Abstract
目的
探讨富血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP）治疗兔跟腱病的效果，为 PRP 治疗跟腱病的临床应用提供实验依据。
方法
取成年新西兰大白兔 48 只，体质量 2.5～3.0 kg，雌雄不限，随机分为模型组（A 组）、模型对照组（B 组）、模型+治疗对照组（C 组）、模型+治疗组（D 组），每组 12 只。A、C、D 组注射Ⅰ型胶原酶制备兔跟腱病模型，B 组注射等剂量生理盐水。D 组取自体耳中心动脉血，采用二次离心法制备 PRP，血小板计数提示 PRP 血小板达全血的 3～5 倍。模型制备后，C、D 组于造模部位分别注射生理盐水、自体 PRP，每周 1 次，每次 0.8 mL，连续 4 周。于 PRP 注射结束后 1 周，采用超声弹性定量成像检测技术评价各组跟腱相对硬度，以 HRD%（硬度百分比）表示；万能电子拉力试验机测定跟腱最大断裂负荷；ELISA 法测定Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白含量；HE 染色和 Masson 染色观察跟腱胶原纤维形态。
结果
各组动物均存活至实验完成。超声弹性定量成像检测及力学试验示，A 组跟腱硬度评价指标 HRD% 及最大断裂负荷显著小于 B 组（P<0.05），C 组显著小于 D 组（P<0.05）。ELISA 检测示，A 组Ⅰ型胶原蛋白含量显著低于 B 组、C 组显著低于 D 组，A 组Ⅲ型胶原蛋白含量显著高于 B 组、D 组显著高于 C 组，差异均有统计学意义（P<0.05）。HE 染色和 Masson 染色示，A 组跟腱胶原纤维呈不规则卷曲，结构严重破坏；B 组呈平行有序排列、结构完整；C 组呈不规则卷曲，结构紊乱；D 组呈轻微卷曲，结构较为完整。
结论
Ⅰ型胶原酶注射可成功构建兔跟腱病模型，PRP 治疗可增加跟腱硬度和最大断裂负荷，上调Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达水平，改善跟腱胶原纤维结构和形态，促进兔跟腱病的恢复。
Keywords: 富血小板血浆, 跟腱病, 兔
Abstract
Objective
To explore the effect of platelet-rich plasma (PRP) in treatment of Achilles tendinopathy in rabbits, and provide experimental evidence for the clinical application of PRP in treatment of Achilles tendinopathy.
Methods
Forty-eight adult New Zealand white rabbits, weighing 2.5-3.0 kg, male or female, were randomly divided into model group (group A), model control group (group B), model+treatment control group (group C), model+treatment group (group D), with 12 in each group. The rabbits were injected with type Ⅰ collagenase to prepare Achilles tendinopathy models in groups A, C, and D, and with an equal dose of normal saline in group B. The blood from the central artery of rabbit ear was taken to preprare PRP by secondary centrifugation in group D. The results of platelet counts showed that PRP platelets reached 3 to 5 times the whole blood. After the model was prepared, the rabbits in groups C and D were injected with physiological saline and autologous PRP at the molding site respectively, once a week, 0.8 mL each time for 4 weeks. At 1 week after PRP injection, the relative hardness (expressed as HRD%) of Achilles tendon was evaluated by ultrasound elastic quantitative imaging detection technique; the maximum breaking load of Achilles tendon was measured by universal electronic tensile testing machine; the contents of collagen type Ⅰ and Ⅲ were determined by ELISA; and the morphology of Achilles tendon collagen fibers was observed by HE and Masson stainings.
Results
All animals survived during the experiment. The results of ultrasound elastic quantitative imaging and mechanical tests showed that the HRD% and the maximum breaking load were significantly lower in group A than in group B (P<0.05) and in group C than in group D (P<0.05). The results of ELISA showed that the content of collagen type Ⅰ was significantly lower in group A than in group B (P<0.05) and in group C than in group D (P<0.05); the content of collagen type Ⅲ was significantly higher in group A than in group B (P<0.05) and in group D than in group C (P<0.05). HE and Masson stainings showed that the Achilles tendon collagen fibers were irregularly curled and the structure was severely damaged in group A; the fibers were parallel and ordered, and the structure was complete in group B; the fibers were irregularly curled and structurally disordered in group C; the fibers were slightly curled and the structure was relatively complete in group D.
Conclusion
A rabbit model of Achilles tendinopathy can be reconstructed by type Ⅰ collagenase injection. PRP treatment can increase the Achilles tendon hardness and maximum breaking load, up-regulate the expression level of collagen type Ⅰ and Ⅲ, improve the structure of Achilles tendon collagen fiber, and promote the repair in rabbit Achilles tendinopathy model.
Keywords: Platelet-rich plasma, Achilles tendinopathy, rabbit
跟腱过度使用性损伤称为跟腱病，临床表现为局灶性疼痛、晨僵和功能受限，影响患者生活质量[1]。目前跟腱病治疗方法较多，包括康复锻炼与休息、理疗、冲击波、非甾体抗炎药、激素、自体血制品以及手术等，但尚无一种能获得理想疗效[2]。富血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP）是全血经离心后获得的血小板超过生理浓度数倍的血液制品，含有丰富的 TGF-β、FGF、结缔组织生长因子等多种生长因子，可促进软组织损伤修复，同时具有制备简便、创伤小、无免疫排斥反应等优势，近年来被广泛用于肌腱、韧带、软骨以及其他软组织损伤的临床治疗[3]，但目前 PRP 用于跟腱病的治疗剂量、治疗频率和治疗效果等方面仍存在争议，且缺少定量评价指标[4]。本研究通过注射Ⅰ型胶原酶制备兔跟腱病模型，以自体血二次离心法制备的 PRP 进行治疗并观察疗效，以期为临床应用 PRP 治疗跟腱病提供参考。
1. 材料与方法
1.1. 实验动物及主要试剂、仪器
健康成年新西兰大白兔 48 只，体质量 2.5～3.0 kg，雌雄不限，由联勤保障部队第九四〇医院动物实验中心提供。
Ⅰ型胶原酶（Sigma 公司，美国）；4% 多聚甲醛（武汉博士德生物工程有限公司）；HE 染色试剂盒、Masson 染色试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；兔Ⅰ型胶原及Ⅲ型胶原 ELISA 检测试剂盒（上海酶联生物科技有限公司）。
微量注射器（宁波三爱仪器厂）；高速冷冻离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司）；全自动动物血液分析仪（Sysmex 公司，日本）；彩色多普勒超声诊断仪（Mylab Twice 公司，意大利）；酶标仪（Bio-Rad 公司，美国）；万能电子拉力试验机（岛津公司，日本）。
1.2. 实验分组及方法
将 48 只新西兰大白兔随机分为模型组（A 组）、模型对照组（B 组）、模型+治疗对照组（C 组）、模型+治疗组（D 组），每组 12 只。参照 Chen 等[5]提出的跟腱病模型制备方法并进行改良，将 4 组动物以俯卧位固定于手术操作台，耳缘静脉注射 2% 戊巴比妥钠（1.5 mL/kg）麻醉，左后肢跟腱处剃毛、消毒，于跟腱跟骨附着点 0.5 cm 处插入微量注射器，沿跟腱长轴缓慢推进，A、C、D 组注射Ⅰ型胶原酶 50 μL（10 000 U/mL），B 组注射等剂量生理盐水，每周 1 次，连续注射 4 周。第 5 周开始 C、D 组于造模部位分别注射生理盐水、自体 PRP，每周 1 次，每次 0.8 mL，连续 4 周；A、B 组不作其他处理。实验期间所有动物均正常饲养，后肢不制动。
1.3. PRP 制备方法
参考 Landesberg 等[6]的二次离心法制备 PRP。D 组每只兔采集耳中心动脉血 10 mL，注入 EDTA 抗凝真空采血管中，反复摇晃使血液与抗凝剂混合充分后，以 200×g 离心 10 min。离心后血液分为 3 层，从上到下依次为血清层、白膜层（血小板和白细胞）和红细胞层。吸去白膜层 2 mm 界面以下的红细胞，剩余部分以 200×g 离心 10 min。离心后仍分为 3 层，吸去上层 3/4 上清液，剩余约 1 mL 部分摇匀即为 PRP。取部分全血和 PRP 在全自动动物血液分析仪中检测血小板计数。结果显示，PRP 血小板计数为（1 258.92±88.11）×109/L，是全血血小板［（336.50±40.34）×109/L］的 3～5 倍，满足实验治疗要求[7]。
1.4. 观测指标
1.4.1. 一般情况
实验期间观察各组动物活动、进食及有无感染等情况发生。
1.4.2. 超声弹性成像检测
PRP 注射结束后 1 周，取各组动物行左后肢超声弹性定量成像分析。动物俯卧位固定，去除左后肢跟腱处毛发，使用彩色多普勒超声诊断仪，线针探头，频率 5～20 MHz，以仪器预设的肌骨扫描条件、弹性成像模式，在跟腱纵切面采集弹性图像。移动探头明确跟腱病区域后，当压力曲线频率幅度一致、图像清晰稳定后保存图像。组织内红、绿、蓝像素分别表示组织硬度相对较低、中等和较高。以注射部位为参考，利用仪器弥散定量技术分析相同感兴趣区域（固定面积为 30 mm2）内蓝色像素所占百分比，以 HRD%（硬度百分比）表示，代表组织相对硬度，HRD% 越大表示组织硬度越大、弹性越小。
1.4.3. 跟腱力学特性检测
超声弹性成像检测后，采用空气栓塞法处死 4 组动物，立即取左后肢跟腱并使用生理盐水及纱布覆盖保持湿润。跟腱两端垫衬薄纱布防止损伤，使用特制夹具固定于万能电子拉力试验机上，将跟腱沿纵轴方向作拉伸试验，预载前负荷设置为 2 N，保持适当张力，加载速率为 1 mm/s，当跟腱胶原酶注射部附近断裂时记录最大断裂负荷。
1.4.4. ELISA 法检测跟腱Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白含量
跟腱力学特性检测后，将每个跟腱样本均分为两部分，随机取其中一部分漂洗、称量、剪碎后进行组织匀浆（取 1 g 组织加入 9 mL PBS）；以离心半径10 cm、3 500 r/min 离心 10 min，收集上清液。在酶标板中加入 50 μL 样品和标准品以及 50 μL 酶标液后，在样品孔中加入 10 μL 生物素标记液，37℃ 孵育 60 min，洗涤后加入底物 A、B 液各 50 μL，37℃ 孵育 20 min 后加入终止液，于酶标仪 450 nm 处测吸光度（A）值，绘制标准曲线计算样本中Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白含量。
1.4.5. 组织学观察
取各组剩余跟腱样本，沿纤维束方向分成两半，PBS 漂洗后置于 4% 多聚甲醛溶液中固定 24 h，石蜡包埋，纵向切片，片厚 5 μm。常规行 HE 染色及 Masson 染色，光镜下观察各组跟腱纤维形态。
1.5. 统计学方法
采用 SPSS19.0 统计分析软件和 GraphPad Prism 5 统计作图软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD 检验；检验水准 α=0.05。
2. 结果
2.1. 一般情况
各组动物均存活，实验期间正常活动、进食，无感染等情况发生。
2.2. 超声弹性成像检测
A 组：跟腱局部及周边组织以绿、红像素为主，感兴趣区域内 HRD% 为 32.71%±5.23%；B 组：跟腱局部及周边组织以绿、蓝像素为主，感兴趣区域内 HRD% 为 63.28%±4.37%；C 组：跟腱局部及周边组织以绿、红像素为主，感兴趣区域内 HRD% 为 37.94%±3.71%；D 组：跟腱局部及周边组织以绿、蓝像素为主，感兴趣区域内 HRD% 为 56.62%±4.82%。见图 1。A 组感兴趣区域内 HRD% 显著小于 B 组，C 组显著小于 D 组，差异均有统计学意义（P<0.05）。
图 1.
Achilles tendon hardness was evaluated by ultrasound elastic quantitative imaging
超声弹性成像弥散定量技术评估各组跟腱硬度
圆圈内表示感兴趣区域 a. A 组；b. B 组；c. C 组；d. D 组
The circle indicated the interesting area a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
2.3. 跟腱力学特性检测
A、B、C、D 组最大断裂负荷分别为（36.32±9.81）、（112.25±11.03）、（43.73±8.93）、（91.17±12.61）N。A 组最大断裂负荷显著小于 B 组，C 组显著小于 D 组，差异均有统计学意义（P<0.05）。
2.4. ELISA 检测 Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白含量
A、B、C、D 组Ⅰ型胶原蛋白含量分别为（122.27±8.36）、（183.62±9.34）、（128.56±9.78）、（162.13±10.45）ng/mg，A 组显著低于 B 组，C 组显著低于 D 组，差异均有统计学意义（P<0.05）。
A、B、C、D 组Ⅲ型胶原蛋白含量分别为（15.72±1.18）、（12.30±1.29）、（12.78±1.31）、（16.17±1.09）ng/mg，A 组显著高于 B 组，D 组显著高于 C 组，差异均有统计学意义（P<0.05）。
2.5. 组织学观察
HE 染色和 Masson 染色结果显示：A 组跟腱纤维多呈严重不规则卷曲，结构破坏、松弛、排列紊乱，纤维组织碎片增多，相邻束间界限不清，部分胶原纤维断裂甚至溶解。B 组跟腱纤维组织呈平行排列，整齐有序，结构完整，整体性强，相邻纤维束之间界限清晰，分布均匀。C 组跟腱纤维呈不规则卷曲，结构排列紊乱，部分断裂溶解，相邻束间界限不清。D 组跟腱纤维有轻微卷曲改变，但纤维连续，排列较整齐，相邻束间界限较清晰，无明显断裂溶解。见图 2、3。
图 2.
HE staining of Achilles tendon in each group (×40)
各组跟腱 HE 染色观察（×40）
a. A 组；b. B 组；c. C 组；d. D 组
a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
图 3.
Masson staining of Achilles tendon in each group (×40)
各组跟腱 Masson 染色观察（×40）
a. A 组；b. B 组；c. C 组；d. D 组
a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
3. 讨论
近年来跟腱病发病率不断增高，各种治疗方法的效果并不理想，常反复发作影响患者生活质量。PRP 因含有多种生长因子可促进组织修复，被广泛应用于肌腱、韧带、软骨以及其他软组织损伤的临床治疗，但动物实验研究相对较少，因此我们用Ⅰ型胶原酶注射法建立兔跟腱病模型，通过超声弹性定量成像技术、力学试验、ELISA 和组织学观察研究 PRP 治疗跟腱病的效果。
跟腱病动物模型的建立主要有机械刺激和药物诱导两种方法，Ⅰ型胶原酶注射法简便高效，与人类肌腱病后期许多表现相似，如细胞增多、基质丢失、血供增加和无菌性炎症，胶原纤维损伤，生物力学性能降低，Ⅰ、Ⅲ型胶原表达比例倒置等，但也存在对周围组织造成损失以及注射后引起较强的损伤修复反应等不足 [8-9]。本实验发现Ⅰ型胶原酶注射后兔跟腱胶原纤维卷曲、结构被破坏，跟腱硬度、力学性能明显降低，Ⅰ型胶原蛋白合成减少、Ⅲ型胶原蛋白合成增多，提示模拟出跟腱病的病理表现。另外，注射生理盐水治疗后跟腱的各项检测也出现了一定恢复，这可能与胶原酶注射后引起的损伤修复较强有关[10]。
目前 PRP 的制备方法主要有密度梯度离心法和血浆分离置换法两种，其中 Landesberg 法是经典的二次离心制备法，其操作容易、对设备要求低，在大多数研究中显示所制备的 PRP 中血小板含量和血小板回收率均较高[11-12]。本实验采用此法获得的 PRP 血小板浓度为全血的 3～5 倍，能够满足实验治疗需求。
微小组织和血管病理改变常导致跟腱硬度发生变化，使用超声弹性定量成像技术能够定性、定量分析跟腱硬度或弹性的变化程度，具有可行性和可重复性，对跟腱病的诊断及判断其预后有较好作用[13-14]，与传统方法相比，该技术能够与临床结合，检测人跟腱病的变化情况，其检测效果也能与生物力学、ELISA 以及病理检测等基础实验结果相互印证。本研究发现胶原酶造模后兔跟腱硬度明显减小，最大断裂负荷降低，Ⅰ型胶原蛋白表达减少、Ⅲ型胶原蛋白表达增加，跟腱纤维严重破坏、部分胶原纤维断裂甚至溶解。由于胶原酶注射产生的跟腱病理变化同人类跟腱病最后阶段的病理变化一样，产生炎性反应后出现了以组织降解为主的病理变化，同时伴随力学性能（如刚度和应力）的降低[15]，在跟腱病病理过程中胶原基质降解、基质金属蛋白酶 1 增加、基质金属蛋白酶抑制剂降低和溶解胶原活性增加导致胶原排列紊乱，Ⅰ型胶原减少、Ⅲ型胶原增加[16-17]，这些组织结构的改变必然导致跟腱生物硬度降低、力学特性受损。这也与吴言等[18]的研究结果一致。
PRP 注射治疗后，跟腱硬度增加并趋于正常，最大断裂负荷增加，组织学观察也发现胶原纤维卷曲减轻，结构破坏恢复，提示 PRP 注射后促进了跟腱病的修复。PRP 含有 TGF-β1、PDGF、VEGF 和 IGF-1 等多种生长因子，在创伤愈合过程中具有促进细胞增殖，胶原合成、分泌以及炎性趋化的作用。耿震等[19]认为这可能与 PRP 使肌腱中 TGF-β1 表达提前达峰值有关。Ⅰ型胶原具有强度大、弹性低的特点，主要起组织稳定作用；Ⅲ型胶原含量较少，在跟腱修复过程中表达增加，随着Ⅲ型胶原转化为Ⅰ型胶原，跟腱性能得到恢复[20]。本研究表明 PRP 通过促进Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达，可能促进了跟腱的修复。
另外，本研究也存在一定局限：动物模型与临床患者之间存在一定差异，不能完全反映跟腱病的检测和治疗恢复过程；离体生物力学测试与活体状态下有所不同，跟腱病恢复程度可能与 PRP 注射剂量、频率和方法等因素有关，需要进一步探索。
作者贡献：巩栋、赵茂胜、苏文财负责实验实施、数据收集整理、文章撰写；巩栋、董晨辉负责科研设计、统计分析；邓银栓负责查阅修改文本；甄平负责审校论文。
利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。
机构伦理问题：研究方案经中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院医学伦理委员会批准（2019KYLL034）。实验过程遵循《关于善待实验动物的指导性意见》处理动物。实验动物使用许可证号：SYXK（军）2017-0046。
Funding Statement
全军后勤科研计划面上项目（CWH17J007）；甘肃省自然科学基金资助项目（18JR3RA409）
Military Logistics Reasearch Project (CWH17J007); Natural Science Foundation of Gansu Province (18JR3RA409)
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