腱-骨结合部结构化界面修复的研究进展

Abstract

在运动系统中，腱-骨结合部在运动过程中起到抗拉伸、承载负荷的作用，因此其愈合效果在恢复关节功能方面起到至关重要的作用。腱-骨界面损伤修复过程多为瘢痕组织形成，从形态结构和生物力学强度方面难以达到理想效果。而组织工程方法能够从种子细胞、生长因子、支架材料三方面来促进腱-骨愈合效果，是腱-骨愈合发展领域的新方向。

腱-骨结合部存在天然的 4 层结构，包括肌腱组织、非钙化的纤维软骨组织、钙化的纤维软骨组织和骨组织。腱-骨愈合与多因素相关，由于软-硬组织之间界面愈合容易形成瘢痕，以及损伤造成纤维软骨区域缺乏血供及骨量丢失，最终导致腱-骨愈合缓慢且质量欠佳，同时结合部 4 层结构的重建也很困难。因此，寻找理想的腱-骨愈合方法，研究其分子生物学机制具有重要意义。目前，国内外研究主要着眼于“结构化界面修复”这一概念，修复总原则是功能性地连接软-硬组织。现回顾分析促进腱-骨愈合方法的相关研究文献，对研究进展进行归纳总结。

1. 腱-骨愈合基本过程及促进愈合的原则

正常腱-骨连接位点分为非直接连接及直接连接两类。非直接连接为致密的纤维组织将移植物包绕连接并固定于骨面，如前交叉韧带重建术中韧带和骨道壁的连接。直接连接的连接点为一个直接嵌入的天然转化区域，重新建立直接连接要经历 Sharpey 样纤维形成过程，即新生骨小梁生成、成纤维细胞富集、软骨样细胞富集、胶原纤维成熟 4 个阶段，最终通过 Sharpey 样纤维的演变形成典型的 腱-骨结合部 4 层结构。

为兼顾两种连接类型愈合方式，目前促进腱-骨结合部愈合方法的基本原则包括两点：① 改良肌腱或韧带重建术及固定方式，获得最大腱-骨接触面积、足够的稳定接触时间、合适的接触程度和最小的外力影响^[1]。② 选择合适的支架材料，以更好地模拟腱-骨结合部 4 层结构，同时通过增加种子细胞、生长因子等增强材料生物学性能，更好地促进腱-骨愈合。

2. 促进腱-骨愈合的常用方法

从生物力学角度分析，采用组织工程方法促进腱-骨愈合面临 3 个挑战^[2]。首先，腱-骨界面愈合过程中必须保持稳定；第二，愈合过程中需诱导生成具有梯度结构的组织；第三，支架材料不仅能富集多种细胞，而且在富集细胞过程中能持续保持具有梯度的生物力学结构。一个成熟的促进腱-骨愈合方案需要设计梯度化结构，以满足自然过渡界面的时空特点，以及选择合适的种子细胞、生长因子^[3]。

2.1. 种子细胞

MSCs 常作为种子细胞来促进腱-骨愈合，其具有高度多向分化潜能，存在于全身器官间质和结缔组织中。研究最常用的 MSCs 包括 BMSCs、脂肪来源间充质干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）、肌腱来源间充质干细胞 （tendon-derived stem cells，TDSCs）等。Zhang 等^[4]研究发现，TDSCs 分泌的细胞外基质成分可促进细胞成肌腱分化。研究表明，创伤后肌腱的退行性变与 TDSCs 增殖增强以及分化被抑制、原平衡被打破有关^[5]。Nourissat 等^[6]将 BMSCs 注射至跟腱止点损伤模型大鼠的跟腱损伤处，45 d 后发现腱-骨界面出现了类似正常连接界面的钙化及未钙化的纤维软骨典型 4 层结构。有研究对采用肩关节镜修复肩袖损伤患者注射浓缩自体 BMSCs，经过 24 个月随访，超声和 MRI 检查显示 BMSCs 注射组治愈率（100%）明显高于对照组（67%）^[7]。除 BMSCs 外，ADSCs 也是较常用的种子细胞，可通过微创吸脂术获得的脂肪组织分离培养，该细胞能释放免疫抑制因子，植入体内后不会引起强烈的免疫排斥反应。Ko 等^[8]研究了 ADSCs 在兔肩袖慢性损伤模型中促进腱-骨愈合的作用，组织学观察见 ADSCs 注射组脂肪浸润程度明显轻于对照组。此外，胎儿羊膜细胞因低免疫原性、良好抗菌性能和促进血管生成能力，也作为种子细胞应用于组织工程肌腱领域^[9]。

2.2. 支架材料

支架材料根据来源可分为生物衍生支架材料、无机物支架材料和有机合成支架材料 3 类。

2.2.1. 生物衍生支架材料

生物衍生支架材料按来源可分为自体、同种异体和异种支架。生物衍生支架材料的天然来源决定了其具有良好生物学特性，对细胞降解、组织重塑和信息传递敏感；但因后期加工困难、存在免疫原性以及生物力学性能欠佳，逐渐被新型材料取代。Breidenbach 等^[10]根据组织工程技术原理，设计了模仿正常肌腱生物学参数且具有适当机械性能的支架材料，他们将细胞表观遗传学、细胞外基质组成及组织超微结构作为参考依据，最终制成可释放潜在成骨蛋白的支架材料用于促进腱-骨愈合。Kiliçoğlu 等^[11]的研究选取脱细胞去矿物质骨基质作为支架材料，利用其可释放潜在成骨蛋白的功能促进腱-骨愈合。Chen 等^[12]的研究表明，采用丝素蛋白复合胶原纤维制成的支架材料，能够提高 MSCs 中 Epha4 和 Scleraxis 基因的表达，从而促进细胞在支架材料上的黏附，达到更好修复跟腱损伤的效果。脱细胞肌腱是与正常肌腱组织结构最相似的支架材料，作为肌腱替代物已广泛用于临床治疗和基础研究。Wang 等^[13]总结了脱细胞肌腱的不同处理方式，作为支架材料其免疫原性是需要解决的最大问题；另外，脱细胞降解过程中所产生的抗体将随着血液循环分布到身体各处，产生的影响有待进一步评估。

2.2.2. 无机物支架材料

无机物支架材料以磷酸钙或磷酸镁类为主，主要作用为促进腱-骨愈合过程中的骨化。研究表明^[14]，磷酸钙有促进骨长入肌腱表面的作用，目前已广泛用于促进腱-骨愈合及组织工程其他成骨相关领域。 Weimin 等^[15]制备了可注射的磷酸钙骨水泥，该材料具有良好的孔隙结构，可更好地促进成骨，从而促进前交叉韧带重建术后腱-骨愈合。Zhao 等^[16]比较了磷酸钙黏合材料及羟基磷灰石材料，发现两种材料均可促进细胞黏附、增殖以及新骨生成，但磷酸钙黏合材料促进生长因子分泌的作用更明显，从而可更大程度促进腱-骨愈合。同时，Weimin 等^[15]研究了可注射型磷酸钙黏合材料复合 BMP-2 促进兔前交叉韧带愈合效果，结果显示该材料具有更好的骨整合效果，重建的前交叉韧带抗牵拉强度也更大。无机物支架材料有容易合成和塑形的优点，但也存在免疫原性大，可能引起免疫排斥反应，以及不能达到理想的生物力学强度等不足。

2.2.3. 有机合成支架材料

有机合成支架材料包括不可降解高分子聚合物材料及生物可降解材料。前者如聚氨基甲酸乙酯、聚碳酸酯和聚四氟乙烯等，该材料优点是具有良好的可塑性及抗牵拉强度，可保持长时间不降解；缺点是易碎裂，而且碎片作为代谢物在组织中持续存在，常影响组织的愈合并成为持续的感染源。而生物可降解材料能在降解时维持一定程度生物力学强度，从而为组织细胞提供生物相容性良好的支架。该类材料包括聚乳酸-羟基乙酸（poly lactic-co-glycolic acid，PLGA）、左旋聚乳酸、聚乙酸内酯（polycaprolactone，PCL）等^[17]。研究表明^[18-19]有机合成支架材料来源广，植入较容易，能增加细胞黏附性，促进细胞外基质产生，但往往生物力学性能欠佳且生产成本也较高。

Liu 等^[20]采用静电纺丝技术将 PLGA 和 PCL 制成具有梯度浓度的支架材料，研究表明该支架材料能很好地创建腱-骨界面微环境并重建腱-骨界面。静电纺丝技术为构建有机合成材料的超微结构提供了技术支持。Naghashzargar 等^[21]制作了一种新型支架材料，该材料以蚕丝蛋白为内核，采用静电纺丝技术将 P3HB 和 PCL 纤维包绕在蚕丝蛋白表面。结果表明该材料抗拉伸性能强，其生物力学强度能满足前交叉韧带重建的力学性能要求。Yokoya 等^[22]将聚乙醇酸薄片用于治疗兔肩袖损伤模型，结果显示可产生重建纤维软骨层界面愈合的类似效果。综上，这类有机合成支架材料作为移植物和骨之间的媒介，可促进细胞迁移和增殖，从而在腱-骨愈合处形成一个富含种子细胞及自体功能细胞的活性区域，最终达到促进腱-骨愈合效果。

2.2.4. 梯度仿生材料

传统支架材料均有一定局限性，需要对其结构、表型等方面进行改进，以更好地促进腱-骨愈合。骨组织坚硬，而肌腱组织坚韧且可延展性强，因此腱-骨界面压力必须通过两种刚度不同的材料来进行传导，这样的结构特性增加了不愈合发生风险^[23-24]。要解决此问题，需要在结构和组分两方面模拟梯度浓度进行改进，以更好地模拟过渡区域的机械性能以及分散集中的应力^[25]。理想的支架材料必须能支持细胞表型表达，同时在成分组成和微观结构方面能模拟正常界面形态^[26-27]。既往研究显示，增加矿物质能使界面处材料呈近似指数增长过程，能够更好地促进腱-骨愈合^[20-31]。目前，微系统的出现为解决浓度梯度难题提供了支持。微系统是一项以细胞或组织为对象的微操作技术，它将高通量便于分析的结构集成于小体积芯片材料上，从而制造一个稳定、局部、可复制的分子浓度梯度微环境。而细胞的迁移、分化很大程度上依赖于生长因子分布和浓度梯度形成，因此在芯片上形成的微系统模仿器官功能可达到参数可调节性，可进行组织、器官整体模拟^[28]，被广泛应用于支架材料制作与修饰过程。

2.3. 生长因子

生长因子是一类能够调节生物体内细胞生长活动的多肽类物质。目前研究集中在诱导成骨类生长因子，主要包括 BMP、TGF、bFGF、PDGF、FGF、IGF、粒细胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF）、基质金属蛋白酶组织抑制因子（tissue inhibitors of matrix metalloproteinases，TIMP）、VEGF 等。这些生长因子通过成骨诱导作用，在早期血管生长过程中起促进作用。因此在腱-骨愈合不同阶段，针对性地加入特定生长因子，可以对腱-骨愈合起到积极作用。

诸多研究已证实重组人 BMP 在新骨形成过程中发挥重要作用^[32]。Kabuto 等^[33]制作了可持续释放 BMP-7 的明胶水凝胶薄膜，用于修复 SD 大鼠肩袖损伤模型。结果发现其能促进腱-骨结合部形成良好的软骨基质及肌腱，修复后的肩袖生物力学及组织学成熟程度，包括腱-骨成熟度评分和最大负荷拉力，均较对照组有所改善。Wang 等^[34]发现外源性 MMP-2 可激活下游 NF-κB 信号通路，从而显著提高离体培养前交叉韧带成纤维细胞愈合能力^[35]。bFGF 能刺激 MSCs 向肌腱方向的增殖和分化，从而增加了细胞外基质蛋白和胶原的表达^[36]。TGF-β 能维持肌腱祖细胞在损伤过程中的生物力学活性^[37]；能增强Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达，参与组织瘢痕形成，而且和肌腱愈合过程中的黏附性能相关^[35]。

在腱-骨愈合交界处，生长因子在空间分布上的变化间接影响了组织在空间上的组成和结构。Wang 等^[38]在含有逐渐递增浓度的 Runx-2 支架材料上接种成纤维细胞，以达到随 Runx-2 浓度增加，成骨效能逐渐增强的效果。所以，利用生化成分浓度梯度的材料来控制细胞分化，是一个很有潜力的方向，有望模拟生成类似天然结合界面的结构。

通常情况下，如果单一细胞因子作用效果不满意，可考虑联合应用细胞因子发挥协同作用，达到增加效应并且减少不良反应的效果。车伟^[39]用 BMP-2 和 VEGF₁₆₅ 共表达修饰的 BMSCs 来修复兔前交叉韧带，结果显示应用该方法能促进重建韧带血管生成和腱-骨界面骨软骨生成，从组织形态和生物力学角度达到促进腱-骨愈合的效果。杜庆钧等^[40]研究了联合应用 bFGF 和 PDGF 对兔膝前交叉韧带重建术后早期腱-骨愈合的影响，结果表明 PDGF 和 bFGF 能在腱-骨愈合早期通过增加兔腱-骨间的 MSCs 及新生血管数量，并提高腱-骨界面的最大刚度及负荷来增强腱-骨界面强度，从而促进腱-骨愈合。

2.4. 组织复合体或复合物

骨膜是一种可在骨形成和骨折愈合过程中起关键作用的组织复合体，在促进腱-骨愈合方面的临床应用较为广泛^[41-42]。它由内外两部分组成，外部纤维层细胞含量少，可起到支撑和连接作用，含有成纤维细胞、胶原和弹性纤维；而内部生发层为骨膜发挥功能活性部分，其中 MSCs 可向软骨细胞、骨细胞等分化，从而促进纤维软骨和骨形成，促进骨整合^[2]。同时，骨膜中的生长因子，如 BMP-2、TGF-β₁、IGF-1 等，可诱导软骨生成，从而促进血管生长和骨再吸收。Li 等^[43]研究了自体骨膜包裹移植物修复前交叉韧带的疗效，术后 4、12 周观察发现，新生骨组织通过纤维软骨组织与邻近骨组织相交连，形成腱-骨愈合特征性的愈合界面。力学试验也发现实验组抗拉力数值明显高于对照组，证明自体骨膜对腱-骨愈合具有积极作用。

富血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP）是一种全血衍生的组织复合物，为超生理浓度的血小板，内含的生长因子主要有 IGF-1、PDGF、FGF、VEGF 等，多种生长因子联合作用避免了单一生长因子只有一种生理效应的局限性^[44]。体外实验和动物实验研究发现，PRP 的可注射形式为干细胞增殖、分化、迁移和生长提供了三维微环境基础，且 PRP 激活后可以形成大量负载成纤维细胞和成骨细胞的纤维蛋白支架，可激活细胞内源性蛋白信号通路，从而增加细胞外基质形成所需要的胶原蛋白的合成，促进腱-骨愈合^[45-46]。马震胜等^[46]将自体肌腱联合 PRP 用于比格犬的前交叉韧带重建，实验组添加 PRP 后 4 周腱-骨界面纤维血管密集、排列有序，并有Ⅱ型胶原沉积的软骨样细胞从骨向肌腱生长。虽然体外实验及动物实验研究已证实 PRP 可促进腱-骨愈合，但临床研究得出的结论却不一致。Malavolta 等^[47]的研究比较了应用 PRP 与否对肩袖修补手术疗效的影响，结果显示除 12 个月时 PRP 组美国加州大学洛杉矶分校（UCLA）评分略高于未使用 PRP 组外，两组术后 MRI、Constant 评分、疼痛评分及术后再损伤率差异均无统计学意义，说明 PRP 并非为腱-骨愈合效果的决定性因素。故针对 PRP 效果的研究还有待进一步开展。

2.5. 物理学方法

2.5.1. 低频超声

低频超声是频率为 1.5 MHz、声强为 1～50 mW/cm²的超声。低频超声可促进骨折愈合，有文献报道，每天固定的低频超声治疗有利于骨折愈合、软骨缺损和韧带损伤修复^[48]。Walsh 等^[49]对绵羊膝关节腱-骨结合部损伤模型采用低频超声治疗，术后 26 周低频超声组较对照组具有更大的最大拉力和刚度，术后 3、6、12 周组织学观察显示低频超声组有更好的血管化程度，其机制可能与低频超声促进了腱-骨愈合过程中成骨细胞和成纤维细胞的增殖有关，而这两种细胞在骨组织重建和胶原生成中起主要作用。

2.5.2. 体外冲击波

体外冲击波是一种通过物理学机制介质（空气或气体）传导的机械性脉冲压强波，该设备将气动产生的脉冲声波转换成精确的弹道式冲击波，通过治疗探头的定位和移动，对疼痛发生较广泛的组织产生良好治疗效果。有研究表明^[50]体外冲击波能改变腱-骨界面周围的力学环境和生物学微环境，上调 VEGF、BMP、TGF-β 等生长因子的表达，这些生长因子具有增加界面血供、促进骨和胶原生长等作用，从而最终达到促进腱-骨愈合的效果。

2.5.3. 应力刺激

肌肉产生的牵拉应力能影响胶原蛋白和其他细胞外基质的合成，促进腱-骨结合部的祖细胞分化成软骨，促进其偶联，调节其发育成熟，是发育过程中形成腱-骨连接正常结构的重要因素^[51]。王蕾等^[52]通过跑台训练修复大鼠肩袖损伤，发现一定程度的应力刺激有利于腱-骨界面内血管生长及界面软骨再生，而无应力刺激的对照组骨组织则出现了骨质疏松表现，提示腱-骨界面愈合效果不佳。Thomopoulos 等^[53]研究了不同应力负荷对腱-骨愈合的影响，发现低负荷应力组软骨基质成分糖胺聚糖和Ⅰ型胶原的表达更高，抗拉强度更大，愈合更接近正常的组织形态。另有研究表明，机械牵伸增加了Ⅲ型胶原 mRNA 的表达，从而增加了细胞增殖、分化和细胞外基质的形成^[54-55]。在压力下，很多因素影响着细胞的生物学行为，其中包括机械刺激引发的细胞分化、形态学和内环境稳态方面的变化^[2]。

2.6. 相关机制研究

既往研究表明^[25]，TGF-β 信号通路在肌腱形成过程中十分必要，它参与了肌腱与纤维软骨层结合部形成过程，是参与腱-骨结合部功能单元构建的重要因子。SOX-9 是介导前体细胞转变为软骨细胞的关键因子，Scleraxis（SCX）则介导了前体细胞向肌腱组织的分化。而在未钙化的纤维软骨祖细胞研究中，SOX-5^–/–、SOX-6^–/–细胞在成软骨分化过程中被抑制，而 SCX 的表达则促进了成肌腱过程^[56]。另有研究表明，SCX/BMP-4 信号通路在骨形成和腱-骨结合部发育过程中有显著促进作用^[57]，而其他骨蛋白家族，如 BMP-2、BMP-7 也参与该过程^[58]。

进一步研究将集中在分子生物学方面，探究机械载荷对骨形成和肌腱形成的作用，包括对 TGF-β、BMP、FGF、hedgehog 家族成员的深入研究。此外，关于肌腱自然钙化机制的研究还在进行，其中两个因素可能起到关键作用，即胎球蛋白和 Na₂HPO₄ 的相关抗体。但这两个因素还未被作为一个整体进行系统研究，且体内钙化的相关机制远较体外实验复杂^[59]。

3. 展望

腱-骨愈合领域将朝着结构化、功能性组织工程的方向发展。真正的功能性组织工程研究不应只考虑其生物力学等功能指标，还应包括细胞、支架、生长因子等方面的功能指标。

目前尚未定论何种细胞（TDSCs、ADSCs、BMSCs 等）是最合适的种子细胞，何种支架（胶原衍生物、多糖、碳纤维、蚕丝蛋白等）是最合适的功能性支架材料。一方面，功能性支架材料主要优势在于贮存内源性或外源性生长因子，用来模拟腱止点末端的正常结构^[60]；另一方面，研究热点集中在包裹于支架材料中的微球和纳米球的结构，这种结构能够很好地平衡支架材料降解速率和生物活性因子释放速率之间的关系，但目前仍然难以模拟正常腱-骨结合部的浓度梯度，且生成的浓度梯度难以长期维持^[61]。从组织工程整体角度讲，既往研究表明，在结构和化学成分上，浓度梯度的变化能更好地模拟天然过渡结构，能导致种子细胞相关蛋白的不同表达，从而产生理想的微环境条件。既往采用的手段主要有毛细效应、微流控技术、角度的倾斜及离心分离技术等^[62]。天然生长因子发挥作用的机制、通过缓释技术如何控制组织工程肌腱复合物的修复^[63]、多种生长因子协同作用时其有序性如何解决等问题，均需要进一步深入研究。

因此在未来还需要不断研究腱-骨愈合的发育生物学原理和更多生物学机制，寻求更理想的支架材料，并充分利用细胞治疗领域研究成果，协同多种策略，从而使结构性、功能性组织工程的研究成为一种可行的临床治疗选择。

作者贡献：吕晶同负责查阅文献，文章撰写；施又兴、王云蛟、康夏、卞旭廷、袁宝、朱敏负责文章内各部分相关内容撰写；唐康来负责文章审核。

利益冲突：所有作者在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。基金项目经费支持没有影响文章观点。

Biography

唐康来，教授、主任医师、博士生导师，陆军军医大学（第三军医大学）第一附属医院骨科运动医学中心主任、陆军军医大学训练伤中心主任。国家人才推进计划-重点领域创新团队首席专家、国家“万人计划”领军人才、国家重点研发计划首席科学家，国务院政府津贴获得专家，军队科技创新领军人才、重庆市首批科技创新领军人才、重庆市首批医学领军人才、重庆市首席医学专家、重庆市学术技术带头人，中央军委保健委会诊专家等。担任中华医学会运动医疗分会足踝工作委员会主任委员、中国医师协会骨科医师分会足踝工作委员会主任委员等

Funding Statement

国家自然科学基金资助项目（8157090393）

National Natural Science Foundation of China (8157090393)