固有免疫系统在骨关节炎发病机制中的作用及研究进展

Abstract

Objective

To review and summarize the role and progress of innate immunity in the pathogenesis of osteoarthritis (OA).

Methods

The domestic and foreign literature in recent years was reviewed. The role of innate immune-mediated inflammation, macrophages, T cells, and complement systems in the pathogenesis of OA, potential therapeutic targets, and the latest research progress were summarized.

Results

With the deepening of research, OA is gradually considered as a low-grade inflammation, in which innate immunity plays an important role. The polarization of synovial macrophage subpopulation in OA has been studied extensively. Current data shows that the failure of transformation from M1 subtype to M2 subtype is a key link in the progression of OA. T cells and complement system are also involved in the pathological process of OA.

Conclusion

At present, the role of innate immunity in the progress of OA has been played in the spotlight, whereas the specific mechanism has not been clear. The macrophage subtype polarization is a potential therapeutic target for early prevention and treatment of OA.

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是一种以关节软骨退变为主的关节疾病，多累及膝、髋关节及远端指间关节。目前 OA 发病机制尚未明确，研究表明其与性别、肥胖、衰老、创伤等多种因素相关^[1]。世界卫生组织统计数据显示，所有关节疾病中，OA 占导致疼痛、残疾疾病首位。我国大型流行病学调查结果显示，40 岁以上人群原发性骨关节炎总体患病率为 46.3%，其中男性为 41.6%、女性为 50.4%^[2]。近年来 OA 治疗方法和手段不断改进，但仍缺乏干预性药物，绝大部分晚期患者需通过关节置换手术缓解疼痛，恢复关节功能^[3]。传统观点认为 OA 是一种非炎症性疾病^[4]，但随着研究的深入，越来越多的学者发现滑膜炎症与 OA 的发生、发展密切相关，并开始将其定义为一种低度炎症状态。该观点从免疫系统的全新视角对 OA 发病机制进行了探索，为 OA 的治疗提供了全新的潜在靶点。现对固有免疫系统在 OA 发病机制中的作用及相关研究进展进行综述，旨在为深入研究 OA 发病机制及研发干预性药物提供证据及方向。

1. 固有免疫系统与炎症

固有免疫是机体在种系发育和进化过程中形成的天然免疫防御功能，是机体对抗外来病原体的第一道屏障，同时也参与清除体内损伤、衰老细胞以及启动、效应和调节特异性免疫应答。固有免疫系统主要由屏障结构、单核巨噬细胞、自然杀伤细胞、T 细胞、补体及一系列细胞因子组成。固有免疫系统的激活依赖于免疫细胞对外来病原体及自身损伤、衰老细胞保守区域的识别；激活方式主要包括病原相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMP）和损伤相关分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMP）两种。不同的 PAMP 及 DAMP 均可被模式识别受体（pattern recognition receptor，PRR）所识别，例如 Toll 样受体（Toll like receptor，TLR）、核苷酸结合寡聚化结构域样受体（NOD like receptor，NLR）^[5]，从而激活下游炎症信号通路，引起细胞因子、趋化因子大量释放。

2. 炎症与组织损伤修复

人体内正常的组织修复过程是一个受到精密调控的过程，包括炎症启动、细胞增殖、炎症消退 3 个阶段，局部炎性反应是组织修复过程中的重要环节。该过程被比喻为“炎症交响曲”，巨噬细胞是这一过程中最关键的细胞^[6-7]。它们可以通过自动清创，即吞噬死亡细胞、失活或受损组织，加速后续修复过程。在炎症修复过程中，受损组织释放的死亡细胞碎片或者蛋白水解产物可以与细胞表面或细胞质内的各种受体（如 TLR）结合，激活下游的 NF-κB 等炎症相关信号通路^[8]，从而激活巨噬细胞发挥其生理功能。急性炎症期巨噬细胞的生理学功能为吞噬细胞碎片以及分泌炎性因子（IL-1β、IL-6、TNF-α），趋化其他细胞在损伤区域聚集^[9-10]。随着炎症进一步发展，巨噬细胞开始发挥抑制炎症、促进组织修复的生理学功能。它们分泌的 ω-3 脂肪酸可以转化为前消散分子，如消除素、保护素以及促消退介质等，起到终止炎症、保护器官、促进组织再生的作用^[10-11]。因此，创伤修复过程中炎症过程的正确转变对于促进局部炎症消除、组织再生具有重要的生理学意义。

3. 炎症消散异常与 OA

尽管 OA 未划分为炎症性关节病，但是越来越多的研究表明它是一种持续的慢性炎症状态。组织病理学研究证实，OA 组织学标本中常见炎性细胞浸润，但浸润程度未达类风湿性关节炎^[12]。此外，生物学标志物研究表明，OA 患者体液（血液、关节液）内的炎性因子，如 IL-1β、TNF-α 等，均较正常人明显上升^[13-14]。影像学检测进一步证实了低度炎症在 OA 病理生理过程中的作用。Aryal 等^[15]对 422 例 Kellgren-Lawrence 2～3 级 OA 患者行连续 12 个月的 MRI 观察，发现膝关节内侧滑膜炎症范围可以作为预测 OA 预后的指标。Daghestani 等^[16]在 OA 患者体内利用 ^99mTc-Etarfolatide 示踪显像技术标记激活巨噬细胞，发现受累膝关节的 ^99mTc-Etarfolatide 信号强度不仅与患者体液（血液、关节液）内炎症标志物 CD14、CD163 等成正相关，还与关节间隙狭窄程度明显相关。Roemer 等^[17]对 514 例正常人的膝关节进行了长达 30 个月的 MRI 研究，发现滑膜炎的累及范围与软骨退变程度成正相关。这些研究结果均表明 OA 是一个持续的慢性炎症状态。

从组织损伤修复角度来看，关节损伤后的局部愈合反应决定了 OA 的个体易感性。尽管损伤后的急性炎性反应具有保护机体的特点，但持续的慢性炎症对机体是有害的^[8]。关节一旦损伤，滑膜组织内被凝血酶激活后的血小板可以分泌含 IL-1β 的微泡^[18]，这一过程可以促使基质金属蛋白酶（metalloproteinase，MMP）的生成^[19]。MMP 既可以分解受损软骨实现“自动清创”，同时分解软骨后释放出来的组织碎片，如纤维连接蛋白^[20]、超小分子量透明质酸^[21-22]、蛋白多糖碎片^[23]，可激活固有免疫系统，诱发局部炎性反应^[24-25]。

然而在 OA 的发生发展过程中，“自动清创”诱发的局部炎性反应往往会进入一个恶性循环。研究发现，超级愈合小鼠胫骨平台骨折后，局部炎性反应激烈程度及持续时间均明显低于野生型小鼠，导致前者创伤后 OA 发生率及严重程度明显低于后者^[26-27]。这些研究结果表明，OA 组织修复过程中炎症消退期的转变失败是恶性循环持续的关键。

4. 固有免疫系统与 OA

OA 发生发展过程中，软骨细胞及细胞外基质因创伤、老化凋亡产生的各种碎片（蛋白质、蛋白多糖、透明质酸）均可成为 DAMP，进而被免疫细胞膜上的 PRR 或胞内的 NLR 识别，通过 cAMP 反应元件结合蛋白、干扰素调节因子、NF-κB 激活下游的炎症信号通路，引起炎性因子大量释放^[28-30]。

关节中的主要免疫细胞是滑膜细胞层中的 A 型滑膜细胞（巨噬细胞），研究已证实 OA 滑膜组织及软骨细胞中的 TLR2、TLR4 表达均存在上调趋势^[31-32]。尽管滑膜细胞及软骨细胞均表达 TLR，但目前研究认为 DAMP、PAMP 与滑膜巨噬细胞表面的 PRR 结合，激活炎症信号通路引起炎性因子及蛋白酶的释放，一方面可加重局部炎症，另一方面可与软骨细胞表面的 TLR 结合，激活软骨细胞 NF-κB 通路，进一步释放分解性因子，引起软骨细胞死亡及软骨基质降解，释放 DAMP，从而形成恶性循环^[33]。但软骨细胞、滑膜巨噬细胞、滑膜成纤维细胞之间的具体交叉联系机制目前尚不清楚，仍需要进行大量研究。

4.1. 巨噬细胞与 OA

巨噬细胞在固有免疫中处于中心地位，具有很强的吞噬能力，参与了炎症的启动及消退。巨噬细胞的激活主要有两种途径，其中经典激活途径为分化成 M1 亚群。巨噬细胞表面的模式识别受体（PRR）可识别关节腔中的 PAMP 及 DAMP，同时与 TLR/IL-1 受体结合，激活 NF-κB 通路上调炎性因子的释放。另一重要激活途径是通过细胞在应激情况下产生的炎症小体，与核苷酸结合寡聚化结构域样受体结合，从而诱导炎性因子的释放^[34]。巨噬细胞还可通过选择性途径激活，分化成 M2 亚群，从而表现出抑制炎症、促进组织修复的作用。激活的巨噬细胞在 IL-4 或/和 IL-13 刺激下可高表达甘露糖受体（CD206），同时 IL-4 可刺激巨噬细胞内的精氨酸向鸟氨酸转变，从而使胶原及聚胺类蛋白多糖等细胞基质成分合成增加^[35]。M2 亚群的修复功能减弱可导致组织损伤持续存在，修复功能过强可导致组织纤维化^[36]。

滑膜组织内的巨噬细胞在正常情况下处于静止状态，在关节损伤或老化应激导致细胞凋亡发生时，软骨细胞及细胞外基质崩解所产生的 DAMP 可激活巨噬细胞^[33]。激活的巨噬细胞可高表达叶酸受体，Piscaer 等^[37]使用 SPECT/CT 示踪¹¹¹InCl3 标记的叶酸受体，分别对采用碘乙酸盐注射及前交叉韧带切断方法制备的大鼠 OA 模型进行观察，结果均发现大鼠膝关节中有较强的叶酸受体信号聚集，提示了激活巨噬细胞在 OA 中的重要地位。de Visser 等^[38]利用另一种叶酸受体耦合剂进行观察，发现在高脂饮食诱导的大鼠 OA 模型中¹¹¹Incm09 信号较正常大鼠增加了 28.4%。Daghestani 等^[16]利用 SPECT/CT 观察 OA 患者体内 ^99mTc-EC20 标记的叶酸受体分布情况，发现受累膝关节 ^99mTc-EC20 信号强度与 OA 患者体液内炎性标志物及关节间隙狭窄程度相关。这一结果直接证明了激活的巨噬细胞在 OA 进展中的作用，但该研究没有明确巨噬细胞亚群的分布情况。

巨噬细胞 M1、M2 亚群的时间及空间差异性分布对炎症及组织损伤修复的精准调控发挥重要作用。M1 亚群主要参与炎症启动阶段，M2 亚群主要参与炎症消退阶段。有关超级愈合小鼠的研究发现，创伤发生后小鼠滑膜组织内激活的巨噬细胞中 M1 亚群占主导地位的现象仅维持数周，而在野生型小鼠体内该现象可持续 2 个月甚至更久^[27]。据此，学者们提出去除巨噬细胞能消除炎症，进而延缓 OA 进展的设想，并进行了大量相关研究。Wu 等^[39]构建了 CSF-1R-GFP 绿色荧光标记巨噬细胞的 MaFIA（macrophage Fas-induced apoptosis）基因工程鼠，该动物模型既可通过荧光成像观察体内巨噬细胞的分布，也可在小分子 AP20187 的诱导下促使巨噬细胞凋亡，达到去除巨噬细胞的目的。首先，利用 MaFIA 基因工程鼠构建 OA 模型，造模后即刻关节腔内注射 AP20187，去除滑膜组织内所有亚群的激活巨噬细胞。结果发现，MaFIA 基因工程鼠的巨噬细胞 M1、M2 亚群数量均少于野生型小鼠，造模 1 周后骨赘形成减少，但是造模 9 周后滑膜炎症及软骨退变更严重。这一结果表明炎症在 OA 进展中具有“双刃剑”作用，持续慢性炎症的形成可能与激活巨噬细胞的数量无关，与 M1 亚群向 M2 亚群转变失败有关。这可能是 OA 炎性反应消散失败，进入持续慢性炎症恶性循环的关键环节。近期一项研究通过免疫组织化学及免疫荧光标记 M1、M2 特异性分子标志物进行观察，结果发现人及小鼠 OA 滑膜中均以 M1 亚群聚集为主^[40]，进一步说明 M1 亚群向 M2 亚群转换失败在 OA 的病理作用。

目前，对于激活巨噬细胞诱发 OA 或加重 OA 进展的作用机制尚未明确。Bondeson 等^[41]从 OA 患者滑膜组织中提取滑膜细胞，通过流式分选技术去除 CD14 阳性的滑膜巨噬细胞后，发现成纤维样滑膜细胞分泌 IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α、MMP-1、MMP-3、ADAMTs-4，表明滑膜巨噬细胞在诱发滑膜炎症过程中有启动作用。Blom 等^[42]采用大鼠进行研究，他们首先通过关节腔注射氯膦酸盐脂质体诱导巨噬细胞凋亡以去除滑膜巨噬细胞，7 d 后通过关节腔注射Ⅱ型胶原酶构建 OA 模型；观察发现造模 7、14 d 后 OA 模型软骨退变程度较未诱导巨噬细胞凋亡的 OA 模型减轻，滑膜组织中的 MMP-3、MMP-9 表达也明显减少，但软骨组织中的 MMP-3、MMP-9 表达无明显变化。Blom 等^[43]的另一研究发现，氯膦酸盐去除巨噬细胞的小鼠 OA 模型在造模后 7、14 d 骨赘生成较对照组减少了 84%、66%，滑膜浅层 TGF-β、BMP-2、BMP-4 表达也明显降低，而骨面生长因子无明显变化。以上研究结果均提示，滑膜巨噬细胞可能通过诱导成纤维样滑膜细胞释放 MMP 及生长因子加速 OA 进展，在疾病早期针对性去除促炎作用的 M1 亚群巨噬细胞，可以延缓 OA 进展。

巨噬细胞影响 OA 发生发展的另一可能机制是通过旁分泌作用直接影响软骨细胞的合成分解代谢功能。Samavedi 等 ^[44]的研究将激活巨噬细胞与软骨细胞进行共培养，观察发现软骨细胞中 MMP-1、MMP-3、MMP-9、MMP-13 及 IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8 表达均明显增加，可能与 M1 亚群分泌的 Rspo2（R-spondin-2）蛋白激活软骨细胞的 β-catenin 通路有关^[45]。Utomo 等^[46]将含 M1、M2 亚群巨噬细胞上清液的 DMEM 条件培养基与软骨细胞进行间接共培养，结果发现 γ-IFN +TNF-α 刺激后的 M1 条件培养基可以明显上调软骨细胞 IL-β、MMP-13、ADAMTs-5 基因表达，下调 Col2A1、Aggrecan 基因表达；而 IL-10+IL-4 刺激后的 M2 条件培养基不能逆转这一现象。因此，Utomo 等认为 OA 治疗关键在于抑制促炎因子释放或者刺激抗炎巨噬细胞（M2 亚群）的分化。Dai 等^[47]的研究发现鱿鱼Ⅱ型胶原蛋白可以通过免疫调节作用激活 M2 亚群巨噬细胞，从而增加 TGF-β₁ 及 TGF-β₃ 的分泌，促进软骨修复，提示了 M2 亚群巨噬细胞作为 OA 治疗靶点的可能性。

巨噬细胞具有较强可塑性，可以根据所处微环境进行重编程，可以是启动炎症、释放大量促炎因子的 M1 亚群，也可以是抑制炎症、重塑组织、释放抗炎因子及生长因子的 M2 亚群。但随着研究的深入，学者们认为 M1、M2 亚群可能只是巨噬细胞分化的两种极端类型，可能还存在着第 3 种过渡类型。因为有研究发现即使同一种物质、同样的低氧环境，既可促使巨噬细胞向 M1 亚群分化，也可向 M2 亚群分化，导致这一差异的原因仅仅是刺激物质浓度不同^[48]。这种由一种亚群向另一种亚群转变的过程称为重编程，目前相关研究有限，发现的涉及重编程通路可能包括 JNK、PI3K/Akt、Notch、JAK/STAT、TGF-β、TLR/NF-κB，同时重编程还受到 microRNA 的调节^[49]。Topoluk 等^[50]将 OA 软骨细胞、M1/M2 亚群巨噬细胞及胎盘 MSCs 进行共培养后发现，M1/M2 比例的减少可以增加软骨细胞活性及糖胺聚糖的含量，而胎盘 MSCs 可以降低 M1/M2 比例，其作用机制可能与前列腺素 E2 有关^[51]。因此，探索合适的促使巨噬细胞 M1 亚群向 M2 亚群重编程的物质及其具体机制将有助于 OA 的早期防治。

4.2. T 细胞与 OA

现有证据表明，OA 滑膜组织（特别是炎症明显的滑膜组织）中的免疫细胞主要包括巨噬细胞、T 细胞、B 细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞等^[52]。其中，巨噬细胞占 65%、T 细胞占 22% ^[53]。Symons 等^[54]利用 ELISA 法检测 OA 关节液中的可溶性 CD4，发现 OA 患者可溶性 CD4 浓度低于类风湿性关节炎患者，但高于正常人。Hussein 等^[55]利用流式细胞技术对比 OA 与类风湿性关节炎患者滑液中 CD4⁺、CD8⁺ T 细胞的比例，发现两者 CD4⁺/CD8⁺的比例相似，且 CD4⁺ T 细胞占优势。Kriegova 等^[56]的研究也获得相同结果，同时还发现女性患者 CD4⁺ T 细胞更高。这些研究结果均说明 T 细胞与 OA 的病理过程密切相关。

T 细胞参与 OA 病理过程的机制可能与其识别软骨基质蛋白聚糖的分解产物有关。de Jong 等^[57]的研究发现，T 细胞可特异性识别蛋白聚糖 16-39、263-282 氨基酸位点，从而增加炎性因子的释放。T 细胞有多种亚群，包括 Th1、Th2、Th9、Th17、Th22、Treg 细胞等，目前研究证据提示与 OA 病理相关的细胞亚群主要为 Th1、Th9、Th17 细胞。有研究通过比较 OA 与类风湿性关节炎患者外周血、关节液、滑膜中的 Th1/Th17 细胞比例，发现 OA 患者外周血及滑膜中 Th1/Th17 细胞比例均较高，滑膜中的 Th1 细胞增多，Th17 细胞较少^[58-59]。这种循环 T 细胞的细胞毒性更大，而髌下脂肪垫中的 T 细胞同时出现了分泌表型的改变^[60]。各种亚型在 OA 中的具体激活机制尚未明确，可能与 mTOR 自噬通路、氨基酸代谢及肠道菌群有关^[61]。

4.3. 补体与 OA

补体系统由三十余种蛋白质成分构成，其激活途径包括经典激活途径、选择性激活途径及甘露糖结合蛋白激活途径，3 种途径的共同交汇点均为 C3 的激活及 C5-7 形成膜攻击复合物（membrane attack complex，MAC）^[62]。已有文献报道补体蛋白在 OA 滑膜组织及滑液中的表达量均增加，同时 MAC 含量与滑膜炎症程度成正相关^[63-64]。但软骨细胞在 IL-1β、TNF-α 的刺激下也能分泌补体蛋白。作为补体系统的交汇点，C3、C5 对于 OA 更重要。在内侧半月板切除的小鼠 OA 模型中，Wang 等^[65]发现 C5、C6 基因敲除小鼠的 OA 程度更轻；而敲除 MAC 抑制蛋白 CD59 则加重 OA 病变，而羧肽酶 B 可以减少 MAC 的形成而对软骨有保护作用。因此，明确补体系统与其他固有免疫细胞及软骨细胞之间的交互作用，定向阻断补体系统，对于有效防治 OA 进展有重要意义。

5. 诊疗进展及展望

随着对 OA 发病机制研究的深入，学者们对固有免疫系统在 OA 病理中的作用越来越重视。明确固有免疫不同细胞及成分在 OA 中的作用及其与软骨细胞之间的交互效应，有助于精准治疗 OA；对于滑膜炎症明显的亚型，已有研究开始探索给予炎性介质拮抗剂或细胞拮抗剂，从而抑制炎症级联效应。尽管目前具体机制尚未明确，但对固有免疫系统在 OA 中的作用研究为该病的诊疗提供了一个全新视角。

Funding Statement

国家自然科学基金资助项目（8170090283）；四川省科技厅资助项目（2018HH0071）

National Natural Science Foundation of China (8170090283); Funds from Science and Technology Department of Sichuan Province (2018HH0071)