沉默 Piezo1 机械敏感型离子通道对 MC3T3-E1 成骨细胞迁移的影响

Abstract

Objective

To discuss the effect of Piezo1 mechanically sensitive protein in migration process of mouse MC3T3-E1 osteoblast cells.

Methods

The 5th-10th generation mouse MC3T3-E1 osteoblasts were divided into Piezo1-small interfering RNA (siRNA) transfection group (group A), negative control group (group B), and blank control group (group C). Piezo1-siRNA or negative control siRNA was transfected into mouse MC3T3-E1 osteoblasts by siRNA transfection reagent, respectively; group C was only added with siRNA transfection reagent; and the cell morphology was observed under inverted phase contrast microscope and fluorescence microscope, and the transfection efficiency was calculated. The expression of Piezo1 protein was detected by immunofluorescence staining and Western blot. Transwell cell migration assay and cell scratch assay were used to detect the migration of MC3T3-E1 osteoblasts after Piezo1-siRNA transfection.

Results

After 48 hours of transfection, group A showed a slight increase in cell volume and mutant growth, but cell colonies decreased, suspension cells increased and cell fragments increased when compared with untransfected cells. Under fluorescence microscope, green fluorescence was observed in MC3T3-E1 osteoblasts of group B, and the transfection efficiency was 68.56%±4.12%. Immunofluorescence staining and Western blot results showed that the expression level of Piezo1 protein in group A was significantly lower than that in groups B and C (P<0.05); there was no significant difference between group B and group C (P>0.05). Transwell cell migration assay and cell scratch assay showed that the number of cells per hole and the scratch healing rate of cells cultured for 1-4 days in group A were significantly lower than those in groups B and C (P<0.05); there was no significant difference between group B and group C (P>0.05).

Conclusion

Piezo1 knocked down by siRNA can inhibit the migration ability of MC3T3-E1 osteoblast cells.

骨骼是一种具有代谢活性的组织，它会根据骨吸收和骨骼形成重复进行不断改造，正常情况下，骨形成和骨吸收分别通过成骨细胞和破骨细胞的活性偶联和平衡^[1-2]。成骨细胞的分化和迁移是骨骼发生、骨塑形及骨折愈合的关键^[3-4]。成骨细胞谱系中的细胞迁移，包括前体成骨细胞和成骨细胞，已被公认为可以影响骨形成过程。然而，介导成骨细胞迁移和骨形成的分子基础尚不完全清楚。关于骨骼重塑中大部分重要运动性迁移受到 TGF-β₁ 募集的前体成骨细胞的影响，这些细胞在 IGF-1 的控制下在重塑位点处分化^[5-6]。在骨损伤后修复的情况下，成骨细胞的迁移和附着也很重要，这些细胞迁移到骨损伤部位随即开始增殖并产生新骨^[7]。然而，成骨细胞迁移相对于细胞骨架调节的分子基础及其骨量测定的相关性仍未完全理解。

Piezo 机械敏感型通道蛋白是 2010 年 Coste 等^[8]将 RNA 干扰技术作用于小鼠 Neuro2A 细胞系，而发现的一种新型机械敏感型离子通道，自发现以来迅速引起各个领域学者的广泛关注。我们的前期预实验已表明 Piezo1/2 蛋白在小鼠 MC3T3-E1 成骨细胞的细胞质及细胞核均有表达。Sugimoto 等^[9]首次证明 Piezo1 作为 MSCs 中静水压力的受体发挥功能，并促进成骨细胞分化，同时抑制脂肪细胞分化。但其是否在成骨细胞迁移中也起到一定作用尚不可知。鉴于此，本实验采用小干扰 RNA（small interfering RNA，siRNA）技术转染小鼠 MC3T3-E1 成骨细胞，观察 Piezo1 机械敏感型通道蛋白对小鼠 MC3T3-E1 成骨细胞迁移及其相关蛋白的影响。

1. 材料与方法

1.1. 主要材料与仪器

小鼠 MC3T3-E1 成骨细胞（中国医学科学院北京库）。FBS（PAN-Biotech 公司，德国）；α-MEM 培养基（HyClone 公司，美国）；胰蛋白酶（Sigma 公司，美国）；兔抗小鼠 Piezo1 单克隆抗体（Novus 公司，美国）；Piezo1 siRNA、siRNA 转染培养基、siRNA 转染试剂（Santa Cruz Biotechnology 公司，美国）；β-actin 单克隆抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司）；RIPA 裂解液、BCA 蛋白定量检测试剂盒、山羊血清（碧云天生物技术有限公司）；488 山羊抗兔荧光二抗（PTG 公司，美国）；DAPI、结晶紫染色液（北京索莱宝生物技术有限公司）。细胞培养箱（上海力申科学仪器有限公司）；垂直电泳仪、电转仪（Bio-Rad 公司，美国）；倒置相差显微镜、BX51 荧光显微镜（Olympus 公司，日本）。

1.2. 细胞培养及 Piezo1-siRNA 转染

将小鼠 MC3T3-E1 成骨细胞按 4×10⁴ 个/mL 密度接种至 25 cm² 无菌培养瓶中，用完全培养基（含 10%FBS 和 100 U/mL 青链霉素的 α-MEM 培养基）于 37℃、5%CO₂ 培养箱中孵育细胞，每隔 2～3 d 用 PBS 缓冲液轻柔洗涤细胞 1～2 次并更换培养基，待细胞融合至 80%～90% 时，用 0.25% 胰蛋白酶消化，接种至 25 cm²培养瓶中继续传代培养，备用。

根据前期预实验结果及细胞形态变化趋势决定取第 5～10 代小鼠 MC3T3-E1 成骨细胞，将细胞按 5×10⁵ 个/mL 密度接种到 6 孔板中，分为 Piezo1-siRNA 转染组（A 组）、阴性对照组（B 组）和空白对照组（C 组），每组设 2 个复孔。于 37℃、5%CO₂ 培养箱中继续孵育 24 h，待 3 组细胞融合至 60%～80% 时准备溶液 a 和溶液 b。溶液 a 是将 2～8 μL Piezo1-siRNA 稀释到 100 μL siRNA 转染培养基中，溶液 b 是将 2～8 μL siRNA 转染试剂稀释到 100 μL siRNA 转染培养基中；将 a、b 溶液混匀，室温放置 30 min，使其充分反应形成转染复合物。用 2 mL siRNA 转染培养基洗涤所有细胞 1 次，吸出培养基，A 组细胞中加入约 200 μL 转染复合物及 800 μL siRNA 转染培养基；B 组细胞中加入 2～8 μL siRNA 转染试剂及 1 mL siRNA 转染培养基；C 组细胞中加入 1 mL siRNA 转染试剂。控制 3 组细胞培养基总量约 1 mL。Piezo1-siRNA 序列：正义 5'-CCUUGU-UCCAGGUCUACUATT-3'，反义 5'-UAGUAGACCU-GGAACAAGGTT-3'；阴性对照 siRNA 序列：正义 5'-UGGUAGUCUGUAAGCUUCGGAACGA-3'，反义 5'-CCGAUCUAAACCUCACCGGACAC-AC-3'。

1.3. 观测指标

1.3.1. 转染后细胞形态观察

3 组细胞于 37℃、5%CO₂ 培养箱中继续孵育 48 h，倒置相差显微镜观察 A 组转染后细胞形态。B 组于每个细胞孔加入带有 FITC 荧光标记的转染试剂 2～8 μL，继续培养 2 h，于荧光显微镜下观察并计算转染效率（视野内荧光细胞数量与细胞总数的比值）。

1.3.2. 免疫荧光染色观察

待 3 组细胞融合至 80%～90% 时，用 0.25% 胰蛋白酶消化，调整细胞密度为 5×10⁵ 个/mL 后接种至载玻片上，于 37℃、5%CO₂ 培养箱中继续孵育 24 h；PBS 洗涤 3 遍，4% 多聚甲醛固定细胞 30 min；PBS 洗涤 3 遍，0.2%Triton X-100 通透 15～20 min；PBS 洗涤 3 遍，山羊封闭血清 37℃ 下封闭 30 min；然后去除封闭液，勿洗，加入兔抗小鼠 Piezo1 单克隆抗体（1∶100），将载玻片置于湿盒中，4℃ 冰箱孵育过夜。PBS 洗涤 3 遍、每遍 5 min，避光下加山羊抗兔荧光二抗（1∶300），37℃ 恒温箱中避光孵育 90 min；PBS 洗涤 3 遍，避光下滴加 DAPI 染核，室温孵育 20 min；PBS 洗涤 3 遍，甘油封片，荧光显微镜下观察。使用 Image J 软件进行半定量荧光强度分析，以吸光度（A）值表示。实验重复 3 次，取均值。

1.3.3. Western blot 检测

3 组细胞转染 48 h 后，用 4℃ 预冷的 PBS 缓冲液轻柔冲洗细胞 2 遍，将完全培养基更换为无血清培养基，继续 37℃、5%CO₂ 培养箱中培养 4 h；PBS 再次冲洗 2 遍，吸净培养皿中的 PBS，用 RIPA 和 PMSF 的混合液（100∶1）冰上裂解细胞，提取细胞总蛋白，BCA 试剂盒测定总蛋白浓度。提取的蛋白质行 6%～10% SDS-PAGE 电泳（浓缩胶 80 V、分离胶 120 V），转膜，室温封闭 2 h，TBST 洗涤 3 遍、每遍 10 min，加兔抗小鼠 Piezo1 单克隆抗体（2 μg/mL）、β-actin 单克隆抗体（1∶2 000），4℃ 摇床上孵育过夜；TBST 洗膜，加辣根过氧化物标记的山羊抗兔或抗小鼠 IgG（1∶5 000），4℃ 摇床上孵育 2 h；TBST 洗膜。滴加 ECL 发光液，使用 Kodak 医用 X 射线胶片曝光，经显影液、定影液处理后得到条带，使用 Image J 软件测量各条带灰度值，以目的蛋白灰度值与其所对应内参 β-actin 蛋白条带的灰度值之比作为目的蛋白的表达水平。实验重复 3 次，取均值。

1.3.4. Transwell 细胞迁移实验

更换培养基静置细胞 4 h（方法同前），用 0.25% 胰蛋白酶消化并分别收集 3 组小鼠 MC3T3-E1 成骨细胞，使用细胞计数板调整细胞密度为 2×10⁵ 个/mL。于 Transwell 上室中加入细胞悬液 200 μL，下室加入 600 μL 含 20% FBS 的 α-MEM 培养基，置于 37℃、5%CO₂ 培养箱中继续培养 48 h；然后取出 Transwell 小室，移除上下室液体，用 PBS 清洗小室 3 遍，4% 多聚甲醛溶液固定细胞 30 min；用棉签小心拭去上室膜上未穿过小室膜的细胞，PBS 清洗 3 遍，风干后加入 0.25% 结晶紫染色 30 min；PBS 清洗 3 遍，倒置相差显微镜下每组随机选取 5 个视野（放大 400 倍）计数迁移到下室的细胞数。实验重复 3 次，取均值。

1.3.5. 细胞划痕实验

取第 5～10 代呈指数生长的小鼠 MC3T3-E1 成骨细胞，用 0.25% 胰蛋白酶消化后，以 5×10⁵ 个/孔密度接种至 6 孔板（提前使用消毒干净的直尺和记号笔在 6 孔板背后均匀划 6 条平行横线，线间距 1 cm）中，按分组方法分别转染细胞，每组设 2 个复孔。待细胞贴壁达 80%～90% 时，更换培养基静置细胞 4 h（方法同前）。借助直尺，使用 200 μL 枪头在板底垂直于所标记横线划 3 条平行直线，用 PBS 轻柔冲洗 3 次，除去残留悬浮细胞，分别于培养 1、2、3、4 d 时，倒置相差显微镜下观察细胞迁移情况。用 Image J 软件测量各时间点愈合划痕面积，并计算划痕愈合率，公式为：（1－划痕面积/最初划痕面积）×100%。实验重复 3 次，取均值。

1.4. 统计学方法

采用 SPSS22.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 SNK 检验；检验水准 α=0.05。

2. 结果

2.1. 转染后细胞形态观察

未转染的小鼠 MC3T3-E1 成骨细胞均贴壁生长，呈矮柱状或立方形，可见细胞轮廓清晰，并带有小突起；核大而圆、核仁清楚，细胞膜完整。转染 48 h 后，A 组可见细胞体积较未转染细胞略有增大，细胞突变长增粗，但细胞集落有所减少，悬浮细胞较未转染增多，细胞碎片增多。荧光显微镜下可见 B 组小鼠 MC3T3-E1 成骨细胞中出现绿色荧光，转染效率为 68.56%±4.12%。见图 1。

图 1.

Morphological observation of mouse MC3T3-E1 osteoblasts before and after transfection

转染前后小鼠 MC3T3-E1 成骨细胞形态观察

a. 未转染细胞（倒置相差显微镜×400）；b. A 组细胞转染 48 h（倒置相差显微镜×400）；c. B 组细胞转染 48 h（荧光显微镜×100）

a. Untransfected cells (Inverted phase contrast microscope×400); b. Cells transfected for 48 hours in group A (Inverted phase contrast microscope×400); c. Cells transfected for 48 hours in group B (Fluorescence microscope×100)

2.2. 免疫荧光染色观察

荧光显微镜观察示，B、C 组细胞界限明显较 A 组清楚，细胞质及细胞核荧光强度均高于 A 组。见图 2。A 组细胞 A 值（0.234±0.006）显著低于 B 组（0.435±0.012）和 C 组（0.403±0.034），差异有统计学意义（P<0.05）；B、C 组间差异无统计学意义（P>0.05）。

图 2.

Immunofluorescence staining observation for Piezo1 protein expression in each group (Fluorescence microscope×200)

免疫荧光染色观察各组 Piezo1 蛋白表达（荧光显微镜×200）

从左至右依次为 Piezo1、细胞核、二者重叠　a. A 组；b. B 组；c. C 组

From left to right for Piezo1, nucleus, and merge　a. Group A; b. Group B; c. Group C

2.3. Western blot 检测

Western blot 检测示，A 组 Piezo1 蛋白相对表达量（0.507±0.034）显著低于 B 组（0.829±0.062）和 C 组（0.808±0.058），差异有统计学意义（P<0.05）；B、C 组间差异无统计学意义（P>0.05）。见图 3。

图 3.

Piezo1 protein expression in each group detected by Western blot

Western blot 检测各组 Piezo1 蛋白表达

Mr：相对分子质量　1：C 组　2：B 组　3：A 组

Mr: Relative molecular mass　1: Group C　2: Group B　3: Group A

2.4. Transwell 细胞迁移实验

倒置相差显微镜观察示，B、C 组细胞密度明显大于 A 组。见图 4。A、B、C 组迁移细胞数分别为（39.400±9.502）、（66.400±12.992）、（68.200±11.713）个/孔，A 组明显少于 B、C 组，差异有统计学意义（P<0.05）；B、C 组间差异无统计学意义（P>0.05）。

图 4.

Cell migration ability of each group observed by inverted phase contrast microscope (Crystal violet staining×400)

倒置相差显微镜观察各组细胞迁移能力（结晶紫染色×400）

a. A 组；b. B 组；c. C 组

a. Group A; b. Group B; c. Group C

2.5. 细胞划痕实验

倒置相差显微镜观察示，划痕愈合率随时间延长逐渐增加，第 4 天划痕基本愈合完整，且 B、C 组愈合速度明显快于 A 组。见图 5。培养 1～4 d，A 组细胞划痕愈合率均明显小于 B、C 组，差异有统计学意义（P<0.05）；B、C 组间差异无统计学意义（P>0.05）。见表 1。

图 5.

Cell migration ability of each group at different time points detected by cell scratch test (Inverted phase contrast microscope×100)

细胞划痕实验检测各时间点各组细胞迁移能力（倒置相差显微镜×100）

从左至右分别为 A、B、C 组　a. 0 d；b. 1 d；c. 2 d；d. 3 d；e. 4 d

From left to right for groups A, B, and C　a. Zero day; b. One day; c. Two days; d. Three days; e. Four days

表 1.

Cell scratch test for detecting the healing rate of cell scratches at different time points in each group (n=3, %, )

细胞划痕实验检测各时间点各组细胞划痕愈合率（n=3，%， ）

组别 Group	1 d	2 d	3 d	4 d
*与 B 组比较 P<0.05，#与 C 组比较 P<0.05 *Compared with group B, P<0.05;#compared with group C, P<0.05
A	8.81±2.49*#	29.14±4.93*#	40.73±6.62*#	56.77±4.35*#
B	37.03±2.94	60.76±5.03	80.67±5.55	98.00±0.26
C	35.63±2.99	61.29±2.99	80.58±6.44	98.46±0.26
统计值 Statistic	F=95.563 P= 0.000	F=52.067 P= 0.000	F=41.160 P= 0.000	F=271.234 P= 0.000

3. 讨论

骨折愈合是一个复杂而神秘的生物学修复过程，受多方面因素的影响^[10]。骨折愈合过程经历炎症期、修复期、重塑期，3 个阶段相互交织演进，无法截然分开。有诸多因素可以影响骨折愈合，一般认为生长因子、骨传导支架、MSCs 以及机械环境是影响骨折愈合的 4 个主要因素^[11]；其中，成骨细胞分化及迁移对骨折愈合起着至关重要的作用。Eleniste 等^[12]的研究结果表明，动力蛋白 GTPase 的活性对成骨细胞的分化及迁移至关重要。Aryal 等^[7]的研究显示，Nck（酪氨酸激酶的非催化区域，统称为 Nck1 和 Nck2）是维持骨质量的前成骨细胞和成骨细胞迁移，从而促进骨形成的关键调节剂。同时，Vishnuprasad 等^[13]的研究提供了 aurantio-obtusin（一种新提取的药用植物化合物）可以刺激成骨细胞迁移和分化的诸多证据。

近年研究发现，多条信号通路参与骨折愈合过程，如机械敏感性离子通道-瞬时感受器电位通道（TRP）^[14-15]等。而作为机械敏感性离子通道的较新成员，新型离子通道蛋白 Piezo 在骨折愈合中的机制研究目前尚无报道。本研究以此为切入点，旨在明确 Piezo1 在小鼠骨折愈合生理过程中的作用，有助于阐明其在骨折愈合中的生理机制，为治疗骨折提供新的靶点。

本实验将 Piezo1-siRNA 转染至小鼠 MC3T3-E1 成骨细胞中抑制 Piezo1 的表达，初步探讨沉默 Piezo1 离子通道表达对小鼠 MC3T3-E1 成骨细胞迁移特性的影响。结果显示，沉默 Piezo1 后小鼠 MC3T3-E1 成骨细胞中 Piezo1 蛋白的表达以及细胞迁移能力均有明显下降，提示 Piezo1 离子通道蛋白在促进小鼠 MC3T3-E1 成骨细胞迁移特性方面起着一定作用。

综上述，本研究结果表明，采用 Piezo1-siRNA 可以成功沉默 Piezo1 蛋白的表达，小鼠 MC3T3-E1 成骨细胞在 Piezo1 蛋白被沉默后，其迁移能力明显受抑制。由此，我们推测机械敏感型离子通道 Piezo1 可能参与成骨细胞迁移以及骨形成的调控，但其具体分子机制有待进一步研究证实。因此，研究 Piezo1 离子通道在骨质疏松发病机制以及骨折治疗中的作用非常重要，尤其是随着人们对各种 Piezo1 离子通道抑制剂 GsMTx4^[16-18]和激活剂 Yoda1^[19-21]的了解，它有可能成为治疗骨折和研发抗骨质疏松药物的新靶点。但以上实验所反映出来的迁移抑制效果究竟是抑制 Piezo1 蛋白所达到的直接效应，还是通过抑制 Piezo1 蛋白间接抑制其他一些与迁移直接相关蛋白的表达，如基质金属蛋白酶^[22-23]、整合素^[24]等，进而调节小鼠 MC3T3-E1 成骨细胞的迁移能力，还需更进一步研究。

Funding Statement

国家自然科学基金资助项目（81672207）；甘肃省自然科学基金面上项目（17JR5RA188）；甘肃省青年科技研究基金（17JR5RA226）；兰州大学第二医院萃英科技创新计划（CY2017-QN11）

National Natural Science Foundation of China (81672207); Natural Science Foundation of Gansu Province (17JR5RA188); Gansu Youth Science and Technology Research Funds (17JR5RA226); Science and Technology Innovation Plan of Lanzhou University Second Hospital (CY2017-QN11)