周围神经损伤后断端神经组织微小 RNA-221 和 PTEN 表达变化

Abstract

目的

研究大鼠坐骨神经损伤后近、远侧断端组织中微小 RNA-221（microRNA-221，miR-221）以及磷酸酶与张力蛋白同源物（phosphatase and tension protein homologue，PTEN）的表达情况，及其与周围神经损伤修复的相关性，以期为临床诊治周围神经损伤提供新靶点。

方法

取 SPF 级雄性 SD 大鼠 96 只建立坐骨神经损伤模型，分别于术后 0（术后即刻）、1、4、7 d 处死 24 只大鼠，无菌条件下取坐骨神经近、远侧断端组织。实时荧光定量 PCR 检测 miR-221 表达，Western blot、免疫荧光染色检测 PTEN 蛋白表达，采用双荧光素酶报告基因验证 miR-221 与 PTEN 的调控关系；同时结合透射电镜观察神经组织超微结构。

结果

实时荧光定量 PCR、Western blot 及免疫荧光染色检测示，术后大鼠坐骨神经近、远侧断端组织中 miR-221 相对表达量均逐渐增加，PTEN 蛋白相对表达量均逐渐减少，术后各时间点间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。术后 1、4、7 d 近侧断端 miR-221 相对表达量均显著高于远侧断端，PTEN 蛋白相对表达量均显著低于远侧断端，差异均有统计学意义（P<0.05）。双荧光素酶报告基因示 PTEN 为 miR-221 作用靶点。透射电镜观察示随术后时间延长，雪旺细胞增殖及轴突、髓鞘溃变逐渐增加；术后 1 d 近、远侧断端无明显差异，4、7 d 时近侧断端雪旺细胞增殖较远侧断端增多，轴突、髓鞘溃变程度降低。

结论

大鼠坐骨神经损伤后，miR-221 表达上调，靶向调控 PTEN 表达降低，进而产生近、远侧断端 miR-221 及 PTEN 表达差异，这一现象可能对促进周围神经损伤后修复发挥一定作用。

周围神经损伤（peripheral nerve injury，PNI）后经典的修复过程是神经远侧断端瓦勒变性溶解消失，重新由近侧断端向远处生长出整个远侧神经^[1-4]。大量研究证明，磷酸酶与张力蛋白同源物（phosphatase and tension protein homologue，PTEN）在 PNI 后的修复中起重要作用，其蛋白表达量降低可以促进轴突及髓鞘再生^[5-7]。近年来，微小 RNA（microRNA，miRNA）因在各种生物学功能中的调节作用引起了极大关注。有研究证实，在多种肿瘤细胞中，miR-221 对 PTEN 具有调控作用^[8-10]，其通过与 PTEN mRNA 3′端非翻译区（3′UTR）互补结合来抑制 PTEN 磷酸水解酶表达，从而减弱 PTEN 在控制细胞增殖、凋亡、转移与侵袭中的效能^[11]。然而，miR-221/PTEN 在 PNI 后修复中是否存在相关性未见报道。此外，PNI 后修复受到神经远侧断端发出的信号调控^[12-13]，这种不对称修复现象使轴突再生由神经近侧断端向远侧断端生长^[14]，miR-221/PTEN 在近、远侧断端表达变化是否存在差异尚未明确。本实验中，我们旨在研究 miR-221 与 PTEN 在 PNI 后修复中的表达及调控关系，比较近、远侧断端中二者表达差异，从而为临床诊治 PNI 提供新靶点。

1. 材料与方法

1.1. 实验动物、细胞及主要试剂、仪器

SPF 级雄性 SD 大鼠 96 只，体质量（200±20）g，由锦州医科大学实验动物中心提供，于光照和黑暗每 12 小时交替环境中标准饲养。293T 细胞（ATCC 细胞库，美国）。

FBS（Serapro 公司，美国）；DMEM 培养基、青/链霉素、胰蛋白酶（HyClone，美国）；Opti-MEM 培养基 (GIBCO 公司，美国)；兔抗鼠 PTEN 多克隆抗体（北京博奥森生物技术有限公司）；兔抗鼠 GAPDH 多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔 IgG 二抗（Earthox 公司，美国）；Alexa Fluor 647-结合羊抗兔二抗（Abcam 公司，英国）；牛血清白蛋白（Sigma 公司，美国）；蛋白提取试剂盒、BCA 蛋白定量试剂盒、SDS-PAGE 凝胶试剂盒、ECL 化学发光试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；蛋白 Marker、GeneJET^TMRNA 纯化试剂盒（Thermo Fisher 公司，美国）；GoScript^TM Reverse Transcription System 逆转录试剂盒、GoTaq^® qPCR Master Mix 试剂盒、Dual-Luciferase^® Reporter Assay System 试剂盒、pmirGLO Dual-Luciferase^® miRNA Target Expression Vector（Promega 公司，美国）；miR-221 模拟物（苏州吉玛基因股份有限公司）；Lipofectamine^TM 2000（Invitrogen 公司，美国）；QuikChange^® Lightning Site-Directed Mutagenesis Kits 试剂盒（Stratagene 公司，美国）；Gluta 固定液（Solarbio 公司，美国）。

显微外科手术器械（泗洪金睛医疗器械有限公司）；病理切片机、超薄切片机（Leica 公司，德国）；正置荧光显微镜（Nikon 公司，日本）；紫外分光光度计（Tecan 公司，美国）；全自动电泳仪、化学发光凝胶成像系统（Bio-Rad 公司，美国）；ABI stepone plus 实时荧光定量 PCR 仪（Applied Biosystems 公司，美国）；透射电镜（Hitachi 公司，日本）。

1.2. 细胞培养

取 293T 细胞采用含 10%FBS 的 DMEM 培养基培养，置于 37 ℃、5%CO₂ 细胞孵育箱中培养。

1.3. 大鼠坐骨神经损伤模型建立

取 96 只 SD 大鼠环境适应处理 12 h 后，100 g/L 水合氯醛（350 mg/kg）腹腔注射麻醉；麻醉后静置动物约 3 min，备皮后于右下肢股骨中段下缘 5 mm 处作平行于股骨的切口约 5 mm^[15]，组织钳钝性分离筋膜及肌间隙后，暴露坐骨神经，用显微外科剪离断坐骨神经，观察动物神经反射情况。逐层缝合后注射阿米卡星 0.1 mL 预防感染，切口包扎。待麻醉复苏后，观察动物运动恢复情况。分别于术后 0（术后即刻）、1、4、7 d，以麻醉后颈椎脱臼法分别处死 24 只大鼠，无菌条件下取坐骨神经近、远侧断端组织各 5 mm 进行以下观测。

1.4. 观测指标

1.4.1. 实时荧光定量PCR检测miR-221基因表达

于术后各时间点分别取 6 只大鼠坐骨神经近、远侧断端组织，液氮速冻后研磨成粉，用 RNA 纯化试剂盒过柱法提取组织总 RNA，经紫外分光光度计检测，测定吸光度（A）值（A₂₆₀/A₂₈₀ 值在 1.9～2.2 之间用于 cDNA 合成）。按照逆转录反应体系进行逆转录，所得 cDNA 在实时荧光定量反应体系下扩增，扩增 40 个循环。引物序列：miR-221 上游 5′-ATGCTCTAAGCTACATTGTCTGC-3′，下游 5′-TATGGTTGTTCTGCTCTCTGTCTC-3′；内参照 U6 上游 5′-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3′，下游 5′-TTCACGAATTTGCGTGTCATC-3′。采用 2^−ΔΔCt法计算 miR-221 相对表达量，实验重复 3 次，取均值。

1.4.2. Western blot检测PTEN蛋白表达

于术后各时间点分别取 6 只大鼠坐骨神经近、远侧断端组织，于冰上按 1 mg 神经组织∶20 μL RIPA 裂解液进行裂解，4 ℃ 冰浴匀浆 30 min 后，以离心半径 3 cm、12 000 r/min 离心 30 min，取上清液即为所需蛋白液。BCA 法蛋白定量后调整至同等浓度，每孔上样 30 μg，经 10%SDS-PAGE 凝胶电泳后转移至聚偏二氟乙烯膜，1% 牛血清白蛋白封闭 1 h；加入 TBST 稀释兔抗鼠 PTEN 多克隆抗体（1︰1 000）、兔抗鼠 GAPDH 多克隆抗体（1︰3 000），4 ℃ 孵育过夜；TBST 洗膜 3 次，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔 IgG 二抗（1︰10 000）室温孵育 2 h；TBST 洗膜 3 次，在暗室内行化学发光剂 ECL 反应，化学发光凝胶成像系统取像并测定条带灰度值。以 PTEN 蛋白条带和 GAPDH 内参条带灰度值的比值作为目的蛋白的相对表达量。

1.4.3. 双荧光素酶报告基因实验

通过 Targetscan、miRDB、Miranda 和 PicTar 等生物信息学软件预测 miR-221 靶向结合 PTEN 3′UTR 的位点进行分析。利用 PCR 扩增包含 miR-221 结合位点的 PTEN 3′UTR 序列，将其克隆到 pmirGLO 报告载体，构建野生型 pmirGLO-PTEN-WT 报告载体；用单点突变试剂盒突变 pmirGLO-PTEN-WT 上的 miR-221 结合位点，构建突变型 pmirGLO-PTEN-Mut 报告载体。取对数生长期 293T 细胞，以 1.5×10⁴个/孔接种于 96 孔板中。将 Opti-MEM 培养基稀释的野生型和突变型报告载体分别与 miR-221 模拟物（miR-221 mimic）或 miR-阴性对照（miR-NC）混合，混合后加入 Lipofectamine^TM 2000 试剂。将所得混合液分别与 Opti-MEM 培养基以 1∶1 比例加入 293T 细胞，其转染浓度报告载体为每孔 250 ng，miR-221 mimic 及 NC 为每孔 50 nmol/L 孔。培养 6 h 后再加 100 μL Opti-MEM 培养基，48 h 后用 Dual-Luciferase^® Reporter Assay System 试剂盒检测各组细胞萤火虫荧光酶荧光值（M1）及海肾荧光素酶荧光值（M2），以 M1/M2 比值作为相对荧光值。

1.4.4. 免疫荧光染色观察PTEN蛋白表达

于术后各时间点分别取 6 只大鼠坐骨神经近、远侧断端组织，于 4% 多聚甲醛固定 24 h，行脱水、石蜡包埋、切片等处理，常规行抗原修复、山羊血清封闭后，滴加兔抗鼠 PTEN 多克隆抗体（1∶400）4 ℃ 孵育过夜；置于摇床 PBS 洗涤 3 次，Alexa Fluor 647-结合羊抗兔二抗（1∶500）避光室温孵育 30 min；DAPI 染液处理后，洗涤并用抗荧光淬灭封片剂封片，正置荧光显微镜下观察 PTEN 蛋白在神经断端横截面上的分布。取 100 倍镜下单个神经横截面视野，应用 Image-Pro Plus 6.0 软件分析其平均吸光度（IA）值作为 PTEN 蛋白相对表达量。

1.4.5. 透射电镜观察

于术后各时间点分别取 6 只大鼠坐骨神经近、远侧断端组织，取 1 mm×1 mm×1 mm 神经组织，Gluta 固定液固定 1～4 h，再用 1% 锇酸-0.1 mol/L PBS 室温固定 2 h，脱水、渗透、包埋后制作厚 60 nm 超薄切片，经铀铅双染色后透射电镜观察神经轴突、髓鞘等超微结构的形态学变化。

1.5. 统计学方法

采用 SPSS19.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，同侧断端各时间点间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 Bonferroni 法；左、右侧断端同一时间点间比较采用独立样本 t 检验；双荧光素酶报告基因实验组间比较采用 Dunnett’s t 检验；检验水准 α=0.05。

2. 结果

2.1. 实时荧光定量PCR检测miR-221表达

随时间延长，大鼠坐骨神经近、远侧断端组织中 miR-221 相对表达量均逐渐增加，术后各时间点间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。术后 1、4、7 d 近侧断端组织中 miR-221 相对表达量均显著高于远侧断端，差异有统计学意义（P<0.05）。见图1。

图 1.

The relative expression of miR-221 in the proximal and distal stumps at different time points after operation by real-time fluorescent quantitative PCR

实时荧光定量PCR检测术后各时间点大鼠坐骨神经 近、远侧断端组织中miR-221相对表达量

2.2. Western blot检测PTEN蛋白表达

随时间延长，大鼠坐骨神经近、远侧断端组织中 PTEN 蛋白相对表达量均逐渐减少，术后各时间点间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。术后 1、4、7 d 近侧断端组织中 PTEN 蛋白相对表达量均显著低于远侧断端，差异有统计学意义（P<0.05）。见图2。

图 2.

The expression of PTEN protein in the proximal and distal stumps at different time points after operation detected by Western blot

Western blot检测术后各时间点大鼠坐骨神经近、远侧断端组织中PTEN蛋白表达

Mr：相对分子质量　1：0 d　2：1 d　3：4 d　4：7 d　a. 近侧断端蛋白条带图；b. 远侧断端蛋白条带图；c. PTEN 蛋白相对表达量

Mr: Relative molecular mass 1: 0 day 2: 1 day 3: 4 days 4: 7 days; a. Protein bands of the proximal stump; b. Protein bands of the distal stump; c. Relative expression of PTEN protein

2.3. 双荧光素酶报告基因实验

生物信息预测结果表明，miR-221 序列上存在 PTEN 的连续结合序列，见表1。通过构建野生型和突变型报告载体，双荧光素酶报告基因实验发现，与 miR-NC（1.003±0.009）相比，miR-221 mimic 与野生型报告载体共转染时显著降低了荧光素酶相对活性（0.402±0.045），差异有统计学意义（t=15.78，P=0.00）；而与突变型报告载体共转染时恢复了荧光素酶相对活性（0.972±0.021），差异无统计学意义（t=1.86，P=0.14）。

表 1.

Complementation and combination of miR-221 and PTEN 3′UTR

miR-221和PTEN的3′UTR互补结合

基因 Gene	序列 Sequence	位置 Position
miR-221	3′-GUGGGUCCAUCGGUCUACACAUCGAC-5′
PTEN 3′UTR WT	5′-GACCCACGCGGCGGGAGGACAAGCUC-3′	689～710
PTEN 3′UTR Mut	5′-GACCCACGCGGCGGGAGGACACGCUC-3′

2.4. 免疫荧光染色观察PTEN蛋白表达

荧光显微镜观察示，PTEN 蛋白主要表达于细胞质，部分细胞核中也有少许表达。随神经损伤后修复时间的延长，PTEN 阳性表达明显减少，其亚细胞定位无明显变化。见图3。

图 3.

Immunofluorescence staining observation of the expression of PTEN protein in the proximal and distal stumps at different time points after operation (Fluorescence microscopy×100)

免疫荧光染色观察术后各时间点坐骨神经近、远侧断端组织中PTEN蛋白表达（荧光显微镜×100）

从左至右依次为术后 0、1、4、7 d　a. 近侧断端；b. 远侧断端

From left to right for postoperative views at 0, 1, 4, and 7 days, respectively　a. Proximal stump; b. Distal stump

定量检测示随时间延长，大鼠坐骨神经近、远侧断端组织 IA 值均逐渐减小，术后各时间点间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。术后 1、4、7 d 远侧断端组织IA 值均显著高于近侧断端，差异有统计学意义（P<0.05）。见图4。

图 4.

Detection of the IA value in the proximal and distal stumps at different time points after operation by immuno fluorescence staining

免疫荧光染色检测术后各时间点坐骨神经近、远侧断端 组织IA值

2.5. 透射电镜观察

术后 0 d，近、远侧断端正常轴突、髓鞘等超微结构形态规整、结构清晰，无病理改变。术后 1 d，近、远侧断端雪旺细胞增殖及溃变均不明显，髓鞘整体形态结构与术后 0 d 接近，但髓鞘板层略有疏松，鞘内轴浆颗粒消失。术后 4 d，雪旺细胞较 0 d 时明显增殖旺盛，呈较明显神经溃变，近、远侧断端可见大量微管及微丝崩解，线粒体肿胀，髓鞘开始破坏，髓鞘内板层结构模糊，间隙增宽、松散，形态不规则；与远侧断端相比，近侧断端雪旺细胞分裂、增殖更明显，且轴突、髓鞘破坏程度更小。术后 7 d，已无完整髓鞘结构，雪旺细胞迁移引导轴突再生，近、远侧断端神经溃变达到高峰，且远侧断端神经溃变较近侧断端更彻底；近侧断端可见少数再生轴突已被雪旺细胞包绕，以及少数新生神经纤维及未成熟的新生髓鞘。见图5。

图 5.

Ultrastructure of the proximal and distal stumps at different time points after operation observed by transmission electron microscopy (×2 000)

透射电镜观察术后各时间点坐骨神经近、远侧断端超微结构（×2 000）

从左至右分别为术后 0、1、4、7 d　a. 近侧断端；b. 远侧断端

From left to right for postoperative views at 0, 1, 4, and 7 days, respectively　a. Proximal stump; b. Distal stump

3. 讨论

神经损伤，特别是中枢神经损伤难以再生，但 PNI 后神经元固有的再生能力被激活，促进再生微环境的形成，从而使神经断端轴突及髓鞘再生，这一现象主要与雪旺细胞等的作用有关^{[5, 16]}。雪旺细胞作为周围神经特有的且最重要的胶质细胞，在神经损伤早期激化并大量增殖，参与近、远侧断端一系列特异性改变，对 PNI 后修复过程具有决定性影响^[17-20]。目前研究发现，PNI 后内源基因 PTEN 的活性受到 PI3K/Akt/mTOR 信号转导途径的负调控，并参与调节损伤产生的炎症与免疫反应，影响雪旺细胞的迁移、增殖和分化，进而促进轴突、髓鞘再生等过程^[21-22]。随着基因芯片技术用于 PNI 的治疗，miRNA 在调节真核基因表达中的作用变得尤为突出，这种平均 20～24 个核苷酸长度的非编码单链 RNA 主要通过与靶基因 3′UTR 以完全或不完全互补结合方式发挥作用，阻遏翻译过程或裂解靶 mRNA，抑制基因表达，实现对基因转录后表达的调控^[23]。

大量基因芯片研究表明，PNI 后的修复过程中，绝大多数上调或下调基因的表达会在 1 周和 3、4 周出现 2 个极值^[24]。本研究通过 PNI 后修复1 周内的 4 个不同时间点，对大鼠坐骨神经损伤后 miR-221 与 PTEN 之间是否存在相关性进行了探讨。通过实时荧光定量 PCR 和 Western blot 分别检测了近、远侧断端 miR-221 以及 PTEN 的相对表达量，发现随着神经损伤后时间增加，在神经断端中 miR-221 呈上调趋势，而 PTEN 呈显著下调趋势。为探究这一现象中二者关系，我们进行了双荧光素酶报告基因实验，结果显示 PTEN 为 miR-221 的作用靶点，进而阐明了二者在 PNI 中存在负相关，即 PNI 后内源基因 PTEN 降低与 miR-221 上调有密不可分的联系。

在此基础上，本研究进一步分析了 PNI 后二者在神经近、远侧断端中的表达量是否具有差异性。实时荧光定量 PCR、Western blot 检测结果示 miR-221 及 PTEN 相对表达量在神经近、远侧断端间存在着不同程度差异，随着神经损伤时间延长，二者在近侧断端变化幅度大于远侧断端，呈现的差异性趋势也逐渐增大。对于这一现象，我们从形态学进行了观察。通过免疫荧光染色在荧光显微镜下观察 PTEN 蛋白在神经断端横截面上的定位分布及其阳性表达，提示神经近、远侧断端存在的差异性。结合透射电镜形态学超微结构观察，从术后 4 d 开始，神经近侧断端中雪旺细胞的分裂、增殖程度明显大于远侧断端，且轴突、髓鞘的破坏程度小于远侧断端，至 7 d 时达峰值。这种损伤早期发生的轴突、髓鞘崩解，雪旺细胞增殖以及产生的近、远端修复差异性，阐述了 PNI 后的修复过程。对于神经近、远侧断端 miR-221 和 PTEN 表达差异的产生，我们认为可能与神经的不对称修复相关。远侧断端的轴突由于得不到胞体的营养支持，仅能存活数天，之后很快发生变性、解体；近侧断端的轴突和髓鞘虽可有同样变化，但溃变一般只到邻近断端的第 1 个侧支处中止，仅出现 1 个或几个郎飞结的变性^[25]。然而，神经元胞体是否存在对近侧断端的营养支持及其某些特定的信号调节等作用，使得 miR-221 与 PTEN 在神经近、远侧断端含量上存在差异性，均有待后续研究解决。

综上述，本研究结果显示 PNI 后的修复过程中 miR-221 表达上调靶向调控 PTEN 表达降低，从而产生近、远侧断端 miR-221 及 PTEN 表达差异，这一现象可能参与 PNI 后的一系列修复过程。但PNI 后的修复是一个多因素共同参与的复杂过程，具体机制有待进一步研究。

作者贡献：张臣鸣负责本研究具体实施、文章撰写等所有工作；李宇、张玉强参与实验模型构建、标本取材、实验检测、数据整理；曹宇、龚超、王晨亮参与动物饲养与管理、标本取材以及数据收集；王伟参与课题设计、组织以及指导。

利益冲突：作者声明，本课题研究和文章撰写过程中不存在任何利益冲突。基金项目经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。

机构伦理问题：本研究通过锦州医科大学动物伦理学委员会批准。所有实验大鼠符合国家一级动物标准，实验动物生产许可证号：SCXK-辽 2017-0003，使用许可证号：SYXK-辽 2014-0002。

Funding Statement

辽宁省自然科学基金面上项目（201602322）；辽宁省教育厅科学技术研究地方服务项目（JYTFUDF201757）

Natural Science Foundation of Liaoning Province (201602322); Liaoning Provincial Department of Education Science and Technology Research Local Services (JYTFUDF201757)