BMP-2 明胶/壳聚糖水凝胶缓释系统复合羟基磷灰石/二氧化锆泡沫陶瓷与诱导多能干细胞来源 MSCs 的体外研究

Abstract

Objective

To construct bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) gelatin/chitosan hydrogel sustained-release system, co-implant with induced pluripotent stem cells (iPS) derived mesenchymal stem cells (MSCs) to hydroxyapatite (HA)/zirconium dioxide (ZrO₂) bio porous ceramic foam, co-culture in vitro, and to explore the effect of sustained-release system on osteogenic differentiation of iPS-MSCs.

Methods

BMP-2 gelatin/chitosan hydrogel microspheres were prepared by water-in-oil solution. Drug encapsulation efficiency, drug loading, and in vitro sustained release rate of the microspheres were tested. HA/ZrO₂ bio porous ceramic foam composite iPS-MSCs and BMP-2 gelatin/chitosan hydrogel sustained release system co-culture system was established as experimental group, and cell scaffold complex without BMP-2 composite gelatin/chitosan hydrogel sustained release system as control group. After 3, 7, 10, and 14 days of co-culture in the two groups, ALP secretion of cells was detected; gene expression levels of core binding factor alpha 1 (Cbfa1), collagen type Ⅰ, and Osterix (OSX) were detected by RT-PCR; the expression of collagen type Ⅰ was observed by immunohistochemical staining at 14 days of culture; and cell creep and adhesion were observed by scanning electron microscopy.

Results

BMP-2 gelatin/chitosan hydrogel sustained-release system had better drug encapsulation efficiency and drug loading, and could prolong the activity time of BMP-2. The secretion of ALP and the relative expression of Cbfa1, collagen type Ⅰ, and OSX genes in the experimental group were significantly higher than those in the control group at different time points in the in vitro co-culture system (P<0.05). Immunohistochemical staining showed that the amount of fluorescence in the experimental group was significantly more than that in the control group, i.e. the expression level of collagen type Ⅰ was higher than that in the control group. The cells could be more evenly distributed on the materials, and the cell morphology was good. Scanning electron microscopy showed that the sustained-release system could adhere to cells well.

Conclusion

iPS-MSCs have the ability of osteogenic differentiation, which is significantly enhanced by BMP-2 gelatin/chitosan hydrogel sustained-release system. The combination of iPS-MSCs and sustained-release system can adhere to the materials well, and the cell activity is better.

大段骨缺损修复一直是骨科临床难题之一。组织工程骨理念的提出，为骨缺损修复提供了新思路和新途径。组织工程骨是由种子细胞、支架、生物活性物质等组成，通过这些物质的相互调控，可促进骨组织愈合。羟基磷灰石（hydroxyapatite，HA）/二氧化锆（ZrO₂）生物活性、抗压强度等经深入研究，被认为可以作为组织工程骨支架材料。BMSCs 具有增殖分化、免疫调节、扩增方便等优点，但有限的增殖能力、长期培养细胞活力易丧失等因素限制了其发展^[1]。诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPS）表现出无限增长和分化能力^[2]，但其临床使用的安全性及其衍生物尚未完全阐明^[3-4]。近年有研究报道采用 iPS 来源 MSCs（iPS-MSCs）靶向骨和/或软骨修复^[5-9]，故本实验采用 iPS-MSCs 作为种子细胞。BMP 可诱导动物或人 BMSCs 分化为骨、软骨、韧带、肌腱和神经组织，且 BMP-2 可增强骨缺损愈合过程中 BMSCs 成骨分化能力^[10-11]。但 BMP-2 循环半衰期相当短，如果通过静脉注射使用，血液中的酶很容易使 BMP-2 失活^[12-13]；另一个缺点是静脉注射 BMP-2 可能产生爆发效应，导致软组织血肿和骨吸收现象^[14]。而壳聚糖的递送系统能够使 BMP-2 在特定位置持续释放^[15]。故本实验采用 BMP-2 明胶/壳聚糖水凝胶缓释系统复合种植人 iPS-MSCs ，与 HA/ZrO₂ 多孔生物泡沫陶瓷材料体外共培养，探索缓释系统对 iPS-MSCs 成骨分化作用，并观察 iPS-MSCs 在HA/ZrO₂ 多孔生物泡沫陶瓷材料上的黏附及活性，为后期体内研究奠定理论基础。

1. 材料与方法

1.1. 主要材料、试剂及仪器

β-甘油磷酸钠（北京索莱宝科技有限公司）；ALP 试剂盒、一抗、FITC 标记二抗、Hoechst（碧云天生物技术公司）；RPMI1640 完全培养基、壳聚糖粉末、BMP-2（Sigma 公司，美国）；iPS-MSCs（本课题组黄小龙提供）；明胶粉末、氯仿、异丙醇、无水乙醇、乙酸异戊酯（上海国药集团）；HA/ZrO₂ 多孔生物泡沫陶瓷材料（上海大学材料学院）；Trizol（Invitrogen 公司，美国）；DEPC 处理水、2.5% 戊二醛（上海诺辰生物技术有限公司）；SYBR Green PCR 试剂盒、逆转录试剂盒（Thermo 公司，美国）；4% 多聚甲醛（上海润捷化学试剂有限公司）；5%FBS（HyClone 公司，美国）。

低温冷冻离心机（Sigma 公司，美国）；倒置显微镜、荧光显微镜（Leica 公司，德国）；酶联免疫测试仪（Thermo Scientific Varioskan Flash 公司，美国）；ABI-7500 RT-PCR 仪（Thermo Fisher 公司，美国）；S4800 扫描电镜（日立公司，日本）。

1.2. BMP-2 明胶/壳聚糖水凝胶缓释系统构建及观测

1.2.1. BMP-2 明胶/壳聚糖水凝胶微球构建

采用油包水相溶液法制备 BMP-2 明胶/壳聚糖水凝胶微球。具体方法：① 取 1 g 明胶粉末于 50°C 溶解于 10 mL 去离子水，500 r/min 磁力搅拌下将其逐滴加入预加热至 50°C 的 60 mL 橄榄油中，持续搅拌下乳化 10 min；乳化液在搅拌中逐渐冷却至 4°C，形成固态微球，时间约 40 min。4°C 丙酮和乙醇分别漂洗 3 次，得到明胶微球，冻干。② 将制备的冻干明胶微球分散加入制备好的含 50 mmol/L 乙二醛的乙醇溶液中，室温 500 r/min 磁力搅拌 10 h，离心沉淀，将沉淀用乙醇洗涤 2 次，冻干；再用 100 µm 和 50 µm 滤网过滤，得到明胶微球。③ 将壳聚糖粉末溶于 0.75%（V/V）乙酸水溶液中制得 1.5%（W/V）壳聚糖溶液，待完全溶解后用 0.45 µm 滤膜过滤，4°C 保存。将 β-甘油磷酸钠溶于去离子水得到 50%（W/V）β-甘油磷酸钠溶液，0.22 µm 滤膜过滤，4°C 保存。④ 将上述明胶微球加入 50 mL 1.5%（W/V）壳聚糖溶液中，调节 pH 值至 6.3；再将溶解后的 BMP-2 加入 50 mL 1.5%（W/V）壳聚糖溶液中，将 50%（W/V）β-甘油磷酸钠溶液在 500 r/min 磁力搅拌下逐滴加入 50 mL 1.5%（W/V）壳聚糖溶液中，使最后溶液含 β-甘油磷酸钠溶度为 88 mmol/L，pH 值约 7.2。将 BMP-2 明胶/壳聚糖水凝胶微球在 37°C 孵育 3 h。以上步骤均在无菌条件下进行。

1.2.2. BMP-2 明胶/壳聚糖水凝胶微球药物包封率、载药率和体外缓释速率检测

采用 ELISA 试剂盒法检测，具体方法：取 5 mL 试管 3 支，每支试管中置入 150 mg BMP-2 明胶/壳聚糖水凝胶微球，各加 PBS（pH7.2）2 mL，37℃ 水浴振荡；分别于 6 h、12 h 及 1、2、3、6、9、12、15 d，每支试管各取上清液 100 µL，测定波长 450 nm 及校准 570 nm 处的吸光度（A）值，根据标准曲线方程计算上清液中 BMP-2 浓度，从而计算出上清液中 BMP-2 含量。按以下公式计算各指标：① 药物包封率=（BMP-2 总含量−上清液 BMP-2 含量）/BMP-2 总含量×100%；② 载药率=（BMP-2 总含量−上清液 BMP-2 含量）/微球总质量（150 mg）×100%；③ 体外缓释速率=上清液 BMP-2 含量/BMP-2 总含量×100%，并绘制 BMP-2 明胶/壳聚糖水凝胶微球累积释放曲线。

1.2.3. BMP-2 明胶/壳聚糖水凝胶微球形态观察

将 BMP-2 明胶/壳聚糖水凝胶微球裁剪成 3 mm×1 mm 大小，固定于样本台，扫描电镜观察微球表面结构。

1.3. 支架材料-微球-细胞共培养体系的建立及相关观测

1.3.1. 共培养体系的建立

将 HA/ZrO₂ 多孔生物泡沫陶瓷材料高温灭菌后，用无菌 0.01%（W/V）多聚赖氨酸浸泡过夜，无菌条件下晾干，然后放入培养皿并用 RPMI1640 完全培养基浸润。在培养皿底部放置磁铁，将纯化后的 iPS-MSCs 和 BMP-2 明胶/壳聚糖水凝胶缓释系统制成悬浮液，然后逐滴缓慢滴至 HA/ZrO₂ 多孔生物泡沫陶瓷材料上。RPMI1640 完全培养基培养，置于 37℃、5%CO₂ 培养箱内液面下培养 2 周，细胞融合后改为气−液界面培养 10 d，作为实验组。另外，同上法将 HA/ZrO₂ 多孔生物泡沫陶瓷材料仅和纯化后的 iPS-MSCs 共培养，作为对照组。

1.3.2. ALP 分泌量检测

两组共培养体系体外培养 3、7、10、14 d，采用 ALP 检测试剂盒检测 ALP 分泌量。

1.3.3. RT-PCR 检测

两组共培养体系体外培养 3、7、10、14 d，按 miRNA 试剂盒说明书进行操作。RT-PCR 扩增程序：热变性 95℃、10 min；扩增 95℃、20 s，62℃、30 s，72℃、30 s；40 个循环。数据采用仪器自带软件分析 ABI Prism 7500 SDS Software 分析，采用 2^–ΔΔCt法计算目的基因［核心结合因子 α1（core binding factor α1，Cbfa1）、Ⅰ型胶原、锌指结构转录因子（Osterix，OSX）］相对表达量。目的基因引物序列见表 1。

表 1.

Primer sequence of genes

RT-PCR 检测目的基因引物序列

基因 Gene	引物序列 Primer sequence
Cbfa1	上游 AGACCAGCAGCACTCCAT Upstream
	下游 TTCCATCAGCGTCAACAC Downstream
Ⅰ型胶原 Collagen type Ⅰ	上游 AAGGTGTTGTGCGATGACG Upstream
	下游 TGGTCGGTGGGTGACTCTG Downstream
OSX	上游 GGTATGCCATTGGTCTTG Upstream
	下游 CCACCCAGTTATTGTTGC Downstream
GAPDH	上游 AGAAGGCTGGGGCTCATTTG Upstream
	下游 AGGGGCCATCCACAGTCTTC Downstream

1.3.4. 免疫组织化学染色检测Ⅰ型胶原表达

两组共培养体系体外培养 14 d 取出，PBS 漂洗 1 次，4% 多聚甲醛固定 15～30 min，再用 PBS 漂洗 3 min×2 次；3.5%FBS 室温下封闭 15 min，不洗；一抗Ⅰ型胶原抗体 4℃ 孵育过夜，PBS 洗 5 min×3 次；滴加二抗工作液，37℃ 孵育 1 h；室温避光孵育 Hoechst 15 min；荧光显微镜下观察。

1.3.5. 扫描电镜观察细胞爬行及黏附状态

两组共培养体系培养 14 d 后取出，4℃ 预冷 PBS 漂洗，2.5% 冷戊二醛固定 24 h；吸出固定液，PBS 漂洗，彻底除去戊二醛；梯度乙醇脱水，乙酸异戊酯置换，临界点干燥，表面喷金后扫描电镜观察。

1.4. 统计学方法

采用 SPSS19.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用采用独立样本 t 检验；检验水准 α=0.05。

2. 结果

2.1. BMP-2 明胶/壳聚糖水凝胶缓释系统相关观测

2.1.1. 药物包封率、载药率和体外缓释速率

① 药物包封率：在 1 d 内微球的药物包封率均高达 90% 以上，随时间推移药物包封率逐渐降低，但在 15 d 时仍有 44.49%±0.20%。见图 1a。② 载药率：在 1 d 内微球的载药率均达 60% 以上，随时间推移载药率缓慢下降，15 d 时仍有 29.6%±0.14%。见图 1b。③ 体外缓释速率：BMP-2 的释放表现出阶段性释放规律，前 1 d 内释放缓慢，处于适应阶段；1～6 d 表现为 rhBMP-2 爆发性释放阶段，第 6 天累积释放率达 44.27%±0.30%；之后逐渐进入 BMP-2 缓慢释放阶段（6～12 d），第 12 天时累积释放率达 53.22%±0.18%；最后进入稳定阶段（12～15 d），第 15 天时累积释放率为 55.50%±0.20%。见图 1 c。

图 1.

ELISA detection of BMP-2 gelatin/chitosan hydrogel microspheres

BMP-2 明胶/壳聚糖水凝胶微球 ELISA 检测

a. 药物包封率；b. 载药率；c. 体外缓释速率

a. Drug encapsulation efficiency; b. Drug loading; c. In vitro sustained release rate

2.1.2. BMP-2 明胶/壳聚糖水凝胶微球扫描电镜观察

扫描电镜观察示 BMP-2 明胶/壳聚糖水凝胶微球的球形良好，球形表面较光滑，其直径约为（255±26）μm。见图 2。

图 2.

Scanning electron microscopy observation of BMP-2 gelatin/chitosan hydrogel microsphere (×200)

BMP-2 明胶/壳聚糖水凝胶微球扫描电镜观察（×200）

2.2. 共培养体系相关观测

2.2.1. ALP 分泌量检测

随培养时间延长，两组 ALP 分泌量均逐渐增加；各时间点实验组 ALP 分泌量均显著高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图 3。

图 3.

Detection of ALP secretion at different time points in the two groups

两组培养各时间点 ALP 分泌量检测

2.2.2. RT-PCR 检测

随培养时间延长，对照组各目的基因相对表达量无明显变化；实验组各目的基因相对表达量均逐渐增加，其中 Cbfa1 在 3～7 d 增加明显，Ⅰ型胶原在 7～10 d 增加明显，OSX 增加趋势较均匀，10 d 后各目的基因表达增幅均降低。各时间点实验组各目的基因相对表达量均显著高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图 4。

图 4.

RT-PCR detection of relative expression of genes in the two groups at different time points

RT-PCR 检测两组培养各时间点各基因相对表达量

a. Cbfa1；b. Ⅰ型胶原；c. OSX

a. Cbfa1; b. Collagen type Ⅰ; c. OSX

2.2.3. 免疫组织化学染色检测Ⅰ型胶原表达

荧光显微镜观察示，实验组荧光数量明显多于对照组，即Ⅰ型胶原表达水平高于对照组；细胞均能较均匀地分布于材料上，细胞形态良好。见图 5。

图 5.

Immunohistochemical staining at 14 days after culture in the two groups (×200)

两组培养 14 d 免疫组织化学染色观察（×200）

从左至右依次为 Hoechst 染色、Ⅰ型胶原染色和两种染色重叠　a. 对照组；b. 实验组

From left to right for Hoechst staining, Collagen type Ⅰ staining, and merge staining, respectively　a. Control group; b. Experimental group

2.2.4. 扫描电镜观察

对照组材料表面均匀分布着 iPS-MSCs，细胞黏附良好且数量较多，可见圆球状的 iPS-MSCs 细胞核、条索样细胞树突与轴突，细胞生长正常，形态良好。实验组可见 iPS-MSCs 的细胞核与 BMP-2 明胶/壳聚糖水凝胶缓释系统中的明胶微球有效黏附在一起，细胞核旁的细小灰色部分为细胞的树突与轴突。见图 6。

图 6.

Scanning electron microscopy observation at 14 days after culture in the two groups

两组培养 14 d 扫描电镜观察

箭头示细胞核　a. 对照组（×500）；b. 实验组（×200）

Arrow indicated nuclei　a. Control group (×500); b. Experimental group (×200)

3. 讨论

ZrO₂ 作为 HA 增强体后，可获得力学性能和生物相容性俱佳的生物复合材料^[16]。由于 HA/ZrO₂ 致密体强度过大，同时也带来了应力遮蔽的问题^[17]。故将 HA/ZrO₂ 致密体制成生物多孔泡沫陶瓷材料后，不仅可调节其强度，还有利于营养物质和代谢产物在其内的运输，提供了稳定的细胞外基质沉积、储存场所，促进了 iPS-MSCs 在其内的繁殖和迁移^[18-19]。这也是 HA/ZrO₂ 生物多孔泡沫陶瓷材料的最大优势所在。

BMP 具有激活成熟成骨细胞中 ALP 活性的作用，也可作为 iPS 和 BMSCs 成骨分化的标志物^[20]。 BMP 已初步应用于脊柱外科临床^[21]。壳聚糖作为一种无毒缓释载体，其带正电荷和-NH₂ 基团的特性使其可与带负电荷的聚合物、大分子蛋白相互作用^[22]。因 BMP-2 可能会产生爆发效应，故本实验采用 BMP-2 明胶/壳聚糖水凝胶缓释系统缓解 BMP-2 的爆发效应。壳聚糖对药物的包封率和释放率受壳聚糖相对分子质量、脱乙酰度和浓度等影响，既往研究表明^[23]，利用壳聚糖承载缓释牛血清白蛋白，当壳聚糖相对分子质量从 10×10³提高到 210×10³，牛血清白蛋白的包封率提高约 2 倍，牛血清白蛋白的释放速率从 73.9% 降至 17.6%。黄鑫等^[24]采用乳化交联法制备出的 BMP-2 壳聚糖缓释微球包封率达到 85.4%±4.2%，前 10 d BMP-2 累积释药率为 62.5%±3.6%。壳聚糖作为 BMP-2 缓释系统载体的潜力有待进一步挖掘。本实验制备的 BMP-2 明胶/壳聚糖水凝胶缓释系统，在 1 d 内其包封率高达 90% 以上，随时间推移包封率逐渐降低，但 15 d 时仍有 44.49%±0.20%；1 d 内载药率达 60%，之后缓慢下降，15 d 时仍达 29.6%±0.14%；体外缓释速率得到显著控制，15 d 时为 55.50%±0.20%。壳聚糖水凝胶缓释系统可使 BMP-2 的活性延长，大大提高了 BMP-2 的生物利用度。

种子细胞必须具有较强的扩增能力，并能在支架上黏附生长。BMSCs 作为一种公认的种子细胞，不仅具有多向分化潜能，同时也是基因治疗适宜的细胞载体^[25-26]。但其获取易造成额外损伤，且增殖能力会随供体年龄的增长而下降。而胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）的获取要破坏早期的胚囊，有悖伦理道德^[27-28]。而 iPS 具有和 ESCs 类似甚至优于 ESCs 的特性，同时又不存在伦理和免疫排斥问题^[29]。考虑到直接应用 iPS 或 ESCs 可能有形成畸胎瘤的潜在风险，因此我们采用 iPS 来源的 MSCs 作为新型组织工程骨种子细胞。

本实验先将 iPS-MSCs 和 HA/ZrO₂ 共培养，再将 BMP-2 明胶/壳聚糖水凝胶缓释系统与其复合共培养，并与单纯 HA/ZrO₂ 复合 iPS-MSCs 进行比较，行 ALP 分泌量检测、RT-PCR 检测、Ⅰ型胶原免疫组织化学染色及扫描电镜观察。结果显示，实验组培养 14 d ALP 分泌量明显高于对照组，表明 BMP-2 促进了 iPS-MSCs 中 ALP 表达，增强了 iPS-MSCs 成骨分化能力^[26]。MSCs 可增殖分化为成骨细胞，具备成骨能力^[30-33]，本实验结果显示 iPS-MSCs 也具有成骨分化能力。对照组在无缓释系统的作用下，Cbfa1、Ⅰ型胶原和 OSX 基因相对表达量随时间推移无明显变化；而实验组随时间推移，各目的基因相对表达量均增加，同时Ⅰ型胶原表达也显著多于对照组，表明 BMP-2 增强了 iPS-MSCs 成骨分化潜能^[34]。扫描电镜观察可见 BMP-2 明胶/壳聚糖水凝胶缓释系统可包裹细胞；同时表面可见均匀分布的细胞，细胞与材料黏附良好，且生长正常，提示 iPS-MSCs 可在 HA/ZrO₂ 贴壁生长。故以 BMP-2 明胶/壳聚糖水凝胶缓释系统复合种植 iPS-MSCs 与 HA/ZrO₂ 多孔生物泡沫陶瓷材料，有望成为未来组织工程骨研究和应用的发展方向。

综上述，本研究结果表明，BMP-2 明胶/壳聚糖水凝胶缓释系统具有较好的药物包封率及载药率，可延长 BMP-2 活性时间，BMP-2 可促进 iPS-MSCs 成骨分化。同时 BMP-2 明胶/壳聚糖水凝胶缓释系统复合种植 iPS-MSCs 与 HA/ZrO₂ 多孔生物泡沫陶瓷材料在体外共培养后，iPS-BMSCs 黏附良好，细胞活性较好。下一步我们将对 BMP-2 明胶/壳聚糖水凝胶缓释系统复合种植 iPS-MSCs 与 HA/ZrO₂ 多孔生物泡沫陶瓷材料的体内共培养进行研究。

Funding Statement

浙江省医药卫生科技项目（2014KYA191）；浙江省重大科技专项（2014C03031）

Zhejiang Medical and Health Science and Technology Project (2014KYA191); Major Science and Technology Special Project of Zhejiang Province (2014C03031)