生长因子控制释放对骨再生影响的研究进展

Abstract

目的

总结近年来成血管因子和成骨因子在骨组织工程缓释系统中的研究进展。

方法

广泛查阅近年来国内外关于骨再生过程中生长因子缓释系统的研究报道，并加以分析总结。

结果

缓释结构包括直接结合、微球-三维支架结构、核-壳结构、层层自组装、水凝胶及基因载体等。不同缓释结构与不同生长因子结合构成的缓释系统能促进骨再生及新生血管形成。

结论

生长因子缓释系统因具有可控性和持续性等特点，已成为骨组织工程的研究热点，具有广泛应用前景。

由外伤、肿瘤、感染和先天性畸形等引起的骨缺损，尤其是大段骨缺损的修复，是外科医生的巨大挑战。骨修复的金标准是自体骨移植，但存在骨供体有限、供体部位并发症高等限制^[1]。近年来随着组织工程快速发展，将组织工程和再生医学相结合，为重建和修复骨缺损提供了新策略。骨组织工程涉及使用不同的生化信号分子（如生长因子、药物或小分子），形成新骨并与宿主组织整合^[2]。将这些信号分子通过不同的载体，递送到缺损部位发挥生物活性促进骨组织再生，是一种有效的再生修复手段。模拟自然骨愈合过程促进骨组织再生，不应仅限于单一的生长因子，而应该根据需要调整剂量、比例、顺序来释放多种生长因子。此外，骨是高度血管化的组织，血管化不足可能干扰骨形成过程，导致骨不愈合，所以应充分考虑到血管生成同样有助于骨组织再生^[3]。因此，有学者认为成血管因子及成骨因子双重递送有助于刺激血管形成及骨形成^[4]。

迄今为止，骨组织工程研究中关于生长因子、种子细胞、载体支架的研究较多，已取得了一些成果，但用于临床尚有距离。现代组织工程骨构建的主要研究热点是控制不同生物活性的生长因子在骨愈合不同阶段发挥作用，以模仿自然骨生成过程。因此，本文就组织工程中多种生长因子的缓释系统研究进展作一综述。

1. 骨折愈合过程中的生长因子

骨折愈合过程包括 4 个连续反应步骤，即炎症期、纤维软骨形成期、骨痂形成期及重塑期^[1]。骨愈合和重塑是通过细胞、生物活性因子和细胞外基质的协调，刺激骨祖细胞增殖、分化和迁移实现的^[5]。

1.1. 成骨因子

促进骨形成的细胞因子有很多，如 BMP、PDGF、TGF-β、FGF、IGF 等^[6]。其中，BMP 是应用最广泛的成骨因子。BMP 可以诱导 MSCs 增殖、分化为软骨细胞和成骨细胞，还能诱导非骨组织来源的细胞株，如多能成纤维细胞分化为成骨细胞，从而诱导新骨形成^[7]。目前应用于临床的成骨因子主要是 BMP-2、3、4、5、7，其中研究最多的是 BMP-2 及 BMP-7，已被纳入美国食品药品监督管理局（FDA）批准的骨再生系统。BMP 除了上述作用外，有可能在血管生成中发挥作用^[8]。

1.2. 成血管因子

缺乏新生血管是骨折不愈合的主要因素之一。血管为再生骨组织提供必要的氧气、营养物质并清除废物，在血管化骨组织再生中必不可少^[2]。主要的成血管因子包括 VEGF、PDGF、FGF 和 TGF。

VEGF 是一种特异性作用于血管内皮细胞的肝素结合生长因子，是骨形成过程中血管生成的关键调节因子。目前认为，VEGF 可以通过促进内皮细胞增殖、分化及迁移，导致血管形成，并促进成骨细胞的募集和存活^[9]。VEGF 可调节软骨细胞凋亡、软骨重塑、软骨内生长板骨化和成骨细胞的迁移^[8]。VEGF 还可通过作用于成骨细胞的 flt-1 受体，增强骨祖细胞中的成骨细胞分化和矿化^[10]。

FGF 是一种有丝分裂原，不仅通过多种信号通路激活内皮细胞增殖和迁移促进血管生成^[11]，还可以调节关于成骨细胞分化和凋亡的基因表达，促进骨组织再生^[12-13]。FGF 在血管生成、伤口愈合和组织修复中起关键作用，然而由于半衰期极短，需要载体递送控制作用时间。

PDGF 主要来源于血小板，是组织损伤后早期聚集的巨噬细胞、血管内皮细胞合成的重要多肽生长因子^[14-15]。PDGF 作为一种化学诱导剂和有丝分裂原可上调 VEGF 的表达，促进血管成熟，还可以刺激成骨细胞增殖，诱导 MSCs 趋化以支持血管系统的形成^[16]。

2. 多种生长因子递送系统的必要性

骨再生是一个复杂的受多种生长因子调控的过程，血管再生是关键环节之一。有研究认为先有新生血管网络搭建，再有骨组织爬行增生，建立新生血管网络可提供必要的氧气和营养物质及发挥清除废物的功能，为新生骨组织奠定环境基础^[17]。

为了保证骨再生过程中有新生血管形成，利用血管生成因子和成骨因子的顺序递送，可使生长因子在特定部位、特定时间最大程度发挥其生物活性。骨支架中两种甚至多种生长因子的控制释放更接近骨自然愈合过程^[18]。Peng 等^[19]认为单独使用 VEGF 不足以促进骨再生，它与 BMP-4 协同作用可以增强细胞存活，增加 MSCs 募集和骨形成。

在骨组织工程中，生长因子的剂量一定要适宜，过量的 VEGF 可诱导血管形成，增加血管通透性，导致全身性低血压和水肿^[20]；过量的 BMP-2 则易导致血肿形成^[17]。Sharma 等^[21]报道相较于单独递送 VEGFA，较低比例（1∶3）的 VEGFA 和 BMP-2 联合递送，可导致体外成骨和血管生成基因的上调；而 VEGF 和 BMP-2 的比例同样影响骨形成^[22]。外来性生长因子由于半衰期短，体内扩散速度快，不能充分发挥其生物活性，还会带来不同的副作用，因此有必要设计合适的控制释放系统，能够以受控和持续的方式控制生长因子的释放速率，以实现最佳的组织再生和最小化的副作用。

3. 主要生长因子控制释放体系

近年来在骨组织工程中对生长因子控制释放的研究方面，已经开发了许多基于生物材料的递送系统，用于生长因子的时间和空间控制。常见的生长因子控制释放系统包括直接结合、微球-三维支架结构、核-壳结构、层层自组装、水凝胶及基因载体。

3.1. 直接结合

高分子材料因具有良好的生物相容性及可降解性，成为骨组织工程中常见的生长因子递送载体，包括无机材料、天然聚合物及合成聚合物。生长因子与多孔支架直接结合的方式有两种，一种是在支架制备前，将生长因子与高分子原料混合，通过气体发泡、纤维黏合、静电纺丝、相分离及溶剂熔铸等方法形成多孔支架。这种方式由于制备条件苛刻、步骤复杂，破坏了生长因子的化学结构及性能，从而影响了其生物活性^[22]。另一种是生长因子通过物理吸附作用负载到已成型的支架材料中。该方法保留了支架材料的优越性能，也未破坏生长因子的生物活性；但由于支架材料已成型，无法通过改变材料性能（如孔隙率）来控制生长因子的释放^[23]。Eğri 等^[24]通过冷冻干燥/颗粒浸出合成了聚乳酸（poly-L-lactide，PLA）-聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）-PLA 支架，BMP-2 在支架形成后被负载到基质中进行缓释，VEGF 则通过明胶溶液载于孔隙内。研究发现 VEGF 的释放较快，其中 60% 在 2 d 内释放；BMP-2 则在之后几个月中缓慢持续释放。虽然生长因子与高分子材料直接共混是最简单的方法，但由于可控性差，难以达到生长因子同时释放或连续释放的目的。因此，近年来越来越多学者将生长因子通过微球、水凝胶、层层自组装等载体负载到支架上完成控制释放。

3.2. 微球-三维支架结构

随着纳米及微米技术在医学领域的快速发展，以纳米颗粒或微球为载体，为实现多种外源性生长因子的控制释放种类提供了一种新的思路。缓释微球是指生长因子通过溶剂萃取/蒸发、沉淀、双乳液、同轴电喷雾、相分离法、化学键等作用，包埋于粒径为 10～40 μm 的高分子材料形成微球体，通常纳米颗粒直径<0.1 μm^[25]。生长因子通过扩散作用和聚合物载体的降解而释放。微球球体可以保护生长因子不受外界环境影响，保持其生物活性。Kim 等^[26]开发了壳聚糖凝胶/明胶微球双重递送系统，通过乳液法制备明胶微球，将 IGF-1 加载到明胶微球中，然后将含有 IGF-1 的明胶微球包封到含有 BMP-2 的壳聚糖凝胶中，完成了 BMP-2 早期的快速释放及 IGF 的缓慢释放。

生长因子、支架及细胞为组织工程构建三要素。组织支架一方面作为细胞载体，为细胞生长创造良好环境，另一方面为新组织的形成提供了支撑作用^[23]。将负载生长因子的微球和三维支架结合得到微球-三维支架复合体，生长因子的释放过程更加复杂，相较于直接从微球释放，还要经历从支架中扩散释放这一步。因此生长因子的释放速率、释放时间及释放位置将受载体及支架两种材料的控制。Wang 等^[18]将 BMP-2 通过化学键作用包埋到丝素蛋白（silk fibroin，SF）微球，VEGF 物理吸附在 BMP-2 修饰的 SF 微球上，再将这些复合微球加载到 SF/纳米羟基磷灰石（nano-hydroxyapatite，nHAp）支架中以实现持续释放。体外实验检测到第 1 天 VEGF 的初始释放已达到 48.7%，并且在前 10 d 内以持续释放的方式释放了 66.4%；而 BMP-2 第 1 天的初始释放仅为 6.7%，然后以缓慢释放的方式在 28 d 内释放约 15.5%。他们将 MC3T3-E1 小鼠成骨细胞接种在支架上，观察到 MC3T3-E1 细胞的附着和生长，证明负载低剂量 BMP-2 和 VEGF 的 SF 微球复合支架可促进细胞黏附和增殖。该系统模拟天然骨愈合过程，VEGF 可促进早期干细胞迁移及血管形成，BMP-2 在后期激活成骨细胞分化，VEGF 及 BMP-2 协同促进骨再生。

Bai 等^[11]用超临界 CO₂ 发泡技术生成由聚乳酸-羟基乙酸共聚物（poly actic-co-glycolic，PLGA）和 PLA 组成的复合支架，实现了 3 种生长因子的独立控制释放。为了诱导 VEGF 和 FGF-2 的快速释放和 PDGF 的缓慢释放，他们通过双乳剂蒸发技术将 VEGF 和 FGF-2 包封在 PLGA 支架中，PDGF 包封在 PLA 微球中后再包封到 PLGA 支架中。释放动力学检测显示，VEGF 和 FGF-2 的累积释放量为 11.14% 和 10.91%，PDGF 为 28.49%。VEGF、FGF-2 和 PDGF 的双重递送可显著影响人脐静脉内皮细胞从 G₁ 期向 S 期的转变，并刺激 DNA 复制，从而进一步促进细胞周期的进展和增殖。

微球-三维支架系统的提出不仅弥补了直接结合方式中生长因子容易失活的缺点，还为细胞和组织形成提供了良好的生理环境及支撑作用。理想的微球-三维支架系统需要根据再生组织的要求选择微球和支架材料，将生长因子、微球和支架进行合理组合，达到损伤部位多种生长因子不同时间持续释放的目的。该控制释放系统由于制备简便、对制备环境要求不高，因而广泛用于组织再生领域。

3.3. 核-壳结构

核-壳结构是指两种不同的材料形成核心和外壳，通过物理或化学作用连接形成复合微球。有学者提出将不同的生长因子负载到不同材料中，利用两种或多种材料不同的特点，实现对多种生长因子的控制释放^[27]。Lei 等^[28]利用改进的同轴电喷雾法制备负载 FGF 及 BMP-2 的左旋聚乳酸-PLGA 核-壳微球，通过改变核-壳材料负载的生长因子，验证了首先是来自于壳相的生长因子快速释放，随后是来自于核心的生长因子缓慢释放；此外，还可以通过改变包封材料进一步调节核-壳中生长因子的特定释放速率。具体而言，调整 PLGA 中 PLA 与聚羟基乙酸的比例，也可以影响生长因子的释放速率。同样利用核-壳结构，Wang 等^[29]的研究表明，壳相的 VEGF 在 24 h 内快速释放，随后缓慢持续释放至 28 d，而来自于核心的 BMP-2 则持续稳定释放；体内实验观察到在修复大鼠颅骨临界骨缺损中有同步血管生成和骨生成。

Chen等^[30]制备了新型藻酸盐核-壳微球，顺序释放基质细胞衍生因子 1 和 BMP-2，观察到双层核-壳微球是由几个小颗粒（内层核颗粒）和 1 个壳（外层颗粒）组成。壳层可以改变内壳颗粒的表面电荷及性质，还有利于内核的稳定。相对于单独的微球结构，核-壳微球能够负载多种生长因子并精确控制释放顺序、时间和剂量，为局部空间隔离提供了可能性，并且可以在无支架情况下填充至不规则骨缺损中，以改善骨再生^[31]。

3.4. 层层自组装

层层自组装技术由 Iler 于 1966 年首次提出；1991 年 Decher 等利用带相反电荷的聚电解质多层经过层层交替成积形成多层薄膜，并详细报道了该技术。层层自组装的制作程序简单，已知金属、玻璃等表面由于氧化和水解而在溶液中具有净负电荷，当浸入带正电荷的聚电解质，如聚二烯丙基二甲基氯化铵、聚烯丙胺盐酸盐（polyallylamine hydrochloride，PAH）或聚乙烯亚胺中，经去离子水漂洗，由于具有相反电荷的聚电解质的吸附和过度补偿，表面的净电荷变为正值，随后使用带负电荷的聚电解质溶液，如聚苯乙烯磺酸盐（polystyrene sulfonate，PSS）、聚硫酸乙烯酯或聚丙烯酸［poly（acrylic acid），PAA］进行类似过程，导致净电荷反转，从而在基底上形成双聚电解质层（双层）。薄膜类似于“储存器”，将生长因子储存其中，通过静电吸附保持其生物活性^[32-33]。

PAH 及 PSS 多层膜是应用最广泛的聚电解质体系之一。已有实验证明 PAH/PSS 多层膜分别递送 BMP-2 及 VEGF，在体外仍能保持其生物活性并刺激细胞增殖^[34-35]。Shah 等^[32]开发了一种由 PAA 及聚（b-氨基酯）-2 组成的可降解聚电解质多层，并负载不同比例的重组人 BMP-2 和重组人 VEGF₁₆₅，随着涂层的降解，未观察到两种生长因子的突释，重组人 BMP-2 稳定持续释放约 2 周，而重组人 VEGF₁₆₅ 在前 8 d 快速释放。两种生长因子的递送显著改变了微环境，形成的小梁骨与对照组相比更加连续和更快成熟。

由层层自组装制备的薄膜形貌可控，还可与其他载体复合，在组装过程中改变聚电解质多层固有性质，控制生长因子的释放行为^[36]。Gronowicz 等^[37]为更好地模拟天然骨再生过程，制备了由仿生磷酸钙层及聚-L-赖氨酸/聚-L-谷氨酸聚电解质多层膜覆盖的胶原/羟基磷灰石支架，其中 BMP-2 负载到支架中，而 FGF-2 则负载到聚电解质多层膜中。实验证明 FGF-2 首先从聚电解质多层膜中释放，在早期诱导骨祖细胞增殖，仿生磷酸钙层及聚电解质多层膜的添加则延缓了 BMP-2 的释放，与单独递送 BMP-2 的支架相比，FGF-2 及 BMP-2 的顺序递送可增加缺损区新生骨体积。

层层自组装技术可以精确控制涂层性能并获得均匀的多层结构，由于其操作简单，制备条件温和，适用于任何形状的基材，广泛应用于化学、生物及医学领域中^[36]。由于聚电解质单层厚度<1 nm，所以层层自组装技术可以纳米级控制薄膜厚度^[38]。因此，利用层层自组装技术制造的多层膜用于局部生长因子的控制释放越来越被关注。

3.5. 水凝胶

水凝胶是一种吸收水分而溶涨形成三维网状结构的高分子聚合物，该三维网状结构不溶于水，类似于天然细胞外基质，可作为载体材料被广泛应用于药物和各类细胞生长因子释放。存在于凝胶网状结构中的生长因子，随着交联键的断裂和支架水解缓慢释放出来。常用的天然高分子水凝胶包括胶原、明胶、壳聚糖、透明质酸和海藻酸盐等，以及合成高分子水凝胶聚氧乙烯等^[39]。

水凝胶常作为蛋白质释放基质，保证蛋白质在递送生长因子过程中不被巨噬细胞所吞噬^[40]。Han 等^[41]制备了具有 TGF-β₁ 和 BMP-2 的 PLGA 微球，并负载到壳聚糖-明胶水凝胶/PLGA 支架上，观察到 TGF-β₁ 在 7 d 内的释放速率显著快于 BMP-2，但 7～42 d 时 BMP-2 的释放速率显著快于 TGF-β₁。这可能是因为壳聚糖-明胶涂层延缓了 PLGA 微球的降解，所以延缓 BMP-2 的释放。Zhang 等^[42]通过超声诱导制备的 SF 水凝胶递送 VEGF₁₆₅ 和 BMP-2，以提升兔上颌窦底部成骨能力，体外实验证实两种生长因子是持续释放而不是突释，并且水凝胶的掺入不会影响生长因子的生物活性。Barati 等^[43]制备 PEG-丙交酯/乙交酯（lactide/glycolide，L/G）纳米凝胶，PEG 的亲水性维持纳米凝胶在水溶液中稳定，L 片段可控制自组装及纳米凝胶的形成，G 片段可控制纳米凝胶的降解及生长因子的释放。通过改变 PEG 的相对分子质量及 L/G 的长度，调节 BMP-2 和 VEGF 的释放动力学。实验观察到 VEGF 和 BMP-2 蛋白分别以恒定速率缓慢释放 10 d 和 21 d，显著增加纳米凝胶成骨及成血管能力。

通过物理吸附及包埋，将生长因子固定在水凝胶交联网络中，生长因子的释放速率通过水凝胶的降解速度控制，加大了对生长因子释放的精确控制。然而，由于负载量低，且在交联过程中生长因子容易被破坏而失去活性，因此近年来水凝胶多作为基质负载微球或纳米颗粒，延缓了微球或纳米颗粒的降解速率，从而控制生长因子的释放速率。

3.6. 基因载体

在骨组织工程中，为了克服单纯蛋白质治疗的缺陷，基因治疗逐渐展现出独特的优势和潜力。其中腺病毒及质粒（非病毒载体）已被用于编码生长因子基因，并证实可促进骨再生^[44]。腺病毒是一种无包膜的双链 DNA 病毒，由于其能同时表达多个基因、不与靶细胞发生基因整合，并且能将目的基因转移到静息或分裂的细胞中，因此成为目前常用的基因载体之一。Liao 等^[8]应用 BMP-6 与 VEGF 双基因的腺病毒载体转染 BMSCs 治疗股骨头缺血性坏死，将转染的 BMSCs 与仿生合成支架聚丙交酯-聚乙醇胺结合，并皮下植入裸鼠体内。4 周后，该复合支架的 VEGF 和 BMP-6 表达水平明显升高，毛细血管和骨形成率明显高于单独递送 VEGF/BMP-6 的支架组。同样是利用腺病毒为基因载体，Zhang 等^[44]研究发现，转染后 14 d 和 21 d，BMP-2 与 VEGF₁₆₅ 的成骨作用略低于单独使用 BMP-2 基因转染组，VEGF₁₆₅ 可能是 BMSCs 向成骨细胞分化的有效抑制剂。这可能与生长因子的浓度有关，两种生长因子同时作用于 BMSCs，较高浓度的生长因子可能会影响到细胞的增殖，因此有必要探索两种生长因子合适的比例。

虽然基因载体有望成为顺序生长因子传递的潜在系统，但相较于传统的支架、微球、水凝胶等系统，它仍然存在许多安全问题，例如转染早期的低表达、缺乏靶向性及表达持续时间较短等^[45]，严重限制其临床应用。

4. 问题与展望

骨愈合是涉及细胞迁移、增殖，细胞外基质产生，骨生成和血管生成的复杂过程，需要多种因素的组合来促进骨愈合。生长因子是骨组织再生修复的关键组成部分，生长因子呈现的功效取决于每种生长因子的释放时间、递送顺序和在各个阶段递送的量。因此开发多种生物分子递送系统必不可少，其中生长因子的选择、浓度、载体和释放顺序是多因子控制释放系统的重点。迄今为止，已开发了许多基于聚合物载体的控制释放系统，用于生长因子的控制递送，以促进骨再生。理想的多种生长因子控制释放系统应根据缺损组织的特点，将生长因子与载体材料以适当方式组合，持续或受控递送至缺损部位促进骨再生。然而多种生长因子的控制释放系统仍面临许多困难和挑战，例如生长因子释放的最佳浓度，载体材料机械性能的改善，控制释放系统的标准、安全性、有效性和成本效益等。为了使这种共同递送策略实现最佳临床结果，应优化控制释放系统的固有性质，以维持生长因子的持续和受控制释放，以及维持生长因子的生物活性。因此，符合临床应用的多种因子控制释放系统的研发，在骨组织再生工程中具有重要的临床意义和广阔的应用前景。