Abstract
目的
探讨载淫羊藿苷/凹凸棒石/Ⅰ型胶原/聚己内酯（icariin/ attapulgite/collagen type Ⅰ/polycaprolactone，ICA/ATP/ColⅠ/PCL）复合支架修复兔胫骨缺损的效果。
方法
利用溶液铸浇-粒子滤沥法分别构建 ICA/20%ATP/ColⅠ/PCL（支架 1）、ICA/30%ATP/ColⅠ/PCL（支架 2）、20%ATP/ColⅠ/PCL（支架 3）、30%ATP/ColⅠ/PCL（支架 4）复合支架材料，采用扫描电镜观察支架 2 交联前、后结构特征，测量支架 2、4 的表面接触角检测材料吸水性能，采用体外降解实验评价支架 2 的药物缓释效果。取 30 只雄性日本大耳白兔，体质量（2.0±0.1）kg，随机分为 A、B、C、D、E 5 组，每组 6 只；制备直径 1 cm 双侧胫骨缺损模型后，A 组不植入任何材料，B～E 组分别于骨缺损处植入支架 3、支架 4、支架 1、支架 2。术后 4、8、12 周大体观察骨缺损修复效果；行 HE、Masson 染色以及成骨特异性转录因子 RUNX2、成骨相关转录因子 Osterix（OSX）、ColⅠ、骨桥蛋白（osteopontin，OPN）抗体的免疫组织化学染色，观察不同支架材料修复骨缺损效果。
结果
扫描电镜观察示，支架 2 为多孔结构，交联前结构疏松，交联后结构致密；表面接触角检测示支架为疏水性材料，且支架 2 疏水性比支架 4 更高；药物体外缓释效果显示支架 2 上药物能微量长效释放。动物体内植入实验中，大体观察示术后 4、12 周 D、E 组缺损明显小于 A、B、C 组。HE 和 Masson 染色示，术后 4 周 A 组缺损区域充满大量结缔组织，B、C 组可见大量纤维组织，D、E 组可见少量新生骨；术后 8 周各组新生骨比 4 周时增加；术后 12 周 A 组缺损区域仍以纤维组织为主，B、C 组可见少量新生骨组织，D、E 组可见大量新生骨组织，尤以 E 组明显，且大部分支架降解。免疫组织化学染色示，术后 4 周，D、E 组新生组织中 RUNX2 和 OSX 表达明显高于其余各组，术后 8、12 周 RUNX2 表达与 4 周相比表达下降；术后 8、12 周与 4 周相比，各组 ColⅠ、OPN 表达均增加，且 D、E 组新生组织中 ColⅠ、OPN 表达明显高于其余各组。
结论
ICA/ATP/Col Ⅰ/PCL 复合支架具有良好的孔隙率和生物相容性，并具有促成骨作用，可达到良好骨再生和修复效果。
Keywords: 淫羊藿苷, 凹凸棒石, Ⅰ型胶原, 聚己内酯, 复合支架, 组织工程骨
Abstract
Objective
To investigate the effect of icarin/attapulgite/collagen type Ⅰ/polycaprolactone (ICA/ATP/Col Ⅰ/PCL) composite scaffold in repair of rabbit tibia defect.
Methods
The ICA/20%ATP/Col Ⅰ/PCL (scaffold 1), ICA/30%ATP/Col Ⅰ/PCL (scaffold 2), 20%ATP/Col Ⅰ/PCL (scaffold 3), and 30%ATP/Col Ⅰ/PCL (scaffold 4) composite scaffolds were constructed by solution casting-particle filtration method. The structure characteristics of the scaffold 2 before and after cross-linking were observed by scanning electron microscopy, and the surface contact angles of the scaffold 2 and the scaffold 4 were used to evaluate the water absorption performance of the material. The in vitro degradation test was used to evaluate the sustained-release effect of the scaffold 2. Thirty male Japanese white rabbits, weighing (2.0±0.1) kg, were randomly divided into groups A, B, C, D, and E, 6 in each group. After making a 1 cm- diameter bilateral tibial defects model, group A was the defect control group without any material implanted. Groups B, C, D, and E were implanted with scaffolds 3, 4, 1, and 2 at the defect sites, respectively. At 4, 8, and 12 weeks after operation, the repairing effects of 4 scaffolds were observed by gross observation, histological observation of HE and Masson staining, and immunohistochemical staining of osteogenic specific transcription factor (runt-related transcription factor 2, RUNX2), osteogenic related transcription factor [Osterix (OSX), Col Ⅰ, osteopontin (OPN)].
Results
Scanning electron microscopy observation showed that the scaffolds were all porous. The structure of the material was loose before and after cross-linking. The surface contact angle showed that the scaffold was hydrophobic, and the scaffold 2 was more hydrophobic than scaffold 4. The sustained-release effect in vitro showed that the drug could be released in a micro and long-term manner. In the animal implantation experiment, the gross observation showed that the defects were significantly smaller in groups D and E than in groups A, B, and C at 4 and 12 weeks after operation. HE and Masson staining showed that the defect of group A was full of connective tissue at 4 weeks after operation, a large number of fibers were seen in groups B and C, and the new bone formation was observed in groups D and E. The increase of new bone was observed in each group at 8 weeks after operation. The defect of group A was still dominated by connective tissue at 12 weeks after operation, and a small amount of new bone tissue was observed in groups B and C, and a large number of new bone tissue was observed in groups D and E, especially in group E, and most of the materials degraded. Immunohistochemical staining showed that the expressions of RUNX2 and OSX in the new tissues of groups D and E were significantly higher than those of the other groups at 4 weeks after operation. The expression of RUNX2 decreased at 8 and 12 weeks after operation. After 8 weeks and 12 weeks, the expressions of Col Ⅰand OPN increased than in 4 weeks. And the expressions of Col Ⅰ and OPN in the new tissues of groups D and E were significantly more than those of the other groups.
Conclusion
ICA/ATP/Col I/PCL composite scaffolds have good porosity and biocompatibility, can promote bone formation, and have good bone regeneration and repair effect.
Keywords: Icariin, attapulgite, collagen typeⅠ, polycaprolactone, composite scaffold, tissue engineered bone
大段骨缺损修复是临床亟待解决的问题[1]。随着组织工程技术的发展，构建具有组织诱导性的复合支架材料修复骨缺损已成为研究热点[2]。生物支架、种子细胞和生长因子是骨组织工程三要素，但生长因子存在价格高昂、提取复杂、活性不稳定的缺点[3-4]。淫羊藿是传统中草药，具有补肾健脾、祛风除湿、强筋健骨等功效，研究发现淫羊藿可作为“活性生长因子”，具有成骨效应[5-7]。淫羊藿苷（icariin，ICA）是淫羊藿主要成分，能够促进 BMSCs 成骨分化，提高 DNA 形成和骨组织蛋白质的合成[8-9]，在骨再生方面具有独特作用。凹凸棒石（attapulgite，ATP）是一种天然无机物，富含镁铝硅酸盐，具有一定黏性、可塑性、多孔道且比表面积大。本课题组前期研究构建的 ATP/Ⅰ型胶原/聚己内酯（ATP/collagen type Ⅰ/polycaprolactone，ATP/ColⅠ/PCL）复合材料具有一定促成骨性[10-11]。为进一步探索 ATP 在骨缺损修复中的成骨效应和潜在应用价值，本次实验采用溶液铸浇-粒子滤沥法制备载 ICA 的 ATP 复合支架材料，并修复兔胫骨缺损。报告如下。
1. 材料与方法
1.1. 实验动物及主要试剂、仪器
清洁级成年雄性日本大耳白兔 30 只，体质量（2.0±0.1）kg，由中国农业科学院兰州兽医研究所提供。
ICA（纯度≥98%；宝鸡晨光生物科技有限公司）；ATP（中国科学院兰州物理化学研究所）；ColⅠ（中国军事医学科学院卫生装备研究所）；PCL（Sigma-Aldrich 公司，美国）；甲苯胺蓝染色液（北京索莱宝科技有限公司）；免疫组织化学试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）；ColⅠ兔多克隆抗体、成骨相关转录因子 Osterix（OSX）兔多克隆抗体、成骨特异性转录因子 RUNX2 小鼠单克隆抗体、骨桥蛋白（osteopontin，OPN）兔多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠/兔 IgG（Abcam 公司，美国）。
冷冻干燥机（中国军事医学科学院实验仪器厂）；JSM-6701F 冷场发射型扫描电镜（JEOL 公司，日本）；OCA20 表面接触测定仪（Dapataphysics 公司，德国）；紫外分光光度计（HP 公司，美国）。
1.2. 支架制备及观测
1.2.1. 支架的制备
以 2∶3 比例称取 0.6 g PCL、0.9 g Col Ⅰ溶于 15 mL 六氟异丙醇中，制成浓度为 0.1%（W/V）的混合溶液；分别添加 0.38 g 和 0.64 g ATP 制备成 2 种混合溶液；每种混合溶液中再添加 0.028 g ICA；于磁力搅拌器搅拌过夜至均匀混合液状态。加入 2.5 g NaCl 作为致孔剂，搅拌使其均匀分散。将混合物倒入玻璃皿中不停搅拌，待六氟异丙醇挥发至混合物可塑形状态后，装入自制针筒模具中，通风橱中放置 24 h，37℃ 烘箱中烘干 24 h，除去残存的六氟异丙醇。超纯水脱盐，0.1%AgNO3 检测洗脱液至无盐析出。
将获得的 2 种支架采用 EDC 交联：用 50 mL 95% 乙醇、2.884 1 g EDC、0.865 7 g NSH 配制 EDC 交联剂，常温下将支架置于交联剂中浸泡 24 h；0.1 mol/L NaHPO4 溶液中浸泡 2 h；4 mol/L NaCl 溶液中浸泡 24 h；摇床里 ddH2O 洗 24 h 后冷冻真空干燥，制成 2 种不同 ATP 含量（质量百分比分别为 20%、30%）、含 ICA 的复合支架材料，命名为支架 1（ICA/20%ATP/ColⅠ/PCL）和支架 2（ICA/30%ATP/ColⅠ/PCL）。60Co 辐照后，常温密封保存备用。
另制备不含 ICA 的 2 种不同 ATP 含量支架材料，命名为支架 3（20%ATP/ColⅠ/PCL）和支架 4（30%ATP/ColⅠ/PCL）。除未添加 ICA 外，支架制备步骤同支架 1、2。60Co 辐照后，常温密封保存备用。
1.2.2. 扫描电镜观察
取直径 1 cm 交联前、后的支架 2 各 3 支，制样、喷金后扫描电镜观察结构特征。
1.2.3. 支架表面接触角测定
将支架 2 和支架 4 切割成直径 6 mm、高 4 mm 的圆柱体，各支架取 3 个平行样品，表面磨平。室温下，将去离子水滴于支架表面 10 s 后，用表面接触测定仪测定支架表面接触角。实验重复 4 次，取均值。
1.2.4. 药物缓释检测
① 标准曲线绘制：称取 ICA 标准品 20 mg 溶于甲醇中，三蒸水定容至 100 mL 容量瓶中，制成浓度为 200 μg/mL 的储备液；取 1 mL 储备液用甲醇成倍稀释成浓度为 3.13、6.25、12.50、25.00、50.00、100.00 μg/mL 的系列溶液，用紫外分光光度计于 270 nm 处测定吸光度（A）值，绘制标准曲线。② 支架药物缓释检测：将直径 15 mm、高 4 mm 的圆柱形支架 2 浸泡于 5 mL 0.01 mol/L PBS（pH7.4）中，置于 37℃ 恒温箱中，分别于 1、2、3、5、7、9、12、15、20 d 收集 1 mL 缓释液，–20℃ 保存待测，并补回 1 mL 0.01 mol/L PBS；待全部取样完毕后，用紫外分光光度计检测 270 nm 处各时间点待测液 A 值，根据标准曲线计算药物缓释量并绘制药物缓释曲线。
1.3. 动物体内植入实验
1.3.1. 实验分组及方法
将 30 只日本大耳白兔随机分为 A、B、C、D、E 5 组，每组 6 只。所有动物实验前禁食 12 h，经耳缘静脉注射 10% 水合氯醛（2 mL/kg）麻醉，两侧后肢剃毛、消毒，于双侧胫骨平台处纵行切开皮肤，钝性分离肌肉后充分暴露胫骨平台，利用电钻制备直径约 1 cm 骨缺损模型。A 组为缺损对照组，不植入任何材料，B～E 组分别于骨缺损处植入支架 3、支架 4、支架 1、支架 2 后，逐层缝合切口，聚维酮碘溶液消毒。术后连续 3 d 每日肌肉注射 20 万 U 青霉素防止感染，相同饲养环境下单笼饲养动物。
1.3.2. 一般情况
术后观察各组动物切口愈合状况，有无感染发生及饮食、活动状况。
1.3.3. 大体观察
术后 4、8、12 周每组取 2 只动物，采用静脉快速注射水合氯醛（2 mL/kg）方法处死，切开皮肤并分离植入材料处胫骨，肉眼观察缺损处修复效果。
1.3.4. 组织学观察
各时间点取出的胫骨切除两端多余骨组织，保留缺损处或支架植入处，置于 10% 甲醛固定，10%EDTA-Na2 脱钙 40 d。系列乙醇脱水、石蜡包埋、切片（厚 5 μm），常规 HE、Masson 染色后光镜下观察。
1.3.5. 免疫组织化学染色观察
各时间点取各组样本切片，常规脱蜡至水，柠檬酸盐缓冲液煮沸 15 min 行抗原修复；0.1%Triton-X 100 室温反应 10 min；3%H2O2 室温反应 10 min；5% 牛血清白蛋白室温反应 20 min；0.02 mol/L PBS 分别稀释小鼠单克隆抗体 RUNX2、兔多克隆抗体 OSX、兔多克隆抗体 ColⅠ、兔多克隆抗体 OPN，稀释比例均为 1∶200，滴加一抗后置湿盒 4℃ 过夜，0.02 mol/L PBS 洗 3 次，每次 5 min；0.02 mol/L PBS 稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗兔或兔抗小鼠二抗，稀释比例为 1∶50，滴加二抗后 37℃ 恒温箱中孵育 30～40 min，0.02 mol/L PBS 洗 3 次，每次 5 min；滴加链霉亲和素-生物素复合物，置 37℃ 恒温箱中反应 30～40 min，0.02 mol/L PBS 洗 3 次，每次 5 min；滴加 DAB 显色剂避光反应 3～10 min；流水冲洗 10 min；苏木素复染 2 min；1% 盐酸乙醇分化 2 s；1% 氨水返蓝；系列乙醇脱水、二甲苯透明、树脂封片。光镜下分别观察 OSX、RUNX2、ColⅠ、OPN 的表达，同时以正常骨组织作为阳性对照。
1.4. 统计学方法
采用 SPSS17.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD 法；检验水准 α=0.05。
2. 结果
2.1. 支架材料观察
4 种支架外观均呈白色柱状，直径约 1 cm，高约 5 mm。见图 1。扫描电镜观察示，支架 2 为多孔结构，交联前后孔隙直径均为 1～500 μm。交联前支架表面粗糙，结构疏松；交联后支架表面粗糙，结构致密。见图 2。表面接触角检测示，支架 4 表面接触角为（140.24±2.04）°，支架 2 为（146.75±1.58）°，差异有统计学意义（t=18.987，P=0.012）。
图 1.
Appearance of scaffold
支架外观
图 2.
Scanning electron microscopy observation of scaffold 2 (×200)
支架 2 扫描电镜观察（×200）
a. 交联前；b. 交联后
a. Before cross-linking; b. After cross-linking
支架 2 药物缓释检测显示，1～2 d 时药物释放缓慢，平均释放率为 8.23%；3 d 时药物呈快速释放且达峰值，释放率为 11.80%；4～15 d 时呈缓慢释放，平均释放率为 9.53%；15 d 后开始缓慢下降，至 20 d 时仍持续下降，平均释放率为 10.38%。见图 3。
图 3.
Detection of sustained drug release in scaffold 2
支架 2 药物缓释检测
2.2. 动物体内植入实验
2.2.1. 一般情况
各组动物术后 1 d 即恢复正常饮食，切口愈合良好，无骨折、感染、化脓现象，活动自如，均存活至实验完成。
2.2.2. 大体观察
术后 4 周，各组可见大小不等骨缺损，A、B 组缺损处呈凹陷状；C、D、E 组缺损处填充大量红色组织，未见化脓感染。术后 8 周，各组缺损面积明显缩小，B、C 组缺损面积显著小于 A 组；D、E 组支架植入处与周围组织紧密连接，缺损处填充大量白色组织，无炎性反应，E 组缺损面积略小于 D 组。术后 12 周，各组缺损面积均明显缩小，其中 B、C 组缺损面积显著小于 A 组，D、E 组小于 B、C 组，E 组明显小于 D 组。见图 4。
图 4.
Gross observation of bone defect in each group at different time points after operation
术后各时间点各组缺损处大体观察
从左至右依次为 A、B、C、D、E 组 a. 术后 4 周；b. 术后 12 周
From left to right for groups A, B, C, D, and E, respectively a. At 4 weeks after operation; b. At 12 weeks after operation
2.2.3. 组织学观察
HE 染色示，术后 4 周，A 组缺损处部分填充纤维组织；B、C、D、E 组可见部分材料被降解，未见大量炎性细胞，其中 B、C 组支架中可见部分骨细胞且有大量纤维组织长入材料中，D、E 组缺损处可见少量新生骨组织。术后 8 周，A 组缺损处可见大量纤维组织填充；B、C 组支架中可见少量新生骨组织形成；D、E 组中材料中心可见呈层状和团状的新生骨组织且部分材料被降解。术后 12 周，A 组缺损处仍以纤维组织为主，仅见少量散在新生骨组织；B、C 组材料中心可见散在的新生骨组织，较 8 周时明显增多；D、E 组材料中可见呈板层状的新生骨形成，且大部分材料已降解。见图 5。
图 5.
HE staining of bone defect in each group at different time points after operation (×40)
术后各时间点各组骨缺损处 HE 染色观察（×40）
蓝箭头示新生骨，黑箭头示支架材料，绿箭头示纤维组织 从左至右依次为 A、B、C、D、E 组 a. 术后 4 周；b. 术后 12 周
Blue arrow indicated new bone, black arrow indicated scaffold, green arrow indicated fibrous tissue From left to right for groups A, B, C, D, and E, respectively a. At 4 weeks after operation; b. At 12 weeks after operation
Masson 染色示，术后 4 周，A 组缺损处以红细胞、非炎性细胞为主；B、C 组材料中可见少量胶原纤维组织；D、E 组材料中可见少量新生骨组织。术后 8 周，A 组缺损处以非炎性细胞为主；B 组材料中可见大量胶原纤维形成；C 组材料中除大量胶原纤维外，可见少量新生骨组织；D 组材料中有连接成片状结构的新生骨组织，同时材料部分被降解；E 组材料中心可见连接成簇状的新生骨组织，且新生骨组织中心材料完全被降解。术后 12 周，A 组缺损处有大量非炎性细胞和少量胶原纤维；B 组材料中可见大量胶原纤维和少量散在的新生骨组织；C、D、E 组可见大量新生骨组织，较 8 周时明显增加，其中 D、E 组新生骨组织连接成片状，新生骨周围材料完全被降解。见图 6。
图 6.
Masson staining of bone defect in each group at different time points after operation (×40)
术后各时间点各组骨缺损处 Masson 染色观察（×40）
红箭头示新生骨与胶原纤维，黑箭头示支架材料，绿箭头示结缔组织 从左至右依次为 A、B、C、D、E 组 a. 术后 4 周；b. 术后 12 周
Red arrow indicated new bone and collagen fibrils, black arrow indicated scaffold, green arrow indicated connective tissue From left to right for groups A, B, C, D, and E, respectively a. At 4 weeks after operation; b. At 12 weeks after operation
2.2.4. 免疫组织化学染色观察
① RUNX2：术后 4 周，D、E 组骨缺损处组织中 RUNX2 表达水平明显高于 A、B、C 组，E 组表达水平高于 D 组；术后 8 周，E 组骨缺损处组织中 RUNX2 表达水平明显高于其他组，各组表达均较 4 周时显著降低；术后 12 周，D、E 组骨缺损处组织中 RUNX2 表达水平明显高于 A、B、C 组，E 组表达水平更高于 D 组，且与 8 周相比，各组表达均有所下降。见图 7。
图 7.
Immunohistochemical staining observation of RUNX2 in each group at different time points after operation (×40)
术后各时间点各组骨缺损处 RUNX2 免疫组织化学染色观察（×40）
黑箭头示支架材料，红箭头示 RUNX2 表达 从左至右依次为 A、B、C、D、E 组 a. 术后 4 周；b. 术后 12 周
Black arrow indicated scaffold, red arrow indicated RUNX2 expression From left to right for groups A, B, C, D, and E, respectively a. At 4 weeks after operation; b. At 12 weeks after operation
② OSX：术后 4、8 周，A 组骨缺损处组织中 OSX 为弱阳性表达；B~E 组新生组织中 OSX 的表达明显增强，其中 C、D、E 组 OSX 表达尤为显著。术后 12 周，各组 OSX 表达均较 4、8 周时明显降低。见图 8。
图 8.
Immunohistochemical staining observation of OSX in each group at different time points after operation (×40)
术后各时间点各组骨缺损处 OSX 免疫组织化学染色观察（×40）
黑箭头示支架材料，红箭头示 OSX 表达 从左至右依次为 A、B、C、D、E 组 a. 术后 4 周；b. 术后 12 周
Black arrow indicated scaffold, red arrow indicated OSX expression From left to right for groups A, B, C, D, and E, respectively a. At 4 weeks after operation; b. At 12 weeks after operation
③ ColⅠ：术后 4 周，A 组骨缺损处组织中 ColⅠ为弱阳性表达，以大量纤维组织为主；B、C、D、E 组骨缺损处组织中仅见少量 ColⅠ表达。术后 8 周，各组 ColⅠ表达均较 4 周时增强，其中 D、E 组明显增加。术后 12 周，B 组 ColⅠ表达显著增强，C、D 组可在新生骨边缘观察到 ColⅠ表达，E 组 ColⅠ表达明显强于其余各组。见图 9。
图 9.
Immunohistochemical staining observation of ColⅠin each group at different time points after operation (×40)
术后各时间点各组骨缺损处 ColⅠ免疫组织化学染色观察（×40）
黑箭头示支架材料，红箭头示 ColⅠ表达 从左至右依次为 A、B、C、D、E 组 a. 术后 4 周；b. 术后 12 周
Black arrow indicated scaffold, red arrow indicated Col Ⅰ expression From left to right for groups A, B, C, D, and E, respectively a. At 4 weeks after operation; b. At 12 weeks after operation
④ OPN：术后 4 周，A 组骨缺损处组织中 OPN 为弱阳性表达；B、C、D、E 组 OPN 表达显著强于 A 组。术后 8 周，B、C、D、E 组 OPN 表达增强，其中 E 组 OPN 表达最强，新生骨中有大量 OPN 沉积。术后 12 周，B 组 OPN 表达与 8 周相比明显增强，其余各组 OPN 表达强度与 8 周时相似。见图 10。
图 10.
Immunohistochemical staining observation of OPN expression in each group at different time points after operation (×40)
术后各时间点各组骨缺损处 OPN 免疫组织化学染色观察（×40）
黑箭头示支架材料，红箭头示 OPN 表达 从左至右依次为 A、B、C、D、E 组 a. 术后 4 周；b. 术后 12 周
Black arrow indicated scaffold, red arrow indicated OPN expression From left to right for groups A, B, C, D, and E, respectively a. At 4 weeks after operation; b. At 12 weeks after operation
3. 讨论
理想骨修复支架材料应具有以下几个特点[12-13]：可塑性、良好的生物相容性、适当的降解速率、一定力学强度、合适的孔隙率、促成骨性等。单一材料很难满足上述要求。寻找新的材料用于组织工程骨，是目前研究的热点和急需解决的关键问题[14-16]。
ATP 具有特殊的结构和功能，无毒，化学性能稳定，且广泛用于动物饲料中，符合生物安全性的标准和要求。因此，本课题组研究 ATP 作为组织工程材料的可行性。前期主要探索了最佳 ATP 量效组合及其功能，研究结果提示含 20% 和 30% ATP 材料具有明显促进干细胞向成骨细胞分化的作用，且在无诱导因子环境中，能促进与成骨细胞分化调控相关的关键基因 RUNX2 和 OSX 表达，同时能明显上调成骨细胞标志分子 ALP、ColⅠ和 OPN 表达[10]。动物实验结果显示，利用溶液铸浇-粒子滤沥法构建的 ATP/ColⅠ/PCL 复合支架材料，能促进骨再生和修复[11]。故我们认为 ATP 是一类较为理想的组织工程材料。
ICA 主要由黄酮类化合物、木质素及生物碱组成。研究证实，ICA 具有抗肿瘤、免疫调节以及成骨等作用，在临床上有较高的药用价值和保健价值[17]。ICA 能够促进 BMSCs 向成骨细胞分化，并抑制其向破骨细胞分化[18]。研究表明，即使在无促成骨条件下，ICA 也能够促进成骨分化相关基因的表达，明显促进骨生长和骨小梁形成，可以作为一种良好的促成骨因子[19-20]。
本实验将 ICA 和 ATP/ColⅠ/PCL 复合构建支架材料，旨在利用 ICA 和 ATP 促成骨效应作用，通过两者协同进一步加速骨缺损的再生和修复。结果表明，构建的 ICA/ATP/ColⅠ/PCL 复合支架材料具有多孔性，其孔隙直径为 1～500 μm，该孔隙有助于细胞的迁入和营养物质的交换。支架接触角检测结果显示，加或不加 ICA 的支架均为疏水性材料，加入 ICA 后的支架接触角比不加 ICA 的支架接触角更大，说明支架在遇水后不易吸水过分膨大。药物缓释检测显示，3 d 时药物释放达高峰，可能是因为支架表面药物分子率先释放；6 d 后药物释放持续上升，可能是支架在降解过程中内部的药物分子开始释放，说明药物与支架结合可以控制药物微量长效释放。HE 和 Masson 染色结果显示，与 ATP/ColⅠ/PCL 支架材料比较，ICA/ATP/ColⅠ/PCL 支架材料能明显促进骨再生和修复，分析原因是材料通过缓释 ICA 药物促进归巢干细胞或成骨细胞分化，促进了骨再生和骨修复，显著提高了 ATP 作为骨修复材料的应用价值。
RUNX2 和 OSX 是成骨细胞定向分化的关键调控蛋白，通常定位于细胞质。RUNX2 主要在细胞分化早期表达，其表达决定了干细胞向成骨细胞或软骨细胞定向分化，OSX 表达能促进细胞向成骨细胞分化[21-22]。本研究免疫组织化学染色结果显示，在植入材料早期，ICA/ATP/ColⅠ/PCL 支架材料能明显促进 RUNX2 和 OSX 的表达，其表达水平明显高于其他组，提示 ICA/ATP/ColⅠ/PCL 材料通过缓释 ICA 促进细胞 RUNX2 和 OSX 的表达，是提高新骨形成的重要因素之一。ColⅠ和 OPN 是成骨细胞和骨组织的标志物，ColⅠ是新生骨的主要成分之一，OPN 是骨钙化的重要蛋白。结果表明，在同一时间负载 ICA 的支架材料组 OPN 表达显著高于缺损对照组和无载药组，提示 ICA 能促进缺损处新生组织中 ColⅠ和 OPN 的表达，其表达水平的增加有利于骨再生。因此我们认为，本实验构建的 ICA/ATP/ColⅠ/PCL 复合支架材料能显著促进骨再生，其原因可能是：① ICA 具有促进成骨细胞分化的作用；② ATP 中存在的离子成分具有促进细胞分化的功能；③ ATP 具有比表面积大和多孔性特点，有利于细胞黏附、生长和分化；④ ICA 药效功能和 ATP 结构效应协同作用，促进成骨细胞分化和骨再生修复。但具体机制有待于本课题组后续研究证实。
综上述，ICA/ATP/ColⅠ/PCL 复合支架材料可促进兔胫骨缺损再生和修复，有望成为一种新型组织工程材料用于骨再生与修复。
作者贡献：赵红斌负责实验的科研设计；宁钰负责实验的实施、数据的收集整理及统计分析、文章撰写；秦文、任亚辉、李辰凯、陈文扬参与实验的实施。
利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。基金项目经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。
机构伦理问题：研究方案经甘肃中医药大学医学/动物实验伦理委员会批准。实验动物生产许可证号：SCXK（甘）2011-0001，使用许可证号：SYXK（甘）2011-0001。
Funding Statement
江苏省科技重点研发项目（BE2018644）
Science and Technology Key Research & Development Project of Jiangsu Province (BE2018644)
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