去白细胞富血小板血浆对距骨骨软骨损伤的疗效及机制研究

Abstract

Objective

To explore the effectiveness and mechanism of pure platelet-rich plasma (P-PRP) on osteochondral injury of talus.

Methods

Thirty-six patients with osteochondral injury of talus selected between January 2014 and October 2017 according to criteria were randomly divided into control group (group A), leukocyte PRP (L-PRP) group (group B), and P-PRP group (group C), with 12 cases in each group. There was no significant difference in gender, age, disease duration, and Hepple classification among the three groups (P>0.05). Patients in the groups B and C were injected with 2.5 mL L-PRP or P-PRP at the bone graft site, respectively. Patients in the group A were not injected with any drugs. The American Orthopaedic Foot and Ankle Society (AOFAS) score and visual analogue scale (VAS) score were used to evaluate the effectiveness before operation and at 3, 6, and 12 months after operation. Study on the therapeutic mechanism of P-PRP: MC3T3-E1 cells were randomly divided into control group (group A), L-PRP group (group B), and P-PRP group (group C). Groups B and C were cultured with culture medium containing 5% L-PRP or P-PRP respectively. Group A was cultured with PBS of the same content. MTT assay was used to detect cell proliferation; ELISA was used to detect the content of matrix metalloprotein 9 (MMP-9) protein in supernatant; alkaline phosphatase (ALP) activity was measured; and real-time fluorescence quantitative PCR (qRT-PCR) was used to detect the expression of osteopontin (OPN), collagen type Ⅰ, and MMP-9 in cells. Western blot was used to detect the expression of MMP-9 in supernatant and phosphoinositide 3-kinase (PI3K), phosphorylated protein kinase B (pAKT), and phosphorylated c-Jun (p-c-Jun) in cells.

Results

All patients were followed up 13-25 months, with an average of 18 months. No complication such as wound infection and internal fixation failure occurred. MRI showed that the degree of injury was similar between the three groups before operation, and patients in the three groups all recovered at 6 months after operation. Moreover, group C was superior to groups A and B. Compared with preoperation, AOFAS scores and VAS scores in the three groups were all significantly improved at each time point after operation (P<0.05). AOFAS score of group C was significantly higher than that of groups A and B at 3, 6, and 12 months after operation (P<0.05); there was no significant difference in VAS score between the three groups (P>0.05). Study on the therapeutic mechanism of P-PRP: The absorbance (A) value, ALP activity, the relative mRNA expression of OPN and collagen type Ⅰ in group C were significantly higher than those in groups A and B (P<0.05), and those in group B were significantly higher than those in group A (P<0.05). The relative expression of MMP-9 protein and mRNA and the content of MMP-9 protein detected by ELISA in group B were significantly higher than those in groups A and C, while those in group C were significantly lower than those in group A (P<0.05). Western blot detection showed that the relative expression of PI3K, pAKT, and p-c-Jun protein in group B was significantly higher than those in groups A and C (P<0.05), but there was no significant difference between groups A and C (P>0.05).

Conclusion

P-PRP is superior to L-PRP for osteochondral injury of talus, which may be related to the inhibition of PI3K/AKT/AP-1 signaling pathway in the osteoblast, thereby reducing the secretion of MMP-9.

自体富血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP）是根据自体血中不同成分的离心系数不同，经过 2 次离心法获得的富含血小板、PDGF、TGF-β₁ 等成分的血浆，具有促进细胞增殖、分化、迁移，支持血管生长等生物学作用，因此被广泛用于骨、软骨、神经、皮肤等组织的再生与修复^[1-3]。PRP 可以促进成骨细胞的增殖、分化和矿化，增强Ⅰ型胶原蛋白、骨桥蛋白（osteopontin，OPN）、骨涎蛋白等细胞外基质的分泌，因此被用于骨折、骨坏死、骨关节炎等骨科疾病的治疗^[4-5]。但是，关于 PRP 的治疗效果仍然存在争议，可能与 PRP 中高浓度的白细胞以及炎性因子有关^[6-8]。Xu 等^[9]改良了传统的基于交界层的 PRP 制备方法，通过基于血浆层的两步离心法制备得到白细胞与炎性因子水平较低的去白细胞 PRP（pure PRP，P-PRP），并且发现 P-PRP 促进 BMSCs 生长与软骨发生的能力均显著高于富白细胞 PRP（leukocyte PRP，L-PRP），在兔软骨缺损模型中的修复效果更为显著。因此，本研究参照此优化方案制备得到 P-PRP，并与传统制备方法得到的 L-PRP 进行成分比较，然后作为辅助药物用于距骨骨软骨损伤患者的手术治疗，以探讨 P-PRP 在距骨骨软骨损伤治疗中的疗效，并使用小鼠成骨细胞 MC3T3-E1 进行体外实验，研究 P-PRP 的治疗机制。报告如下。

1. 临床资料

1.1. 患者选择标准

纳入标准：① 诊断为距骨骨软骨损伤，诊断标准：慢性持续性踝关节疼痛、反复肿胀、不能跑跳、运动后加重等，有损伤处压痛等体征，局灶性关节软骨损伤或缺损伴下方的骨水肿、骨折或囊肿形成等影像学表现；② Hepple 分型^[10]为Ⅲ～Ⅴ型，保守治疗无效，损伤面积较大，需要手术治疗者。排除标准：① 血小板数量和功能异常；② 伴随肝肾功能障碍、肿瘤、类风湿性关节炎、足踝畸形、心脑血管疾病、精神疾病等。

2014 年 1 月—2017 年 10 月共 36 例患者符合选择标准纳入研究，采用随机数字表法随机分为对照组（A 组）、L-PRP 组（B 组）、P-PRP 组（C 组），每组 12 例。本研究获解放军联勤保障部队第九八八医院医学伦理委员会批准，患者均知情同意。

1.2. 一般资料

A 组：男 8 例，女 4 例；年龄 29～55 岁，平均 42.3 岁。病程 1～41 个月，平均 18 个月；其中病程<1 年 6 例，1～3 年 4 例，>3 年 2 例。Hepple 分型：Ⅲ型 5 例，Ⅳ型 5 例，Ⅴ型 2 例。

B 组：男 9 例，女 3 例；年龄 28～58 岁，平均 42.8 岁。病程 1～43 个月，平均 17 个月；其中病程<1 年 7 例，1～3 年 4 例，>3 年 1 例。Hepple 分型：Ⅲ型 6 例，Ⅳ型 4 例，Ⅴ型 2 例。

C 组：男 8 例，女 4 例；年龄 26～55 岁，平均 41.6 岁。病程 2～40 个月，平均 18 个月；其中病程<1 年 7 例，1～3 年 2 例，>3 年 2 例。Hepple 分型：Ⅲ型 5 例，Ⅳ型 4 例，Ⅴ型 3 例。

3 组患者性别、年龄、病程、Hepple 分型等一般资料比较差异均无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

1.3. L-PRP 与 P-PRP 的制备及组分分析

1.3.1. L-PRP 与 P-PRP 的制备

使用预先含有 4 mL 枸橼酸钠抗凝剂的 50 mL 注射器采集所有患者静脉血 37 mL，混匀后，吸取 1 mL 用于全血成分检测，余 40 mL 使用 PRP 制备套装（山东威高集团有限公司）进行后续制备。① L-PRP 制备方法：以 660×g 离心 10 min，可见全血分为 3 层，底部为红细胞层，中间为白细胞和血小板的交界层，上层为乏血小板血浆层；使用注射器吸弃红细胞层，以 660×g 进行第 2 次离心，共 10 min，底部的白膜样物质为白细胞和血小板沉积层，上层为乏血小板血浆层，吸弃上层乏血小板血浆至剩余 4 mL，静置片刻后混匀。② P-PRP 制备方法：以 160×g 离心 10 min，可见全血分为 3 层，底部为红细胞层，中间为白细胞层，上层为 PRP 层；使用注射器吸取上层至另一离心管，以 250×g 离心 15 min，底部为血小板沉积层，上层为乏血小板血浆层，吸弃上层乏血小板血浆至剩余 4 mL，静置片刻后混匀。L-PRP 与 P-PRP 使用前，加入 10%CaCl₂ 溶液进行激活。

1.3.2. 全血、L-PRP 与 P-PRP 组分分析

取全血、L-PRP 与 P-PRP 各 1 mL，使用 KX-21N 全自动血液分析仪（Sysmex 公司，日本）测定血小板和白细胞浓度；使用 ELISA 试剂盒（深圳欣博盛生物科技有限公司）测定 IL-1β、TNF-α、PDGF、TGF-β₁ 浓度。

1.4. 手术方法

患者于椎管内麻醉后，患侧大腿近端上气囊止血带，压力在 45～50 kPa。术中取内踝偏前缘长约 9 cm 弧形切口，逐层切开皮肤、皮下组织和筋膜，显露内踝。于内踝尖部向胫骨远端先打入 2 枚直径 2.0 mm 空心钉导针，然后拔出。用微型摆锯截断内踝，将内踝向远端掀起，显露距骨内侧病灶，C 臂 X 线机定位病灶中心并打入 1 枚克氏针，根据病灶大小选择合适型号的空心钻清除坏死骨，并使用刮勺清除周围硬化骨组织直至病灶四周有接近正常的骨小梁组织。评估缺损体积，根据术前 MRI 及 CT 三维重建分析及术中观察软骨面缺损的部位大小形状，用同型号取骨环钻取自体同侧胫骨远端或内侧髂骨带骨膜及松质骨骨柱（在保证骨柱及骨膜完整的情况下，将同型号骨柱以松质骨在内、骨膜在外植入距骨骨缺损处），对距骨缺损处进行打压植骨，至与软骨面同一弧度切迹，保证所植骨柱与距骨软骨下骨平齐；B、C 组在关节镜下分别使用 PRP 专用注射器将 2.5 mL L-PRP 和 P-PRP 注射到所移植骨柱的周围间隙及所带骨膜下，A 组不注射任何药物。复位内踝截骨端，沿原空心钉导针孔插入 1.0 mm 螺钉导针，沿导针拧入 2 枚 3.5 mm 空心加压螺钉。C 臂 X 线机透视见位置良好后，逐层缝合切口。

1.5. 术后处理及疗效观察指标

术后给予消肿治疗，对患肢功能位石膏固定4周；然后改用免负重支具靴固定3个月，逐渐负重行走；并进行患肢无负重状态下功能锻炼，半年内避免患肢剧烈负重活动。

术前和术后 3、6、12 个月采用美国矫形足踝协会（AOFAS）踝-后足评分和疼痛视觉模拟评分（VAS）评价疗效。

1.6. P-PRP 治疗机制研究

1.6.1. 主要试剂及仪器

MC3T3-E1 细胞购于中国科学院上海细胞库。α-MEM 培养液（HyClone 公司，美国）；细胞裂解液、BCA 蛋白定量试剂盒、ALP 检测试剂盒、ECL 显色液（上海碧云天生物技术有限公司）；逆转录试剂盒（Qiagen 公司，德国）；荧光定量试剂盒（Takara 公司，日本）；抗基质金属蛋白酶 9（matrix metalloprotein 9，MMP-9）抗体、抗磷脂酰肌醇 3 激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）抗体、抗磷酸化蛋白激酶 B（phosphorylated protein kinase B，pAKT）抗体、抗磷酸化 c-Jun（phosphorylated c-Jun，p-c-Jun）抗体、抗 GAPDH 抗体（Abcam 公司，英国）；过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗（武汉博士德生物工程有限公司）。酶标仪（PerkinElmer 公司，美国）；qRT-PCR 仪、凝胶成像仪（Bio-Rad 公司，美国）。

1.6.2. MC3T3-E1 细胞的培养与分组

将 MC3T3-E1 细胞使用含 10%FBS 的 α-MEM 培养液培养于 37℃、5%CO₂、饱和湿度细胞培养箱，汇合度达 75% 左右时使用 0.25% 胰蛋白酶消化传代。将第 3 代 MC3T3-E1 细胞随机分为 3 组，即对照组（A 组）、L-PRP 组（B 组）、P-PRP 组（C 组）。B、C 组分别使用含 5% L-PRP 或 P-PRP 的细胞培养液进行培养，A 组使用含 5%PBS 的细胞培养液培养。

1.6.3. MTT 检测各组细胞增殖

取第 3 代 MC3T3-E1 细胞，以 5×10³个/孔密度接种于 96 孔板，24 h 后更换新鲜细胞培养液，同上述分组方法相应处理，每组设 6 个复孔。培养 3 d 后，每孔加入 10 μL MTT，继续培养 4 h，吸弃上清后，每孔加入 150 μL DMSO，摇床低速振荡 10 min，使用酶标仪于 490 nm 处测定各孔的吸光度（A）值。

1.6.4. ALP 活性测定

取第 3 代 MC3T3-E1 细胞，以 5×10⁵个/孔密度接种于 6 孔板，24 h 后更换新鲜细胞培养液，同上述分组方法相应处理，每组设 6 个复孔。吸取上清液，使用 ELISA 试剂盒测定上清液 MMP-9 蛋白含量。PBS 洗涤细胞 3 次，加入 100 μL 细胞裂解液，充分裂解后，12 000×g 离心 5 min，使用 BCA 蛋白定量试剂盒测定上清液的蛋白浓度，使用 ALP 检测试剂盒测定 ALP 活性。

1.6.5. 实时荧光定量 PCR（real-time quantitative fluorescence PCR，qRT-PCR）检测

取第 3 代 MC3T3-E1 细胞，按 1.6.2 分组方法处理细胞后，使用 qRT-PCR 检测细胞中 OPN、Ⅰ型胶原和 MMP-9 mRNA 的表达。具体方法：Trizol 法提取总 RNA，逆转录试剂盒合成 cDNA，荧光定量试剂盒进行 PCR 反应，反应条件：95℃ 预变性 30 s；95℃ 变性 5 s，60℃ 退火 30 s，30 个循环。引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列见表 1。将 A 组各基因 mRNA 表达量设为 1，计算 B、C 组与 A 组相比各基因 mRNA 表达量的倍数。

表 1.

Primer sequences of qRT-PCR

qRT-PCR 引物序列

基因 Gene	引物序列（5'→3'） Primer sequence (5'→3')
OPN	上游 GACCATGAGATTGGCAGTGATTTG Forward
	下游 TGATGTCCAGGCTGGCTTG Reverse
Ⅰ型胶原 Collagen type Ⅰ	上游 GCGAAGGCAACAGTCGCT Forward
	下游 CTTGGTGGTTTTGTATTCGATGAC Reverse
MMP-9	上游 CGTCGTGATCCCCACTTACT Forward
	下游 AACACACAGGGTTTGCCTTC Reverse
GAPDH	上游 GGGCATCTTGGGCTACAC Forward
	下游 GGTCCAGGGTTTCTTACTCC Reverse

1.6.6. Western blot 检测

取第 3 代 MC3T3-E1 细胞，按 1.6.2 分组方法处理细胞后，使用 Western blot 检测上清液 MMP-9 蛋白的分泌和细胞中 PI3K、pAKT、p-c-Jun 蛋白的表达。具体方法：取 40 μg 蛋白质进行 SDS-PAGE 电泳，蓝色染料至胶底部时停止电泳，冰水浴中将目的蛋白电转（100 mA、2 h）至聚偏二氟乙烯膜，5% 脱脂奶粉封闭 2 h，使用抗 MMP-9 抗体（1∶1 000）、抗 PI3K 抗体（1∶1 000）、抗 pAKT 抗体（1∶1 000）、抗 p-c-Jun 抗体（1∶1 000）、抗 GAPDH 抗体（1∶2 000）4℃ 过夜孵育。洗涤 3 次，使用过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗孵育 1 h，洗涤 3 次，ECL 显色液显色，凝胶成像仪下曝光和拍照。用 Image Pro Plus 6.0 软件进行灰度值定量，将 A 组的灰度值设置为 1。

1.7. 统计学方法

采用 SPSS13.0 统计软件进行分析。计量资料以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD-t 检验；组内各时间点间比较采用重复测量方差分析，两两比较采用 Bonferroni 检验。计数资料组间比较采用 χ² 检验，等级资料组间比较采用 Kruskal-Wallis H 非参数检验。检验水准 α=0.05。

2. 结果

2.1. 全血、L-PRP、P-PRP 组分分析

与全血比较，L-PRP 血小板、白细胞、IL-1β、TNF-α、PDGF、TGF-β₁ 浓度均显著增加，P-PRP 血小板、PDGF、TGF-β₁ 浓度显著增加，白细胞、IL-1β、TNF-α 浓度显著减少，差异均有统计学意义（P<0.05）。与 L-PRP 比较，P-PRP 血小板、PDGF、TGF-β₁ 浓度差异无统计学意义（P>0.05），但白细胞、IL-1β、TNF-α 浓度显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）。见图 1。

图 1.

Comparison of the components in whole blood, L-PRP, and P-PRP

全血、L-PRP、P-PRP 组分浓度比较

a. 白细胞；b. 血小板；c. IL-1β；d. TNF-α；e. PDGF；f. TGF-β₁

a. Leukocyte; b. Platelet; c. IL-1β; d. TNF-α; e. PDGF; f. TGF-β₁

2.2. 临床疗效分析

各组患者均获随访，随访时间 13～25 个月，平均 18 个月。无伤口感染、内固定失效等并发症发生。植骨处均愈合，透明软骨修复良好，愈合时间 4～8 个月，平均 6 个月。MRI 检查示，各组术前损伤程度相似；术后 6 个月 C 组可见距骨顶软骨完整，软骨与距骨体紧密结合，无水肿、分离以及硬化带形成，优于 A、B 组。见图 2～4。与术前相比，术后各组 AOFAS 评分均逐渐升高，VAS 评分均逐渐降低，术后各时间点与术前比较差异均有统计学意义（P<0.05）。术后 3、6、12 个月 C 组 AOFAS 评分均显著高于 A、B 组，差异有统计学意义（P<0.05），A、B 组间比较差异无统计学意义（P>0.05）；VAS 评分 A、B、C 组间比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见图 5。

图 2.

MRI of a 52-year-old female patient with osteochondral injury of talus (Hepple type Ⅴ) in group A

A 组患者，女，52 岁，距骨骨软骨损伤（HeppleⅤ型）MRI

a. 术前矢状位；b. 术前冠状位；c. 术后 6 个月矢状位；d. 术后 6 个月冠状位

a. Preoperative sagittal position; b. Preoperative coronal position; c. Sagittal position at 6 months after operation; d. Coronal position at 6 months after operation

图 4.

MRI of a 34-year-old male patient with osteochondral injury of talus (Hepple type Ⅳ) in group C

C 组患者，男，34岁，距骨骨软骨损伤（Hepple Ⅳ型）MRI

a. 术前矢状位；b. 术前冠状位；c. 术后 6 个月矢状位；d. 术后 6 个月冠状位

a. Preoperative sagittal position; b. Preoperative coronal position; c. Sagittal position at 6 months after operation; d. Coronal position at 6 months after operation

图 5.

Comparison of AOFAS scores and VAS scores among 3 groups at pre- and post-operation

各组患者手术前后各时间点 AOFAS 评分和 VAS 评分比较

a. AOFAS 评分；b. VAS 评分

a. AOFAS score; b. VAS score

图 3.

MRI of a 31-year-old male patient with osteochondral injury of talus (Hepple type Ⅳ) in group B

B 组患者，男，31 岁，距骨骨软骨损伤（Hepple Ⅳ型）MRI

a. 术前矢状位；b. 术前冠状位；c. 术后 6 个月矢状位；d. 术后 6 个月冠状位

a. Preoperative sagittal position; b. Preoperative coronal position; c. Sagittal position at 6 months after operation; d. Coronal position at 6 months after operation

2.3. P-PRP 治疗机制研究

2.3.1. 各组细胞增殖和分化能力比较

MTT 检测示，A、B、C 组细胞 A 值分别为 0.91±0.12、1.01±0.15、1.14±0.19，ALP 活性分别为（5.09±0.97）、（5.93±1.05）、（7.58±1.10）U/g，OPN mRNA 相对表达量分别为 1.00±0.16、1.46±0.31、2.29±0.44，Ⅰ型胶原 mRNA 相对表达量分别为 1.00±0.18、1.22±0.26、1.54±0.33。以上指标 C 组显著大于 A、B 组，B 组大于 A 组，比较差异均有统计学意义（P<0.05）。

2.3.2. 各组细胞间 MMP-9 表达比较

Western blot 检测示 A、B、C 组 MMP-9 蛋白相对表达量分别为 1.00±0.14、1.53±0.29、0.91±0.22，ELISA 检测 MMP-9 蛋白含量分别为（6.58±0.96）、（7.54±1.41）、（6.07±1.09）μg/L，qRT-PCR 检测 MMP-9 mRNA 相对表达量分别为 1.00±0.17、1.57±0.35、0.83±0.25，以上指标 B 组显著大于 A、C 组，C 组小于 A 组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见图 6。

图 6.

MMP-9 protein expressions of each group detected by Western blot

Western blot 检测各组细胞 MMP-9 蛋白表达

1：A 组2：B 组　3：C 组

1: Group A 2: Group B 3: Group C

2.3.3. Western blot 检测各组细胞 PI3K/AKT/AP-1 信号通路表达

A、B、C 组 PI3K 蛋白相对表达量分别为 1.00±0.15、1.87±0.48、1.14±0.29，pAKT 蛋白相对表达量分别为 1.00±0.23、2.07±0.44、0.90±0.31，p-c-Jun 蛋白相对表达量分别为 1.00±0.18、1.69±0.41、1.07±0.24。以上指标 B 组显著大于 A、C 组，差异有统计学意义（P<0.05）；A、C 组间差异无统计学意义（P>0.05）。见图 7。

图 7.

PI3K/AKT/AP-1 signaling pathway expression of each group detected by Western blot

Western blot 检测各组细胞 PI3K/AKT/AP-1 信号通路表达

1：A 组 2：B 组 3：C 组

1: Group A 2: Group B 3: Group C

3. 讨论

炎症可以抑制成骨细胞的分化和矿化，降低细胞外基质的分泌，同时激活破骨细胞的生成和活性，促进 MMP 的分泌，使骨形成与骨吸收的平衡紊乱，导致骨密度降低和骨质流失，因此炎性细胞的趋化以及炎性因子的释放等病理过程是类风湿性关节炎、骨关节炎、骨折、骨坏死、骨质疏松等一系列疾病的关键机制^[11-12]。炎性因子对骨质的破坏效应以 IL-1β 和 TNF-α 最为明显，对 IL-1β 和 TNF-α 基因敲除小鼠进行雌性去势造模发现，未出现正常小鼠的造模后骨质疏松，说明抑制 IL-1β 或 TNF-α 在临床上具有骨保护作用，作为 IL-1β 和 TNF-α 阻滞剂的阿那白滞素和依那西普也是骨破坏疾病的常用临床药物^[13]。因此如何减轻以白细胞、IL-1β 和 TNF-α 为代表的炎症影响，是提高骨再生疗效的关键因素。

PRP 因具有较高含量的血小板、PDGF、TGF-β₁ 等有效成分而被用于骨再生领域，但是目前 PRP 的临床制备以基于交界层的两步离心法为主，在有效成分富集的同时，大量炎性细胞及炎性因子也得到浓缩，可能会影响 PRP 的治疗效果^[14-15]。因此，部分学者致力于降低 PRP 中白细胞及相关炎性因子的浓度，以获得 P-PRP，在骨、关节软骨、肌腱等组织的再生中显示出更好的疗效^[16-19]。如 Yin 等^[6]发现 P-PRP 促进 BMSCs 和脐静脉血管内皮细胞增殖、迁移和成骨分化的能力均高于 L-PRP，并在大鼠颅骨缺损模型中证实 P-PRP 促进骨再生效果优于 L-PRP。本研究参照 Yin 等的优化方案，将第 1 次离心力参数调整为 160×g，使血小板主要分布于上层，尽量避免中层白细胞的污染，结果显示与 L-PRP 比较，P-PRP 在血小板、PDGF、TGF-β₁ 含量方面无统计学差异，但白细胞、IL-1β、TNF-α 含量却显著低于 L-PRP。白细胞数量的降低主要与基于血浆层的离心法有关，而炎性因子 IL-1β 和 TNF-α 具有相对分子质量小、沉降系数低的性质，因此其数量的降低可能与离心步骤的改良关系不大，而更多应归功于白细胞的有效清除，使其无法大量分泌与释放炎性因子。

目前 P-PRP 的研究主要停留于细胞和动物实验，但是其临床疗效却尚不清楚。因此，本研究将 P-PRP 作为辅助药物用于距骨骨软骨损伤患者的手术治疗，以探讨 P-PRP 在距骨骨软骨损伤治疗中的疗效。结果显示，C 组患者的 AOFAS 评分在术后逐渐升高，而且 3、6、12 个月的 AOFAS 评分均高于 B 组，表明 P-PRP 可以促进距骨骨软骨损伤的临床恢复，而且效果优于 L-PRP。此外，C 组患者的 VAS 评分虽然在术后逐渐降低，但与 B 组比较差异却无统计学意义，可能与本次研究样本量选入较少有关。

为了进一步研究 P-PRP 的治疗机制，本研究使用小鼠成骨细胞 MC3T3-E1 进行体外实验，结果显示 C 组细胞的增殖、ALP 活性、OPN mRNA 表达和Ⅰ型胶原 mRNA 表达均高于 B 组，表明 P-PRP 在促进成骨细胞增殖、分化、基质分泌方面均优于 L-PRP。研究发现，炎症导致的Ⅰ型胶原蛋白、OPN、骨涎蛋白等细胞外基质的降解，与 MMP 的过量分泌密切相关^[20]。本研究结果也发现 B 组细胞的 MMP-9 mRNA 表达与蛋白分泌均高于 C 组，表明 P-PRP 提高骨再生疗效的机制可能与降低 MMP-9 的分泌有关。MMP-9 的高表达与 AP-1 的激活密切相关，AP-1 是一种由 c-Jun、c-Fos 和 ATF2 等蛋白质形成的二聚体复合物，可由 PI3K/AKT 信号通路激活，转运至 MMP-9 启动子上游 533 bp 和 79 bp 处进行结合，从而促进 MMP-9 的表达^[21-22]。本研究通过 Western blot 检测显示，C 组细胞中 PI3K、pAKT 和 p-c-Jun 蛋白表达均低于 B 组，表明 P-PRP 降低 MMP-9 的分泌可能与抑制成骨细胞中 PI3K/AKT/AP-1 信号通路的激活有关。

尽管本研究初步探讨了 P-PRP 在距骨骨软骨损伤中的临床疗效和相关机制，但是仍有许多问题亟待解决：① 本研究将 P-PRP 作为辅助药物用于距骨骨软骨损伤的手术治疗，存在干扰因素较多、样本量较少、评价指标不足等问题，因此 P-PRP 在距骨骨软骨损伤中的疗效仍需要进一步研究。② P-PRP 对股骨、桡骨、牙槽骨等其他部位骨组织的坏死以及骨折、骨关节炎、类风湿性关节炎等其他骨科疾病是否仍存在较优的临床治疗效应，是否具有普遍适用性，仍不明确。③ 骨代谢的平衡依赖骨形成与骨吸收相互的调节，而成骨细胞和破骨细胞是这两个方面的关键效应细胞。研究发现炎症不仅可以抑制成骨细胞的增殖、分化、矿化和分泌，还在破骨细胞的活化中发挥重要作用^[23]。但本研究仅从成骨细胞的角度进行研究，P-PRP 对破骨细胞生物学作用的影响仍不清楚。④ 炎性因子也可以激活 NF-κB 信号通路，使 NF-κB 由细胞质转移至细胞核，从而增强包括炎症、凋亡、MMP 等一系列基因的表达^[24]，但本研究未对 NF-κB 信号通路在 P-PRP 治疗效应中的作用进行探讨。

综上述，P-PRP 对距骨骨软骨损伤的疗效优于 L-PRP，可能与抑制成骨细胞中 PI3K/AKT/AP-1 信号通路的激活，从而降低 MMP-9 的分泌有关。我们下一步将继续纳入病例以扩大样本量，并开展 P-PRP 在骨折、骨关节炎、类风湿性关节炎等其他骨科疾病中的治疗研究，对 P-PRP 在破骨细胞中的生物学作用及 NF-κB 信号通路等机制进行深入探讨。