为47.3岁（范围：35岁-76岁）。

1.2. 材料

LUAD细胞株A549购自美国ATCC细胞库。细胞裂解液、胰蛋白酶、蛋白Marker，质粒中量抽提试剂盒，反转录试剂盒均购自TaKara公司。RPMI-1640培养基以及胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）购自美国Hyclone公司。抗ANXA2抗体、抗p-ANXA2抗体、抗AKT抗体、抗p-AKT-Ser473抗体、抗p-AKT-Thr308抗体、抗cofilin抗体、抗p-cofilin抗体、抗LIMK抗体、抗p-LIMK抗体以及抗β-actin抗体均购自Cell Signaling公司。Transwell小室购自BD公司。Lipofectamine 2000 Reagent购自Invitrogen公司。

1.3. 细胞培养

A549细胞培养于含10%胎牛血清、100 µg/mL青霉素和链霉素的RPMI-1640培养基中。于5%CO₂、37 ℃细胞孵育箱中传代培养。待细胞生长处于对数期进行铺板，尽量铺匀，控制好细胞数量，6 h后观察细胞生长密度，24 h后进行瞬时转染。

1.4. 细胞转染

按照说明书，用慢病毒载体进行转染。ANXA2 siRNA的序列5′-GGTCTGAATTCAAGAGAAA-3′和5′-GCCAAAGAAATGAACATTC-3′。将ANXA2-SiRNA转染细胞标记为SiANXA2/A549，ANXA2-SiRNA以及ANXA2过表达载体（Vector-ANXA2）共转染细胞标记为SiANXA2+ANXA2/A549，将加干扰SiRNA作为空白对照组（Scr/A549）。将A549细胞计数并铺板在6孔板内培养24 h。待细胞生长密度约70%时进行转染，并标记组别。并将病毒悬液加入到6孔板内，孵育48 h。用含有600 ng/mL潮霉素B的培养基选择稳定转染的细胞。

1.5. Western blot实验

将全细胞蛋白质提取物在6孔板中用裂解缓冲液裂解并匀浆，并在12, 000 rpm、4 ℃下离心15 min，使用BCA法测定蛋白质浓度。在电泳转膜后，与特异性抗体（一抗浓度为1:1, 000）一起4 ℃过夜孵育。随后将含有免疫复合物的纤维素膜与荧光素偶联的二抗一起孵育（二抗浓度为1:5, 000），然后通过Odyssey荧光扫描仪进行检测。

1.6. Transwell侵袭实验

取Matrigel胶40 μL混合液加入Transwell上室，将小室放入24孔板内，37 ℃放置3 h。将细胞消化离心后制备细胞（4×10⁵个/mL）悬液。在下室加入含500 μL 10%FBS的培养基，上室加入无血清细胞悬液，放在培养箱内孵育24 h。将小室取出，PBS清洗，用棉签轻轻擦掉上室未穿过的细胞。将上室用4%多聚甲醛固定并晾干，然后将上室置于24孔板，用吉姆萨工作液染色，将小室置于显微镜下观察并拍照，计算细胞数。

1.7. 细胞趋化实验

用胰酶消化细胞，终止消化后离心弃培养基，用PBS洗3遍，用含1%牛血清白蛋白的无血清RPMI重悬细胞，调整细胞浓度为5×10⁵个/ mL。将10 ng/mL CCL18作为化学引诱剂加入下室，上室加200 µL细胞悬液，在培养箱孵育24 h后，甲醛固定30 min。用0.1%吉姆萨染色20 min，用棉签擦掉上室未迁移的细胞。用显微镜以×200的倍数随机观察3个视野。

1.8. F-actin聚合实验

将细胞铺在6孔板内常规培养，将细胞放在不含血清的培养基中37 ℃、5%CO₂培养箱内，细胞饥饿3 h。用10 ng/mL的CCL18分别刺激15 s和30 s、1 min、2 min和3 min后固定，用预冷的PBS冲洗细胞，终止CCL18的刺激。用4%PFA固定细胞10 min。F-buffer（10 mmol/L HEPES, 20 mmol/L KH₂PO₄, 5 mmol/L EGTA, 2 mmol/L MgCl₂, Dulbecco's PBS, pH 6.8）冲洗3次，每次5 min。孔内加1 mL 0.5%Tritox-100，静置20 min。F-buffer冲洗3次，每次5 min。孔内加荧光鬼笔环肽，避光孵育1 h。每孔加入900 µL纯甲醇，4 ℃孵育60 min。1, 500 rpm，离心5 min，将上清液移入96孔板内，每孔加3个复孔。使用酶标仪读取数值，荧光的激发波长488 nm，散发波长530 nm。不同时间的F-肌动蛋白相对聚合量计算公式为：刺激时间F-actin值/未刺激F-actin值=刺激时间荧光值。每组实验至少重复3遍。取平均值作为实验结果。

1.9. 统计学方法

所有实验数据运用SPSS 16.0分析。计量资料之间的比较采用独立样本t检验。多组间的比较采用单因素方差分析。所有数据采用均数±标准差（Mean±SD）的形式表示。P < 0.05被认为差异有统计学意义。

2. 结果

2.1. ANXA2在LUAD中的表达及其磷酸化程度与CCL18的关系

通过Western blot分析浸润性导管癌组织和邻近的非肿瘤组织的ANXA2表达水平，结果显示，在4例具有代表性的患者样本中，与相邻非肿瘤组织相比，LUAD癌组织中ANXA2的蛋白表达水平明显增高（P < 0.05，图 1A）。随后我们统计了ANXA2在所有患者样本癌组织和相邻非肿瘤组织中的蛋白表达，得到了相同的结论（P < 0.05，图 1B）。将Scr/A549细胞作为对照组。通过Western blot检测在有或没有CCL18刺激的情况下，Scr/A549和SiNir1/A549细胞中ANXA2的蛋白和磷酸化水平，结果显示，Nir1的表达影响CCL18诱导的ANXA2磷酸化。即CCL18与Nir1的结合促进了LUAD细胞中ANXA2的磷酸化水平，但没有促进ANXA2的蛋白表达水平（P < 0.05，图 1C）。

图 1.

ANXA2在肺腺癌细胞中过表达，其磷酸化受到CCL18的调控。A：ANXA2蛋白在配对的肺腺癌组织和邻近正常组织中的表达情况，每对均来自同一患者；B：柱状图统计ANXA2蛋白在配对的肺腺癌组织和邻近正常组织中的表达情况；C：通过蛋白质印迹分析技术检测在有或没有10 ng/mL的CCL18刺激下，Scr/A549和SiNir1/A549细胞中ANXA2蛋白的表达水平。

ANXA2 is overexpressed in lung adenocarcinoma cells, and its phosphorylation is regulated by CCL18. A: The expression of ANXA2 protein in paired lung adenocarcinoma tissue and adjacent normal tissue, each pair comes from the same patient; B: The expression of ANXA2 protein in paired lung adenocarcinoma tissue and adjacent normal tissue was analyzed by histogram; C: The expression level of ANXA2 protein in Scr/A549 and SiNir1/A549 cells was detected by Western blot analysis with or without CCL18 stimulation of 10 ng/mL. T: lung adenocarcinoma tissue; ANT: adjacent normal tissue.

2.2. ANXA2的降低可抑制LUAD细胞的趋化运动能力以及侵袭能力

使用siRNA降低A549中ANXA2蛋白的水平，我们通过Western blot分析验证在稳定转染的A549细胞中ANXA2蛋白表达水平出现了下降（P < 0.05，图 2A）。通过细胞趋化实验发现，在降低了ANXA2蛋白表达之后，CCL18诱导的趋化运动出现了显著的下降，表明ANXA2促进了LUAD细胞中CCL18诱导的趋化运动能力（P < 0.05，图 2B）。侵袭实验表明，无论培养基中是否加入CCL18，SiANXA2#2/A549组穿过人工基质胶的细胞数量明显少于Scr/A549组（P < 0.05，图 2C），这表明ANXA2的降低抑制了CCL18诱导的LUAD细胞粘附、迁移和侵袭能力。

图 2.

ANXA2促进CCL18诱导的肺腺癌细胞趋化运动能力。A：在以Scrabble siRNA作为对照（Scr/A549）和两组稳定的siRNA（SiANXA2#1/A549和SiANXA2#2/A549）转染A549细胞后检测ANXA2蛋白的表达水平；B：用CCL18刺激Scr/A549和SiANXA2#2/A549细胞，进行趋化反应的比较。β-actin作为阴性对照。每独立实验至少重复3次, P < 0.05，差异有统计学意义；C：在加入或不加入10 ng/mL CCL18刺激的情况下，分析Scr/A549和SiANXA2#2/A549细胞的侵袭能力，P < 0.05。以×400放大倍数捕获图像，比例尺：20 μm。

ANXA2 promotes the chemotaxis of lung adenocarcinoma cells induced by CCL18. A: Two stable siRNAs (SiANXA2#1 and SiANXA2#2) were transfected into A549 cells respectively, scramble siRNA as a control (Scr). The ANXA2 protein expression level was detected by Western blot analysis. β-actin was used as a negative control; B: Comparison of chemotactic response with rCCL18 stimulation in Scr/A549 and SiANXA2#2/A549 cells. Each independent experiment was repeated at least three times, P < 0.05, the difference was statistically significant; C: Analyze the invasion ability of Scr/A549 and SiANXA2#2/A549 cells with or without rCCL18 stimulation of 10 ng/mL, P < 0.05. Capture images at ×400 magnification. Scale bar: 20 μm.

2.3. ANXA2的降低可通过AKT/cofilin信号通路抑制LUAD中CCL18诱导的F-actin聚合

为了证明ANXA2的下调可以通过抑制F-actin聚合来抑制CCL18诱导的LUAD细胞趋化运动能力这一假设。F-actin聚合实验结果表明，CCL18在Scr/A549细胞中在15 s、30 s、1 min、2 min和3 min时引起瞬时肌动蛋白聚合，在SiANXA2#2/A549细胞中，肌动蛋白的聚合反应显著降低（P < 0.05，图 3A），即ANXA2通过调节CCL18诱导的F-actin聚合进而调节LUAD运动和侵袭。用10 ng/mL CCL18刺激细胞3 min后，通过Western blot分析实验检测转录因子的核表达，以验证参与F-actin的下游分子，这些分子在细胞中受ANXA2的调控。与Scr/A549细胞相比，SiANXA2#2/A549细胞中Ser473和Thr308位点的AKT的磷酸化水平均降低（P < 0.05，图 3B）。Western blot结果表明，与Scr/A549组相比，SiANXA2#2/A549细胞中cofilin及LIMK磷酸化水平降低（P < 0.05，图 3C）。这些结果表明，AKT/cofilin信号通路对于ANXA2促进LUAD细胞中CCL18诱导的趋化运动及侵袭能力至关重要。

图 3.

ANXA2的降低通过AKT/cofilin通路抑制肺腺癌细胞中CCL18诱导的F-肌动蛋白聚合。A：在不同时长的10 ng/mL CCL18的刺激下Scr/A549以及和SiANXA2#2/A549细胞中相对F-actin含量；B：在CCL18刺激下，分析Scr/A549、SiANXA2#2/A549中p-AKT（Ser473）、p-AKT（Thr308）的表达水平，实验中使用AKT和β-actin用作阴性对照；C：分析在CCL18的刺激下，Scr/A549、SiANXA2#2/A549中cofilin、LIMK的表达水平，实验中使用cofilin、LIMK和β-actin用作阴性对照。

The reduction of ANXA2 inhibits CCL18-induced F-actin polymerization in lung adenocarcinoma cells through the AKT/cofilin pathway. A: Relative F-actin content in Scr/A549 and SiANXA2#2/A549 cells stimulated by 10 ng/mL CCL18 at different times; B: Under the stimulation of CCL18, the expression levels of p-AKT (Ser473) and p-AKT (Thr308) in Scr/A549 and SiANXA2#2/A549 were analyzed by Western blot analysis. AKT and β-actin were used as negative contrast in the experiment; C: Analyze the expression levels of cofilin and LIMK in Scr/A549, SiANXA2#2/A549 under the stimulation of CCL18 by Western blot analysis. In the experiment, cofilin, LIMK and β-actin were used as negative controls.

2.4. 过表达ANXA2可促进LUAD细胞侵袭能力和LUAD中CCL18诱导的F-actin聚合

为了证明ANXA2对LUAD细胞功能的影响，我们进行了挽救实验，使用SiRNA降低A549中ANXA2蛋白的水平，过表达ANXA2载体（Vector-ANXA2）恢复ANXA2蛋白的水平，我们通过Western blot分析验证，结果表明A549细胞稳定转染（图 4A）。侵袭实验表明，无论培养基中是否加入CCL18，SiANXA2#2+ANXA2/A549组穿过人工基质胶的细胞数量明显多于SiANXA2#2/A549组（P < 0.05，图 4B）。F-actin聚合实验结果表明，与SiANXA2#2/A549组相比，过表达ANXA2后，肌动蛋白的聚合反应显著升高（P < 0.05，图 4C）。这些结果表明，ANXA2过表达可促进LUAD细胞侵袭能力和LUAD中CCL18诱导的F-actin聚合。

图 4.

过表达ANXA2可促进肺腺癌细胞侵袭能力和肺腺癌中CCL18诱导的F-actin聚合。A：Western blot检测SiANXA2#2和SiANXA2#2+ANXA2转染效率；B：在加入或不加入10 ng/mL CCL18刺激的情况下，分析SiANXA2#2/A549和SiANXA2#2+ANXA2/A549细胞的侵袭能力，P < 0.05。以×400放大倍数捕获图像，比例尺：20 μm；C：在不同时长的10 ng/mL CCL18的刺激下SiANXA2#2/A549以及和SiANXA2#2+ANXA2/A549细胞中相对F-肌动蛋白含量。

Overexpression of ANXA2 promotes invasion of lung adenocarcinoma cells and CCL18-induced F-actin aggregation in lung adenocarcinoma cells. A: The transfection efficiency of SiANXA2#2 and SiANXA2#2+ANXA2 was detected by Western blot; B: Analyze the invasion ability of SiANXA2#2/A549 and SiANXA2#2+ANXA2/A549 cells with or without rCCL18 stimulation of 10 ng/mL. P < 0.05. Capture images at ×400 magnification. Scale bar: 20 μm; C: Relative F-actin content in SiANXA2#2/A549 and SiANXA2#2+ANXA2/A549 cells stimulated by 10 ng/mL CCL18 at different times.

3. 讨论

尽管在肺癌筛查及外科医学、放射肿瘤学治疗方面的不断进步的前提下，LUAD仍然是中国乃至世界范围内最常见的癌症死亡原因^[15]。而侵袭和转移是造成绝大多数患者死亡的重要原因^[16]。所以探究LUAD侵袭和转移分子机制是提高LUAD患者生存质量的关键^[17]。研究表明，ANXA2可以促进人类结直肠癌^[18]、胃癌^[19]和乳腺癌^[20]等的侵袭和转移，在LUAD的侵袭转移中，同样也有促进血管生成和癌组织增殖等作用^[21]。但在其如何受到CCL18调控，以及通过何种方式影响癌症转移及侵袭鲜有研究。

本研究中，我们使用了蛋白质印迹分析的方法对14例患者的LUAD组织进行了分析，我们从中精选了4例具有代表性的患者组织做了Western blot，结果显示，相对于相邻周围组织，癌组织中ANXA2的表达量升高。并随后做了柱状图统计ANXA2在14例患者组织中的表达，得到的结果再次证明了上述结论。相关研究^[22]显示，其水平升高与LUAD的转移侵袭相关。在稳定转入SiNir1的A549细胞中，与对照组Scr/A549细胞相比，ANXA2的磷酸化水平发生了下降，而当没有CCL18的刺激时，ANXA2磷酸化明显降低，即ANXA2在细胞内的磷酸化受到CCL18的调控，这在过往其他癌相关文献^[23]中也有提及。同时，Scr/A549和SiANXA2#2/A549的细胞运动学实验表明抑制ANXA2后A549细胞侵袭能力明显下降，而在恢复ANXA2的表达后，A549细胞的侵袭能力较SiANXA2#2组明显上升。在对其进行F-actin聚合实验分析结果，F-actin聚合反应参与了对癌细胞侵袭转移的影响。随后我们采用Western blot分析的实验方法，对F-actin聚合相关的上游AKT/cofilin通路进行了检测。结果显示SiANXA2#2/A549相对于对照组，p-AKT（Ser473）、p-AKT（Thr308）、cofilin和LIMK的磷酸化都发生了降低。

综上所述，ANXA2通过AKT/cofilin信号通路促进CCL18诱导的细胞运动能力增强，促使LUAD发生转移及侵袭，为CCL18成为临床筛查LUAD及靶向治疗的分子标志物奠定理论基础，提高LUAD患者的远期生存率。虽然我们做了CCL18对ANXA2相关影响的研究，但是其对LUAD发生和进展的蛋白机制并未完全阐明，还需进一步研究。

Funding Statement

本研究受国家自然科学基金（No.81872163和No.81672631）资助

This study was supported by the grants from National Natural Science Foundation of China (No.81872163 and No.81672631)(both to Baogang ZHANG)