温敏性壳聚糖神经导管的绿色制备方案及性能研究

Abstract

Objective

To explore a green route for the fabrication of thermo-sensitive chitosan nerve conduits, improve the mechanical properties and decrease the degradation rate of the chitosan nerve conduits.

Methods

Taking advantage of the ionic specific effect of the thermo-sensitive chitosan, the strengthened chitosan nerve conduits were obtained by immersing the gel-casted conduits in salt solution for ion-induced phase transition, and rinsing, lyophilization, and ⁶⁰Co sterilization afterwards. The nerve conduits after immersing in NaCl solutions for 0, 4, 12, 24, 36, 48, and 72 hours were obtained and characterized the general observation, diameters and mechanical properties. According to the above results, the optimal sample was chosen and characterized the microstructure, degradation properties, and cytocompatibility. The left sciatic nerve defect 15 mm in length was made in 20 male Sprague Dawley rats. The autologous nerves (control group, n=10) and the nerve conduits (experimental group, n=10) were used to repair the defects. At 8 weeks after operation, the compound muscle action potential (CMAP) was measured. The regenerated nerves were investigated by gross observation and toluidine blue staining. The gastrocnemius muscle was observed by HE staining.

Results

With the increased ionic phase transition time, the color of the conduit was gradually deepened and the diameter was gradually decreased, which showed no difference during 12 hours. The tensile strength of the nerve conduit was increased gradually. The ultimate tensile strength showed significant difference between the 48 hours and 12, 24, and 36 hours groups (P<0.05), and no significant difference between the 48 hours and 72 hours groups (P>0.05). As a result, the nerve conduit after ion-induced phase transition for 48 hours was chosen for further study. The scanning electron microscope (SEM) images showed that the nerve conduit had a uniform porous structure. The degradation rate of the the nerve conduit after ion-induced phase transition for 48 hours was significantly decreased as compared with that of the conduit without ion-induced phase transition. The nerve conduit could support the attachment and proliferation of rat Schwann cells on the inner surface. The animal experiments showed that at 8 weeks after operation, the CMAPs of the experimental and control groups were (3.5±0.9) and (4.3±1.1) m/V, respectively, which showed no significant difference between the two groups (P<0.05), and were significantly lower than that of the contralateral site ［(45.6±5.6 m/V),P>0.05］. The nerve conduit of the experimental group could repair the nerve defect. There was no significant difference between the experimental and control groups in terms of the histomorphology of the regenerated nerve fibers and the gastrocnemius muscle.

Conclusion

The green route for the fabrication of thermo-sensitive chitosan nerve conduits is free of any toxic reagents, and has simple steps, which is beneficial to the industrial transformation of the chitosan nerve conduit products. The prepared chitosan nerve conduit can be applied to rat peripheral nerve defect repair and nerve tissue engineering.

近年来，利用神经导管修复周围神经缺损的研究取得了较大进展^[1-2]。天然高分子材料因具有良好的生物相容性和可塑性等诸多优点^[3-4]，是制备神经导管的首选材料之一，然而其力学强度较弱和降解时间较快。为弥补上述不足，有学者提出采用化学交联剂处理，但存在细胞毒性问题^[5]；与合成高分子复合又会导致体内降解速率不匹配。因此，如何采取一种绿色无毒而又简便的工艺以有效提高天然高分子神经导管的强度，是一项亟待解决的难题。

温敏性壳聚糖是一种对温度具有高度响应性的智能水凝胶，保留了几丁糖优良的生物相容性和抑制纤维化、抗炎等其他生物学特性^[6-8]。最近研究表明，壳聚糖具有离子特异性效应^[9]，提示可以通过改变壳聚糖体系中的离子强度，在不引入化学交联剂的情况下就可调控其机械强度和降解性能。因此，本研究以温敏性壳聚糖为主要原料，利用其离子特异性效应设计高强度天然高分子神经导管的绿色制备工艺，并对制备的导管材料力学强度、降解性能、微观结构、细胞相容性和体内修复效果进行详细表征，以期为壳聚糖神经导管的产品转化和下一步应用于体内修复周围神经缺损奠定理论基础。

1. 材料与方法

1.1. 主要材料及仪器

温敏性壳聚糖（上海其胜生物制剂有限公司）；NaCl （江苏勤奋药业有限公司）；DMEM 培养基、FBS（GIBCO 公司，美国）；溶菌酶（>20 000 U/mg，上海源聚生物科技有限公司）；溴化钾、多聚甲醛（Sigma 公司，美国）；戊二醛（上海凌峰化学试剂有限公司）；死/活细胞染色试剂盒（Invitrogen 公司，美国）；无水乙醇（上海凌峰化学试剂有限公司）；甲苯胺蓝、HE 染色试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）。RSC96 大鼠雪旺细胞（中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库）。

冷冻干燥机（上海亿倍实业有限公司）；扫描电镜（HITACHI 公司，日本）；CO₂ 恒温培养箱（Memmert 公司，德国）；荧光倒置显微镜（Nikon 公司，日本）；红外光谱仪（Thermo 公司，美国）；AL-3000 力学测试仪（中国高铁检测仪器公司）；游标卡尺（精度 0.02 mm；Mitutoyo 公司，日本）。

1.2. 神经导管制备方法

将浓度为 0.8%（W/V）的温敏性壳聚糖溶液低温下灌至带芯棒的定型装置中。芯棒外径 1 mm，采用相变材料涂层。然后，将装置置于 20～60℃ 环境 60 min 进行凝胶化和赋形。将初步成型的凝胶置于浓度为 0.9%（W/V）的 NaCl 溶液中进行离子相变，分别取 37℃ 下浸泡 0、4、12、24、36、48、72 h 得到的弹性凝胶体，转入纯化水中清洗 10 min，以去除过多盐分，得到神经导管中间品。最后，将中间品放入冷冻干燥机中进行干燥，得到神经导管，经⁶⁰Co 辐照灭菌备用。

1.3. 体外观测

1.3.1. 神经导管大体观察及外径测量

取于 NaCl 溶液中浸泡 0～72 h 获得的神经导管，大体观察其颜色，并采用游标卡尺测量其外径。实验重复 6 次。

1.3.2. 力学强度测试

取 1.2 中于 NaCl 溶液中浸泡 0～72 h 获得的神经导管，采用力学测试仪表征其轴向拉伸强度。具体步骤：取相同内径、外径的湿态神经导管样品，用夹具夹紧，保持夹具间神经导管长度为 2 cm，轴向与拉力方向平行，室温下以 2 mm/min 的速度进行拉伸，直至样品被拉断，得到单轴拉伸的拉力-伸长率曲线，记录最大轴向拉力。实验重复 4 次。

结合大体、外径测量以及力学强度测试结果，选择最佳离子相变时间点神经导管进行后续观测。

1.3.3. 微观结构观察

采用扫描电镜观察神经导管的微观形貌。将神经导管浸没于液氮中使之迅速冷冻，分别沿轴向和径向进行淬断，喷金处理后，镜下观察神经导管的横截面与纵截面结构。

1.3.4. 体外酶降解性能测试

采用可降解壳聚糖材料的溶菌酶对神经导管进行体外酶降解性能测试^[10]。取冻干的神经导管，称量其初始质量后，浸泡于浓度为 2 mg/mL 的溶菌酶溶液中，于 37℃、以 120 r/min 转速不断震荡，设置降解时间点为 3、7、14、21 和 28 d，每隔 2 d 更换新鲜酶液。取各时间点降解后的神经导管冻干，称重；采用质量损失百分比代表降解率。同时采用扫描电镜观察降解后的神经导管微观形貌。以未经离子相变的神经导管作为对照。实验重复 3 次。

1.3.5. 细胞相容性观察

采用 RSC96 大鼠雪旺细胞观察神经导管的细胞相容性。将灭菌的神经导管沿轴向剖开，置于 48 孔板中，导管内层向上。将 500μL 细胞悬液加至导管内层表面，细胞密度 5×10⁴个/mL，添加含 1% 双抗和 10%FBS 的 H- DMEM，置于 CO₂ 培养箱中培养，每隔 2 d 换液。

培养 5 d 后，取神经导管进行扫描电镜观察与细胞活力检测。 ① 扫描电镜观察：样品置于 2.5% 戊二醛固定 4 h，梯度乙醇脱水后，置于通风橱中风干过夜。最后样品喷金，镜下观察表面形貌。② 采用死/活细胞染色表征神经导管上的细胞活力。样品用 PBS 清洗 5 min，参照死/活细胞染色试剂盒说明进行染色。孵育 15 min 后，采用倒置荧光显微镜成像，激发/发射滤波器分别设置为 488/530 和 530/580 nm，以检测活细胞（绿色）和死细胞（红色）。

1.4. 动物体内修复效果评价

1.4.1. 实验分组及方法

选用 20 只雄性 SD 大鼠（上海斯莱克实验动物有限公司），体质量 200～230 g，随机分为实验组及对照组，每组 10 只。两组大鼠采用 1% 戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔注射麻醉后，于左后肢股后外侧行纵切口，自肌间隙进入显露长约 2.5 cm 的坐骨神经。于坐骨神经中段切取 12 mm，任其回缩到 15 mm，实验组及对照组分别采用筛选的神经导管以及切取的自体坐骨神经桥接修复缺损。神经导管桥接时，两端分别套入 1 mm，10-0 尼龙线 3 针固定。手术均在显微镜下完成。术后皮下补液 5 mL；肌肉注射青霉素 16 万 U/d，连续 3 d，常规饲养。

1.4.2. 观测指标

① 复合肌肉动作电位（compound muscle action potential，CMAP）检测：术后 8 周，于两组大鼠伤侧坐骨神经干近端部分施加电刺激，记录同侧腓肠肌腹部 CMAP，以健侧 CMAP 作为对照。② 大体及组织学观察：CMAP 检测后，大鼠同上法麻醉、显露伤侧坐骨神经，大体观察再生神经后，迅速取材并固定于 4% 多聚甲醛中。然后继续向下方延伸切口至足跟，显微剪刀沿肌间隙锐性游离腓肠肌，在上、下附着点处将其剪断，固定于 4% 多聚甲醛中；24 h 后样本脱水包埋，行横断面切片，厚度约 4 μm。对神经组织切片行甲苯胺蓝染色，对腓肠肌行 HE 染色，镜下分别观察再生神经和腓肠肌的组织形貌。

1.5. 统计学方法

采用 SPSS19.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD 检测；检验水准 α=0.05。

2. 结果

2.1. 神经导管大体观察及外径测量

浸泡 0 h（未进行离子相变）的神经导管呈透明状；4 h 时导管呈乳白色，12 h 时变为白色，之后颜色未继续加深，提示神经导管发生不同程度离子相变。外径测量显示，4 h 内神经导管外径快速减小，12 h 后外径几乎保持一致，最终神经导管外径约为 4 mm。见图 1a、b。

图 1.

In vitro investigation of the nerve conduits

神经导管体外观测

a. 离子相变各时间点神经导管大体观察，从左至右分别为 0、4、12、24、36、48、72 h；b. 离子相变各时间点神经导管外径；c. 神经导管拉力-伸长率曲线；d. 神经导管横截面扫描电镜观察（×50）；e. 神经导管纵截面扫描电镜观察（×100）；f. 降解各时间点神经导管酶降解率；g. 降解 28 d 扫描电镜观察神经导管（×500）；h. 扫描电镜观察在神经导管表面培养 5 d 的雪旺细胞（×1 000）；i. 死/活细胞染色观察在神经导管表面培养 5 d 的雪旺细胞（×100）

a. Gross observation of the nerve conduits with different phase transition durations, from left to right for 0, 4, 12, 24, 36, 48, and 72 hours, respectively; b. The external diameters of the nerve conduits with different phase transition durations; c. The axial tensile force-elongation curves of the nerve conduits; d. SEM images of the transversal sections of the nerve conduits (×50); e. SEM images of the longitudinal sections of the nerve conduits (×100); f. The enzyme-degradation rates of the nerve conduits with different digestion time; g. The SEM image of the nerve conduit after 28 days of enzyme digestion (×500); h. The SEM image of Schwann cells after 5 days of culture on the inner layer of the nerve conduit (×1 000); i. The live/dead cell staining of Schwann cells after 5 days of culture on the inner layer of the nerve conduit (×100)

2.2. 力学强度测试

0、4 h 时样品较软，易被夹具夹断，未测试其拉伸力学强度。12、24、36、48、72 h 时神经导管拉伸强度逐渐增大，最大拉力分别为（1.17±0.14）、（1.28±0.17）、（2.05±0.16）、（3.10±0.35）、（3.31±0.29）N，48 h 时较 12～36 h 时显著增大，差异有统计学意义（P<0.05）；与 72 h 比较差异无统计学意义（P>0.05）。离子相变 48 h 的神经导管断裂时伸长率可达 260%，样品拉力-伸长率曲线见图 1c。

上述结果证明，48 h 为合适的离子相变时间，此时导管形态稳定，力学强度高。因此，后续实验采用离子相变 48 h 的神经导管进行观察。

2.3. 微观结构观察

扫描电镜观察显示，神经导管内径约 1 mm、外径约 4 mm。管壁具有丰富且均匀的多孔结构，孔径为 10～100 μm；内层也为多孔结构，与管壁相比较为致密，孔径更小（10～40 μm）。见图 1d、e。

2.4. 体外酶降解性能测试

未经离子相变的神经导管在 14 d 内快速降解，完全降解成小碎片。离子相变 48 h 的神经导管在 14 d 内降解率约为 77%，28 d 时约为 86%，扫描电镜观察示降解 28 d 时其表面出现大量疏松碎片，为溶菌酶降解壳聚糖后得到的降解产物。见图 1f、g。

2.5. 细胞相容性观察

培养 5 d 后，扫描电镜下见细胞能黏附在神经导管内壁，相互融合形成细胞单层，细胞呈短梭状和圆形。细胞有大量伪足扩展，细胞之间相互联系。死/活细胞染色显示，细胞具有高活力，均匀分布于神经导管内壁。见图 h、i。

2.6. 动物体内修复效果

2.6.1. CMAP 检测

术后 8 周，实验组、对照组 CMAP 分别为（3.5±0.9）、（4.3±1.1）m/V，均显著低于健侧 CMAP（45.6±5.6）m/V，差异有统计学意义（P<0.05）；实验组及对照组间比较，差异无统计学意义（P>0.05）。

2.6.2. 大体观察

术后 8 周，对照组自体神经吻合口膨胀程度较轻、神经较粗。实验组再生神经已完全桥接神经缺损段，未与周围组织和神经导管产生粘连，同时神经导管未出现塌陷、压扁等情况。见图 2a。

图 2.

Observation of rats at 8 weeks after operation

术后 8 周两组观察

上排为实验组，下排为对照组　a. 再生神经大体观察；b. 再生神经甲苯胺蓝染色（×100）；c. 腓肠肌 HE 染色（×200）

The experimental group in the upper row and the control group in the lower row　a. Gross observation of the regenerated nerves; b. Toluidine blue staining images of the regenerated nerves (×100); c. HE staining images of the gastrocnemius muscle (×200)

2.6.3. 组织学观察

甲苯胺蓝染色：实验组再生神经纤维均一有序，再生神经轴突直径、神经纤维数量以及髓鞘厚度与对照组自体神经相似。见图 2b。

HE 染色：两组均出现由于神经损伤引起的肌纤维组织萎缩与混乱，肌纤维呈束状整齐排布，为多核多边形，细胞核位于周边接近肌浆膜的位置，组织间隙内未见炎性细胞浸润。实验组与对照组的腓肠肌组织形态无明显差异。见图 2c。

3. 讨论

壳聚糖材料具有良好的生物学特性、稳定性和可加工性^[11-12]，尤其是具有优良的神经保护特性^[13-15]，在神经组织修复方面获得了广泛应用，目前也取得了一定研究进展^[16-17]。然而，单纯壳聚糖材料存在力学强度差、降解速率过快等缺点^{[11, 12]}，临床应用中可能存在管壁塌陷，进而导致修复失败，因此近年来学者们采取了多种方法弥补壳聚糖材料的上述缺陷。

陆江等^[18]制备了胶原/壳聚糖复合支架，采用 1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）-碳化二亚胺对其进行交联，显著提高了支架机械强度，大幅延长了支架降解时间。然而，化学交联剂存在潜在毒性，体内安全性未经系统评价，因此在产品转化上受到一定限制。Baniasadi 等^[19]将导电聚苯胺/石墨烯纳米材料与壳聚糖/明胶水凝胶相复合，制备了多孔导电壳聚糖凝胶支架，复合后提高了支架的电学传导和力学性能，延长了支架的降解时间。刘奔等^[20]将聚己内酯与壳聚糖复合制备神经导管，并修复大鼠坐骨神经缺损。结果显示，与单纯壳聚糖组相比，复合材料组大鼠神经功能恢复速度更快，提示将聚己内酯与壳聚糖复合后可提高力学强度、调控降解速度。但是，复合力学强度较高的合成高分子材料能够有效提高壳聚糖的机械强度和抗降解性，然而多种成分的组合会使导管材料局部不均匀，植入体内后各成分间存在降解速率不一致的问题，可能导致导管应力集中和局部塌陷，以致修复失败。

为避免上述方法存在的问题，我们采用了单一温敏性壳聚糖材料，通过离子增强方式提高壳聚糖神经导管的力学性能和抗降解性。我们前期研究表明，壳聚糖体系中存在盐离子情况下，离子会与壳聚糖高分子竞争结合水分子，使得壳聚糖的结合水减少，疏水作用增强，促进其溶胶-凝胶转变^[9]。本次研究中，我们将壳聚糖离子特异性效应应用到神经导管的制备。随着离子相变时间的逐渐延长，壳聚糖溶胶-凝胶相转变程度逐渐增大。12～48 h 虽然神经导管形态无明显改变，但是壳聚糖分子疏水作用仍然继续增强，表现为力学强度逐渐提高。至 48 h 时，壳聚糖分子-盐离子-结合水之间达到一个平衡稳态，此时导管具有良好弹性张力。继续延长离子相变时间，神经导管力学强度无明显改变。同时，由于相变后的神经导管具有更紧密结构，所以其降解速率与未经离子相变的神经导管相比大幅降低，为体内神经修复提供有效力学支撑。与前期报道的增强方法相比，本研究采用的离子相变法未添加任何毒性试剂，成分单一，步骤简便，不仅有效地改善了壳聚糖材料的缺陷，而且有利于壳聚糖神经导管的产品转化。

本研究制备的壳聚糖神经导管另一大优点为管壁与内层具有丰富、均匀的微米孔结构。一方面，该多孔结构有利于神经损伤修复过程中营养物质和氧气的交换，更好地促进神经再生和功能修复^[21-22]；另一方面，内表面的微米孔孔径与细胞尺寸相当，有利于雪旺细胞黏附和增殖。雪旺细胞在神经导管内层融合，能为受损神经铺路，引导神经细胞再生方向，促进神经组织再生与功能重建。同时，壳聚糖分子中仍保留一定比例的氨基，其表面带有一定正电荷^[9]，因此可以吸附表面带负电荷的神经细胞，促进细胞黏附。

体内修复结果表明，神经导管可有效促进大鼠坐骨神经再生、髓鞘结构和腓肠肌恢复。术后 8 周时，实验组及对照组电生理性能恢复水平相当，初步显示该神经导管对于神经功能恢复有效，但与“金标准”自体神经修复的远期有效性比较以及对于长段神经缺损的修复效果，均有待进一步研究。

综上述，利用壳聚糖离子特异性效应，仅通过离子相变作用，可有效提高神经导管力学强度，延长降解时间。该方法未添加任何毒性试剂，成分单一，步骤简便，有利于壳聚糖神经导管的产品转化。同时，制备的神经导管具有良好物理化学性质和细胞相容性，可促进大鼠坐骨神经再生，有望用于周围神经缺损修复和组织工程神经制备。

作者贡献：魏长征负责整体科研设计，材料制备方案设计，动物实验设计与评价，部分文章撰写；杨小元负责具体实验工作，包括神经导管的制备和体外性能测试；王晓彤负责细胞实验、数据整理和部分文章撰写。

利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。

机构伦理问题：实验动物使用许可证号 SYXK（鄂）2018-0101。

Funding Statement

上海市科学技术委员会资助项目（16441907000）

Science and Technology Commission of Shanghai Municipality (16441907000)